余桂東，余桂永，馬旭曉

（1.河南省南陽市宛城疾病預防控制中心結(jié)防科，河南 南陽473000；2.河南省南陽市西峽縣人民醫(yī)院腫瘤科，河南 南陽474550；3.河南省南陽市宛城疾病預防控制中心慢病科，河南 南陽 473000）

流行病學研究表明非小細胞肺癌 （NSCLC）的發(fā)病率可達848/10 萬人左右[1]，且致殘率、病死率均較高[2]。 早期診斷NSCLC，能為臨床診療尤其是手術(shù)治療提供契機。 微小RNA210（miRNA210）能夠通過影響癌基因的擴增速度， 加劇癌基因的轉(zhuǎn)錄活性， 最終促進腫瘤細胞的異常分裂和增殖[3]；微小RNA155（miRNA155）能夠?qū)Π┘毎麅?nèi)腫瘤蛋白的翻譯產(chǎn)生影響，加劇腫瘤信號通路的上調(diào)，影響到腫瘤細胞的浸潤和黏附過程[4]。 為揭示血清miRNA210、miRNA155 在NSCLC 患者中的表達情況， 本研究收集我院2016 年3 月至2018 年9 月間經(jīng)病理學檢查證實為NSCLC 的患者、 肺部良性病變患者以及健康人群的臨床資料，分析血清miRNA210、miRNA155 的表達情況及其診斷學價值，為NSCLC 的臨床診療提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016 年3 月至2018 年9 月間我院經(jīng)病理學檢查證實為NSCLC 的患者60 例作為NSCLC 組、肺部良性病變患者60 例作為良性組、60 例健康體檢對象作為對照組。 NSCLC 組，年齡44~75 歲，平均（57.0±9.6）歲；男性37 例、女性23 例。TNM 分期[6]：Ⅰ期14 例、Ⅱ期29 例、Ⅲ期15例、Ⅳ期2 例。 腫瘤分化程度：高分化14 例、中分化27 例、低分化19 例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37 例。腫瘤直徑大于等于3 cm 29 例、小于3 cm 31 例。 良性組，年齡44~75 歲，平均（56.1±9.0）歲；男性34 例、女性26 例；其中肺結(jié)核39 例、肺纖維瘤10 例、肺部炎性結(jié)節(jié)11 例。 對照組，年齡40~75 歲，平均（55.2±11.3）歲；男性32 例、女性28 例。 三組研究對象的年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 納入標準與排除標準 納入標準：（1）NSCLC組患者符合 《中華醫(yī)學會肺癌臨床診療指南》中NSCLC 診斷標準[6]；（2）患者經(jīng)胸部CT、MRI 及纖維支氣管鏡活檢證實；（3）術(shù)后均接受病理學檢查；（4）患者在檢查前無放化療及免疫治療史；（5）對照組為健康體檢志愿者；（6）均簽訂知情同意書自愿參與本次研究，并經(jīng)我院倫理委員會審核批準。 排除標準：（1） 患者合并機體其他系統(tǒng)或部位的腫瘤；（2）病理學資料缺失；（3）伴有風濕性疾病、免疫性疾病等。

1.3 檢測方法 采集研究對象清晨空腹靜脈血5 mL于抗凝管中，加入0.3 mL 氯仿，室溫下震蕩30 s，放置30 min， 取上層清亮液體1 mL 移入另一EP管，加入等體積的異丙嗪溶液，室溫放置30 min，1 000 r/min 離心10 min， 取沉淀物為RNA， 加入75%乙醇溶液1 mL，溶解后1 000 r/min 離心10 min，取上清液，加入20 μL DEPC 水計算RNA 濃度，單位為：μg/μL。 采用SuperScript Ⅳ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen SuperScript Ⅳ反轉(zhuǎn)錄酶購自賽默飛公司）進行cDNA 合成，以cDNA 為模板按qRT-PCR儀器及試劑盒（CISILE2018 高通量PCR 儀器購自常州福生生物技術(shù)有限公司， 試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司） 說明書進行反應合成miRNA210、miRNA155。反應條件：預變性94 ℃4 min，目的片段擴增94 ℃30 s，退火60 ℃1 min，延伸72 ℃30 s，共35 個循環(huán)。 miRNA210 引物序列：上游 5' -GACGTACTGTGGAAGT -3'， 下 游 5' -CGTCGCGACAAGACGTAGTCA-3'；β-actin 引 物序列：上游5'-CGAGCCGATCGCAGAGCGC-3'，下游5'-GCATAACATGCGTCTGTGAT-3'。miRNA155引物序列： 上游5'-GTCCATCAGTGGTAGT-3'，下游5'-CCAAGTCAGATGTCCAAGACTTG-3'。 βactin 引物序列：上游5'-CTTACGCAACTGAGTCCCC-3'， 下游5'-ATCTGACTAGTGACTATCAT-3'。以β-actin 為內(nèi)參，2－△△Ct法分別計算miRNA210和miRNA155 相對表達強度。

