許珂，畢曉英，趙艷曉，王丹丹

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心，河南 鄭州 450000）

多囊卵巢綜合征（Polycystic ovarian syndrome,PCOS） 是一種以排卵障礙和高雄激素血癥為特征的女性生殖內(nèi)分泌及代謝異常疾病[1]，患者可出現(xiàn)卵巢增大、白膜增厚、多個(gè)不同發(fā)育階段的卵泡，并伴有顆粒細(xì)胞黃素化[2]。 PCOS 的確切發(fā)病機(jī)制尚未明確， 目前普遍認(rèn)為其臨床表現(xiàn)及生化特征的復(fù)雜性和多樣性， 與卵巢顆粒細(xì)胞增殖引起的內(nèi)在異常密切相關(guān)[3-4]。 微小核糖核酸（microRNAs,miRNAs） 是一類在物種進(jìn)化中相對(duì)保守的單鏈非編碼小分子RNA， 其組織特異性和時(shí)序性可決定組織和細(xì)胞的功能特異性， 在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)中具有重要作用[5]。 既往研究顯示，PCOS患者體內(nèi)miRNAs 的異常表達(dá)與顆粒細(xì)胞（Granulosa cells, GCs）生長(zhǎng)、增殖和分化有關(guān)，miRNAs 表達(dá)涉及生理和病理變化， 可作為監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的理想標(biāo)志[6]。 本研究主要探討分析PCOS 患者顆粒細(xì)胞miR-3135b 的表達(dá)及臨床意義，旨在為PCOS發(fā)病機(jī)制的研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年1 月至2021 年1 月河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治的92 例因PCOS 導(dǎo)致不孕患者納入PCOS 組，年齡25~45 歲，平均（31.29±2.41）歲，平均體質(zhì)量指數(shù)（Body mass index,BMI）為（23.95±2.13） kg/m2。 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞18 歲；（2）符合PCOS 診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]（符合以下三項(xiàng)中兩項(xiàng)即可確診：①稀發(fā)排卵或無(wú)排卵；②出現(xiàn)多毛、痤瘡等高雄激素臨床表現(xiàn)；③B 超檢查結(jié)果顯示卵巢出現(xiàn)多囊樣改變）（3）近3 個(gè)月內(nèi)未接受激素治療者。 排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能不全及其他免疫性相關(guān)性疾病者；（2）合并高血壓、糖尿病者；（3）合并凝血功能障礙、甲狀腺功能亢進(jìn)者；（4） 入組前3 個(gè)月內(nèi)有手術(shù)史者；（5）合并子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管積水者；（6）既往有異常流產(chǎn)史或胎兒發(fā)育異常史者；（7）合并惡性腫瘤或心理、精神疾病者。 選取92 例同期于本院因輸卵管或男方不育等原因?qū)е虏辉谢颊呒{入對(duì)照組，年齡26~45 歲，平均（31.75±2.26）歲，平均BMI 為（23.69±2.07） kg/m2，兩組患者年齡、BMI 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)通過(guò)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 儀器與試劑 主要儀器實(shí)時(shí)定量PCR 儀(CFX96 型，美國(guó)Bio-Rad 公司)，電泳儀(CPC-300型，上海百賽生物技術(shù)股份有限公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD 型， 上海艾研生物科技有限公司)，分光光度計(jì)（NANO Drop 2000）；主要試劑：TRIzol Reagent 試劑盒(上海雙達(dá)生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)，實(shí)時(shí)PCR 試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)，DNA Marker (上海韻泰信息科技有限公司)，RNA Marker(北京澤平科技有限責(zé)任公司)。

1.2.2 GCs 收集[8]于患者排卵日，在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺抽吸卵泡，選取直徑≥16 mm。操作步驟：（1）用針?lè)蛛x單個(gè)卵母細(xì)胞周圍的GCs，取出卵丘卵母復(fù)合體，并收集剩余的卵泡液；（2）卵泡液離心后，棄上清，剩余沉淀物加透明質(zhì)酸鈉1 mL 充分混勻，水浴后移至無(wú)菌離心管，加入4 mL 淋巴細(xì)胞分離液后離心；（3） 取離心后GCs 至離心管內(nèi)，接種于全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，置于37 ℃5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；（4） 將培養(yǎng)的GCs 細(xì)胞收集后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法 （Real-Time quantitative polymerase chain reaction, qRTPCR） 檢測(cè)miR-3135b 的表達(dá) 采用Trizol 試劑抽提GCs 中總RNA， 使用分光光度計(jì)于260 nm 和280 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定所有樣品中A260 /A280，并計(jì)算所有RNA 的濃度和純度。 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)產(chǎn)物稀釋后作為qRTPCR 模板。 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測(cè)PCOS患者GCs 中miR-3135b 的表達(dá)，反應(yīng)條件如下: 95℃預(yù)變熱10 min、95 ℃15 s、55℃20 s、70 ℃20 s，如此循環(huán)40 次。以U6 為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。用2－△△CT方法計(jì)算miR-3135b 的相對(duì)表達(dá)量，對(duì)比兩組患者顆粒細(xì)胞miR-3135b 的表達(dá)。 文中所用引物序列均由華大基因設(shè)計(jì)。 所有步驟均嚴(yán)格按照各儀器及試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

