呂婷婷,王妍妍,2,張 越,2,孟祥宇,丁衛(wèi)健,彭代銀,2,王 雷,2,姚 亮,2,陳衛(wèi)東,2,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.省部共建安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 合肥 230012;3.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 亳州 233500)

炎癥是炎癥因子共同作用的結(jié)果,當(dāng)機(jī)體受到刺激因子侵襲時(shí),免疫系統(tǒng)會(huì)發(fā)生一系列反應(yīng),產(chǎn)生血管充血擴(kuò)張、毛細(xì)血管通透性增加的反應(yīng),以稀釋炎癥部位刺激因子水平,并伴隨紅、腫、熱、痛等不適癥狀[1-2]?，F(xiàn)階段,非甾體抗炎藥多應(yīng)用于炎癥性疾病,但同時(shí)也伴有不良反應(yīng),不利于疾病的有效治療[3-4]。許多天然藥物具有較好的抗炎作用[5-8],且作用溫和,毒性小,無不良反應(yīng)[8]。因此,研究天然藥物中發(fā)揮抗炎作用的主要成分尤為重要。

茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf為多孔菌科真菌的干燥菌核[9],其主要活性成分為茯苓多糖和三萜。茯苓皮為加工茯苓片、茯苓塊時(shí)削下的褐色茯苓表皮。茯苓皮中主要活性成分是三萜類成分,其中三萜類物質(zhì)含量高于茯苓其他部位[10],具有利尿[11]、降血糖[12]、抗腫瘤[13]等藥理作用。課題組前期研究[14]發(fā)現(xiàn),茯苓總?cè)凭哂辛己玫目寡鬃饔?但茯苓皮中三萜成分的抗炎作用、三萜類化合物是否為治療炎癥的主要成分尚不明確。

茯苓皮三萜多見于粗提、萃取或分離單體成分的研究[15],存在富集三萜含量較少、制備工藝復(fù)雜等問題。因此,本研究以總?cè)坪繛橹笜?biāo),采用四因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化HPD-100型大孔樹脂純化茯苓皮總?cè)频墓に?并觀察茯苓皮總?cè)萍兓昂髮?duì)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型的抗炎作用。

1 材料

1.1 材料與試劑 茯苓皮由安徽省亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司提供,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為茯苓Poriacocos(Schw. )Wolf的外皮;香草醛(批號(hào) 210524Q)、冰醋酸(批號(hào) 20180810JN)、高氯酸(批號(hào) 20210613):上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司;水為超純水,其他試劑均為分析純;HPD-100型大孔吸附樹脂(批號(hào) 400-910-1997):金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司;LPS(批號(hào) S11060)、齊墩果酸(批號(hào) B20954,含量≥98%):上海源葉生物科技有限公司;吲哚美辛腸溶片(批號(hào) Y18M10C83262):山西省臨汾寶珠制藥有限公司;DMEM培養(yǎng)基(批號(hào) ATBRC):山東思科捷生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell count kit-8,CCK-8;批號(hào) 22082317):廣州賽國(guó)生物科技有限公司;胎牛血清(fetal bovine saline,FBS;批號(hào) 2177370):賽默飛生物制藥有限公司;一氧化氮(nitric oxide,NO)試劑盒(批號(hào) A013-2-1):南京建成生物工程研究所;白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)試劑盒(批號(hào) JL21070009)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)試劑盒(批號(hào) JL21070002)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒(批號(hào) JL21060011):武漢基因美科技有限公司。

1.2 儀器 紫外可見光光度計(jì)(型號(hào) UV-1900):上海元析儀器有限公司;低溫冷卻液循環(huán)泵(型號(hào) DLSB-10/20):鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;智能恒流泵(型號(hào) BT1-200V-LCD):上海琪特分析儀器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵[型號(hào) SHZ-D(Ⅲ)]:鄭州市儀特儀器有限公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(型號(hào) DF-101S):鞏義市予華儀器有限公司;酶標(biāo)分析儀(型號(hào) Rayto RT-6100):美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;CelMate二氧化碳培養(yǎng)箱(型號(hào) CLM-170B-8-NF):益世科(上海)企業(yè)發(fā)展有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器(型號(hào) YXQ-LS-100SII):上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