1.4 統(tǒng)計處理方法 采用SPSS 21.0 版本統(tǒng)計學軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用（±s）來描述，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及兩兩比較的LSD-t檢驗；計數(shù)資料用（%）表示，采用χ2檢驗；繪制ROC曲線分析血清miRNA210、miRNA155 表達水平單獨及聯(lián)合應用對NSCLC 與肺部良性病變的鑒別診斷效能。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組研究對象血清miRNA210、miRNA155 水平比較 經(jīng)單因素方差分析，三組血清miRNA210、miRNA155 水平差異均有統(tǒng)計學意義 （P<0.05）。NSCLC 組患者血清miRNA210、miRNA155 水平顯著高于良性組和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）； 良 性 組 和 對 照 組 血 清miRNA210、miRNA155 水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 見表1。

表1 三組研究對象的血清miRNA210、miRNA155水平比較（±s，相對表達強度）

表1 三組研究對象的血清miRNA210、miRNA155水平比較（±s，相對表達強度）

注：與NSCLC 組比較，*P<0.05。

組別NSCLC 組良性組對照組n miRNA210 60 60 60 F P 1.741±0.528 1.008±0.394*1.001±0.280*63.518<0.001 miRNA155 5.205±1.810 1.962±0.774*1.881±0.559*154.544<0.001

2.2 血清miRNA210、miRNA155 水平與NSCLC 病理特征的關(guān)系 不同TNM 分期、 有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者血清miRNA-210 水平差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），不同TNM 分期的NSCLC 患者血清miRNA-155 水平差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；見表2。

表2 血清miRNA210、miRNA155 水平與NSCLC 病理特征的關(guān)系（±s，相對表達強度）

表2 血清miRNA210、miRNA155 水平與NSCLC 病理特征的關(guān)系（±s，相對表達強度）

因素TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期Ⅲ期+Ⅳ期病理學類型鱗癌腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移n miRNA210 t P miRNA155 t P 4.616<0.001 3.260 0.002 43 17 1.551±0.516 2.188±0.377 4.782±1.735 6.390±1.687 0.350 0.728 0.438 0.663 12 48 1.712±0.471 1.767±0.491 5.101±1.700 5.351±1.784 2.912 0.005 0.484 0.630是否37 23 1.901±0.500 1.519±0.484 5.361±1.790 5.144±1.511分化程度高分化+中分化低分化41 19 1.719±0.512 1.820±0.477 0.726 0.471 5.115±1.765 5.430±1.531 0.669 0.506

2.3 血清miRNA210、miRNA155 單獨及聯(lián)合應用鑒別診斷NSCLC 與肺部良性病變的價值ROC曲線分析結(jié)果顯示， 血清miRNA210、miRNA155 單獨檢測對NSCLC 與肺部良性病變均具有較好的鑒別診斷價值（AUC＞0.7），miRNA210 的靈敏度略高于miRNA155，而特異度略低于miRNA155；血清miRNA210、miRNA155 聯(lián)合應用鑒別診斷NSCLC與肺部良性病變的AUC明顯高于二者單獨檢測，且靈敏度、特異度均高于單獨檢測；見表3、圖1。