表1 引物序列

1.3 觀察指標(biāo) 記錄兩組患者年齡、 不孕年限、BMI、空腹血糖（Fasting blood glucose, FBG）、LH、FSH、LH/FSH、E2、 T、P、 FINS、FBG、PRL 及初始卵泡、閉鎖卵泡、竇卵泡、過(guò)渡型初級(jí)卵泡、典型初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、獲卵數(shù)和胚胎形成率。 采用穩(wěn)態(tài)評(píng)估模型評(píng)價(jià)計(jì)算HOMA-IR，計(jì)算公式為HOMAIR=(FINS×FBG)/405。 胰 島 素 抵 抗 評(píng) 定 標(biāo) 準(zhǔn)：HOMA-IR＞3.8。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 滿足正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料采用（±s）表示，采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)比較組間差異，用ROC分析miR-3135b 表達(dá)對(duì)PCOS 的診斷價(jià)值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料和臨床特征比較 兩組患者年齡、不孕年限、BMI 和FBG 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；PCOS 組患者LH、LH/FSH、P、T、FINS、HOMA-IR 和E2 均明顯高于對(duì)照組，F(xiàn)SH、PRL 則低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者一般資料和臨床特征比較（±s）

表2 兩組患者一般資料和臨床特征比較（±s）

指標(biāo) PCOS 組（n=92） 對(duì)照組（n=92） t P年齡（歲）不孕年限（年）BMI（kg/m2）FBG（mmol/L）FINS（pmol/L）HOMA-IR LH（U/L）FSH（U/L）LH/FSH PRL（nmol/L）P（nmol/L）T（nmol/L）E2（pmol/L）30.21±2.37 3.01±0.95 25.07±3.24 5.04±0.41 19.14±10.29 2.98±1.52 8.15±3.74 7.28±2.43 1.32±1.01 0.77±0.45 1.46±0.94 1.54±0.49 166.05±68.13 30.36±2.52 3.03±0.78 24.98±3.35 4.91±0.57 15.68±10.54 2.45±1.17 4.96±2.62 8.05±2.56 0.72±0.34 0.92±0.37 1.03±1.08 0.95±0.33 145.28±64.89 0.416 0.156 0.185 1.776 2.253 2.650 6.701 2.092 5.400 2.469 2.880 9.579 2.117 0.678 0.876 0.853 0.077 0.026 0.009＜0.001 0.038＜0.001 0.014 0.004＜0.001 0.036

2.2 兩組患者卵巢各級(jí)卵泡數(shù)及獲卵數(shù)、胚胎成型率比較 兩組患者初始卵泡、閉鎖卵泡數(shù)和胚胎形成率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PCOS 組過(guò)渡型初級(jí)卵泡、典型初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡數(shù)和獲卵數(shù)明顯高于對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見(jiàn)表3。

表3 兩組患者卵巢各級(jí)卵泡數(shù)及獲卵數(shù)、胚胎成型率比較（±s）

表3 兩組患者卵巢各級(jí)卵泡數(shù)及獲卵數(shù)、胚胎成型率比較（±s）

指標(biāo) PCOS 組（n=92） 對(duì)照組（n=92） t P初始卵泡過(guò)渡型初級(jí)卵泡典型初級(jí)卵泡次級(jí)卵泡竇卵泡數(shù)閉鎖卵泡數(shù)獲卵數(shù)胚胎形成率20.51±7.26 10.23±2.81 5.42±2.65 1.72±1.03 34.14±11.32 3.28±2.65 16.29±5.32 0.47±0.25 19.24±5.12 6.78±2.60 2.01±0.73 1.06±0.68 17.68±5.65 2.79±1.42 13.34±4.98 0.46±0.18 1.371 8.644 11.899 5.129 12.479 1.563 3.883 0.311 0.172＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.119＜0.001 0.756

2.3 GCs 中miR-3135b 的表達(dá) 采用qRT-PCR 檢測(cè)GCs 中miR-3135b 的表達(dá)水平， 結(jié)果顯示，PCOS 組中miR-3135b 表達(dá)量（1.92±1.08）顯著高于對(duì)照組 （1.02±0.33）， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。

2.4 miR-3135b 表達(dá)對(duì)PCOS 的診斷價(jià)值 根據(jù)2.3 結(jié)果，為測(cè)試miR-3135b 表達(dá)對(duì)PCOS 的診斷能力，建立了ROC曲線，結(jié)果顯示，miR-3135b 表達(dá)診斷PCOS 的AUC為0.750， 截?cái)嘀禐?.55，敏感度為58.7%，特異度為95.7%（P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-3135b 表達(dá)診斷PCOS 的ROC 曲線