2 方法

2.1 茯苓皮總?cè)铺崛」に?按照文獻(xiàn)[16]的方法制備茯苓總?cè)?。稱取過40目篩的茯苓皮粉末50 g,置于圓底燒瓶中,加入1 L甲醇,于70 ℃水浴中回流6 h,提取2次,合并濾液,抽濾,60 ℃旋蒸至50～70 mL,轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中,于55 ℃烘箱烘干,得到粗提產(chǎn)物。粗提產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯萃取后得到乙酸乙酯部分。取適量茯苓皮總?cè)品勰?甲醇復(fù)溶,配制成一定濃度的樣品溶液。

2.2 香草醛—高氯酸法測(cè)定總?cè)坪?/p>

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 避光下精密稱取適量齊墩果酸粉末,甲醇溶解,得到0.1 mg/mL齊墩果酸對(duì)照品溶液。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取適量齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,水浴揮干,加5%香草醛—冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸1.0 mL,60 ℃水浴15 min,冷卻后加入冰醋酸5.0 mL,混勻,于450～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,選擇有最大紫外吸收的波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及方法學(xué)考察 分別取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL的0.1 mg/mL齊墩果酸對(duì)照品溶液于試管中,按“2.2.2”項(xiàng)下顯色方法,在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(optical density,OD)值,分析計(jì)算得回歸方程。經(jīng)方法學(xué)考察儀器精密度、方法準(zhǔn)確度、加樣回收率和樣品穩(wěn)定性。

2.2.4 總?cè)坪康臏y(cè)定 取茯苓皮總?cè)拼痔針悠啡芤?采用“2.2.2”項(xiàng)下顯色方法,于最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算三萜的百分含量。

2.3 茯苓皮總?cè)萍兓瘶悠返闹苽?選用HPD-100型大孔樹脂,用無水乙醇浸泡24 h。濕法裝柱后用95%乙醇洗滌樹脂,洗滌至層析柱流出液加水[V(流出液):V(水)=1∶5]時(shí)沒有白色渾濁,再用蒸餾水洗至流出液澄清且無醇味,樹脂層面上保持2～5 mm液體,以免干柱,備用。稱取經(jīng)過預(yù)處理好的HPD-100型大孔吸附樹脂,濕法裝柱,將120 mL茯苓皮總?cè)拼痔針悠啡芤和ㄟ^盛有大孔吸附樹脂的色譜柱,控制流速為1 mL/min。35%乙醇洗脫雜質(zhì),95%乙醇洗脫三萜類物質(zhì),收集洗脫液,于50 ℃烘箱烘干,即得茯苓皮總?cè)萍兓瘶悠贰?/p>

2.4 單因素與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)[17]的純化工藝,以產(chǎn)物中總?cè)坪繛橹笜?biāo),采用“2.3”項(xiàng)下方法,考察上柱的大孔樹脂質(zhì)量、上樣濃度、洗脫雜質(zhì)容積、洗脫總?cè)迫莘e對(duì)純化效果的影響,每個(gè)因素下不同水平實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

根據(jù)正交試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)4因素3水平[L9(34)]實(shí)驗(yàn)組合,見表1。根據(jù)純化產(chǎn)物的總?cè)坪窟M(jìn)行正交分析,確定純化茯苓皮總?cè)频墓に嚒?/p>

表1 L9(34)正交試驗(yàn)的因素水平表

2.5 純化工藝的重復(fù)性驗(yàn)證 為驗(yàn)證該純化工藝的穩(wěn)定性,本研究重復(fù)5次平行純化茯苓皮總?cè)?以考察本次工藝的重復(fù)性,確保每次純化所得茯苓皮總?cè)萍兓a(chǎn)物的總?cè)坪糠€(wěn)定。