圖1 血清miRNA210、miRNA155 水平單獨及聯(lián)合應用鑒別診斷NSCLC 與肺部良性病變的ROC

表3 血清miRNA210、miRNA155 單獨及聯(lián)合應用鑒別診斷NSCLC 與肺部良性病變的價值

3 討論

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，NSCLC 患者術(shù)后無瘤生存時間及總體生存時間均較短，5 年生存率也較低[7]。而多數(shù)NSCLC 患者往往在診斷時，已處于中晚期，常已錯過進行根治性手術(shù)的最佳時機。 因此，NSCLC的早期診斷可能對提高臨床療效、 延長生存時間具有重要意義，也是目前臨床研究的重點和難點。影像學檢查對NSCLC 具有一定的診斷價值， 但其對早期肺癌或者微小浸潤癌的篩查效果并不理想。 癌胚抗原、糖鏈蛋白199 等腫瘤標志物，對呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤具有一定的診斷價值， 但其對NSCLC 診斷的靈敏度、特異度均較低，存在明顯的局限[8-9]。 微小RNA 的改變，能夠在自身免疫性疾病、炎癥反應及惡性腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮作用，其可通過對癌基因激活調(diào)控、 腫瘤蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯和腫瘤信號通路的影響， 最終提高癌細胞的DNA 分裂水平[10-12]。 本研究通過對NSCLC 患者血清不同微小RNA 水平進行分析研究， 旨在為NSCLC 的早期診斷提供新的研究方向和臨床參考。

miRNA210 能夠提高癌細胞的偽足形成風險，促進肺泡上皮細胞的遷移和浸潤能力；miRNA155是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控成員， 其通過對轉(zhuǎn)錄上游啟動子活性的影響，加快腫瘤細胞骨架蛋白的合成速度[13-14]。miRNA210、miRNA155 的高表達，能在腫瘤細胞生物學行為改變、 癌細胞內(nèi)第二信使激活或者腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換等方面發(fā)揮作用，最終增加早期肺泡上皮細胞異常分裂的風險， 促進中晚期肺癌細胞的轉(zhuǎn)移和浸潤[15]。 有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血清miRNA210 基因的表達擴增水平可上升40%以上， 而癌細胞轉(zhuǎn)移風險較高或者肺部多發(fā)轉(zhuǎn)移的患者， 血清miRNA210 基因的擴增水平常進一步上升[16-17]。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同TNM 分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC 患者血清miRNA210 表達，以及不同TNM 分期NSCLC 患者血清miRNA155 表達均存在顯著差異（P＜0.05），與以往的研究結(jié)論類似， 提示血清miRNA210、miRNA155 表達與NSCLC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。 分析原因可能與miRNA210、miRNA155 可能作為致癌基因參與并促進NSCLC 血管生成和腫瘤的生長轉(zhuǎn)移，而miRNA210 也可能通過調(diào)節(jié)微環(huán)境下腫瘤細胞呼吸功能，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[18-19]。

本研究進一步通過繪制ROC曲線對血清miRNA210、miRNA155 對NSCLC 的診斷臨界值及診斷效能參數(shù)進行定量分析，結(jié)果顯示，血清miRNA210、miRNA155 單 獨 檢 測 對NSCLC 與 肺 部 良性病變均具有較高的鑒別診斷價值 （AUC＞0.7），miRNA210 鑒別診斷的靈敏度較高，而miRNA155鑒別診斷的特異度高。 二者聯(lián)合檢測鑒別診斷NSCLC 和肺部良性病變的AUC、靈敏度、特異度均較單獨檢測有不同程度提高， 提示血清miRNA210、miRNA155 聯(lián)合檢測有利于提高NSCLC的臨床診斷效能， 降低漏診率和誤診率， 提高了NSCLC 診斷的科學性。

綜上所述，NSCLC 患者血清miRNA210、miRNA155 表達明顯升高， 且與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定的相關(guān)性，血清miRNA210、miRNA155定量檢測對NSCLC 診斷具有一定的臨床價值，而二者聯(lián)合檢測能進一步提高NSCLC 的臨床診斷效能。