3 討論

PCOS 是導(dǎo)致育齡期婦女無(wú)排卵性不孕的主要病因[9]，患者臨床主要表現(xiàn)為持續(xù)無(wú)排卵和高雄激素血癥，B 超檢查可見(jiàn)卵巢呈現(xiàn)多囊樣改變[10]。無(wú)排卵性不孕的主要原因?yàn)槁雅莅l(fā)育障礙， 導(dǎo)致其發(fā)育停滯于竇狀卵泡階段，無(wú)法進(jìn)行有效排卵[11]。近年來(lái)有研究表明， 在細(xì)胞各功能中起重要作用的miRNA 參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，被作為各種疾病的診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物在臨床中廣泛應(yīng)用[12]。 本研究主要探討PCOS 患者GCs 中miR-3135b 的表達(dá)，并分析其臨床意義。

本研究對(duì)PCOS 導(dǎo)致不孕患者與因輸卵管或男方不育等原因?qū)е虏辉谢颊叩囊话阗Y料和臨床特征進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示兩組在LH、LH/FSH、P、T、FINS、HOMA-IR、E2、FSH 和PRL 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 其中，LH 和LH/FSH 顯著說(shuō)明PCOS 患者出現(xiàn)促性腺激素功能失調(diào)，T 水平升高提示高雄激素血癥， 而FINS、HOMA-IR 升高則說(shuō)明PCOS 患者出現(xiàn)高胰島素血癥和胰島素抵抗， 這與孫守萍等[13]研究結(jié)果基本一致，證實(shí)了PCOS 具有高雄激素血癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗和促性腺激素功能失調(diào)等生化特征。 本研究中，兩組患者初始卵泡、閉鎖卵泡數(shù)和胚胎形成率無(wú)顯著差異，與對(duì)照組比，PCOS 組過(guò)渡型初級(jí)卵泡、典型初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡數(shù)和獲卵數(shù)明顯增多，說(shuō)明PCOS患者早期初級(jí)卵泡、 次級(jí)卵泡和竇卵泡數(shù)呈現(xiàn)增多趨勢(shì)，與Pedroso[14]實(shí)驗(yàn)結(jié)論基本一致，但Pedroso發(fā)現(xiàn)PCOS 患者卵泡刺激素顯著降低，分析其原因可能與PCOS 引起的卵巢功能障礙有關(guān)。

本研究采用qRT-PCR 檢測(cè)miR-3135b 在PCOS 患者GCs 中的表達(dá)，結(jié)果顯示其表達(dá)與在對(duì)照組患者中的表達(dá)存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， 與非PCOS 的對(duì)照組患者比較，PCOS 組中miR-3135b表達(dá)上調(diào)， 其表達(dá)量顯著高于對(duì)照組患者， 提示miR-3135b 可能在PCOS 發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。 卵巢GCs 是由原始卵泡中扁平卵泡細(xì)胞增殖形成的柱狀多層顆粒細(xì)胞， 在成熟卵泡時(shí)期停止增殖，可傳遞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素，在卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15-16]。 卵泡發(fā)育異常是導(dǎo)致患者不孕不育，甚至自發(fā)性流產(chǎn)的主要原因[17]。有研究顯示，卵巢GCs 中的miRNAs 以轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式參與生殖過(guò)程的調(diào)節(jié)，并調(diào)控激素合成，其異常表達(dá)與卵泡生長(zhǎng)、發(fā)育關(guān)系密切[18]。 miR-3135b 可能通過(guò)降低增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)， 達(dá)到抑制卵巢GCs 增生的目的。 miRNAs 對(duì)卵巢GCs 中E2、P 和T 等激素的分泌也有抑制作用， 可進(jìn)一步影響卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)展[19]。 本研究結(jié)果證實(shí)，PCOS 患者GCs中miR-3135b 呈現(xiàn)高表達(dá)，Wang Y[20]的研究發(fā)現(xiàn)，PCOS 患者存在多種miRNAs 的差異表達(dá)， 其中miR-3135b 在PCOS 患者的GCs 中呈現(xiàn)更高的表達(dá)，可提高對(duì)PCOS 的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，這與本研究結(jié)論基本一致。 本研究采用ROC曲線分析了miR-3135b 表達(dá)對(duì)PCOS 的診斷價(jià)值， 結(jié)果顯示miR-3135b 表達(dá)診斷PCOS 的AUC為0.750， 說(shuō) 明miR-3135b 表達(dá)具有較好的PCOS 診斷價(jià)值。

綜上所述，miR-3135b 在PCOS 患者GCs 中呈現(xiàn)高表達(dá)，在卵泡發(fā)育障礙中發(fā)揮重要作用，且對(duì)PCOS 診斷具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。 本研究的不足之處在于未對(duì)與PCOS 患者卵泡發(fā)育相關(guān)的miR-3135b 信號(hào)通路進(jìn)行系統(tǒng)闡述，后續(xù)仍需加大樣本量進(jìn)行深入研究， 但本研究仍為臨床進(jìn)一步了解PCOS 的病理生理機(jī)制提供了新思路。