2.6 富集總?cè)品椒ū容^ 為比較醇提法、萃取法、大孔樹脂吸附方法對(duì)富集茯苓皮總?cè)频挠绊?本研究采用醇提法獲取茯苓皮總?cè)拼继嵛锓勰⒁宜嵋阴ポ腿～@取茯苓皮總?cè)埔宜嵋阴ゲ糠?、?jīng)大孔樹脂純化工藝獲取總?cè)萍兓a(chǎn)物粉末,采用香草醛—高氯酸法對(duì)其進(jìn)行總?cè)坪繙y(cè)定,以初步對(duì)比以上方法富集茯苓皮總?cè)频男Ч?/p>

2.7 體外抗炎活性的驗(yàn)證

2.7.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS及1%青霉素—鏈霉素混合液)中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞狀態(tài),密度達(dá)80%～90%后傳代,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)后的細(xì)胞分為空白組、模型組(LPS組)、陽性對(duì)照(吲哚美辛)組、茯苓皮總?cè)拼痔峤M、茯苓皮總?cè)萍兓M。

2.7.2 CCK-8法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞存活率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞,用空白培養(yǎng)基稀釋混勻,制成細(xì)胞懸液,在37 ℃、5% CO2條件下孵育,至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至96孔板的80%左右時(shí),吸棄上清,每孔加入藥液100 μL,孵育24 h后棄去藥液,避光環(huán)境下根據(jù)公式[V(空白培養(yǎng)基)∶V(CCK-8)=1∶10]配置CCK-8反應(yīng)液,將其加入96孔板,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min,于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

2.7.3 建立炎癥細(xì)胞模型與給藥 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞,用空白培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞,得細(xì)胞懸液,在37 ℃、5% CO2條件下孵育,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至96孔板的80%左右時(shí),吸棄上清,每孔加入藥液100 μL,孵育24 h后棄去藥液,再加入1 μg/mL的LPS 100 μL于96孔板中,放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱刺激12 h,以復(fù)制炎癥細(xì)胞模型。

2.7.4 NO釋放量與細(xì)胞炎癥遞質(zhì)水平的測(cè)定 根據(jù)“3.3”項(xiàng)下操作方法,收集不同組分上清,按照NO、IL-1β、IL-6、TNF-α試劑盒說明書操作,測(cè)定NO釋放量和細(xì)胞炎癥遞質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

3 結(jié)果

3.1 總?cè)频暮繙y(cè)定與方法學(xué)考察 本實(shí)驗(yàn)采用香草醛—冰醋酸法測(cè)定產(chǎn)物的總?cè)坪?該法被廣泛用于測(cè)定化合物中總?cè)坪縖18-20]。經(jīng)顯色后掃描的最大OD值對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)為546 nm(見圖1),齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=11.18x-0.136 7(r=0.999 6),線性范圍為0.3～0.8 mg/mL。根據(jù)方法學(xué)考察結(jié)果,該法精密度良好,重復(fù)性高,且于反應(yīng)后90 min內(nèi)穩(wěn)定可行,平均加標(biāo)回收率為99.13%,以上結(jié)果均提示該法滿足樣品的分析要求。

圖1 齊墩果酸的檢測(cè)波長(zhǎng)和OD值關(guān)系

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

3.2.1 上柱大孔樹脂質(zhì)量對(duì)純化總?cè)频挠绊?大孔吸附樹脂具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具備選擇性好、吸附效果良好且解吸附簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜等諸多優(yōu)點(diǎn)[21]。如圖2所示,上柱大孔樹脂質(zhì)量增加,純化后三萜的百分含量呈上升趨勢(shì),因上柱25 g上柱大孔樹脂達(dá)上柱極限,故將上柱大孔樹脂質(zhì)量考察上限定于25 g,且25 g大孔樹脂與20 g大孔樹脂純化后所得產(chǎn)物總?cè)坪肯嘟?故20 g大孔樹脂符合資源的合理應(yīng)用。

圖2 上柱大孔樹脂質(zhì)量、上樣濃度、洗脫雜質(zhì)容積、洗脫三萜容積對(duì)純化茯苓皮總?cè)频挠绊?/p>

3.2.2 上樣濃度對(duì)純化總?cè)频挠绊?上樣濃度增加時(shí),供試液在15 mg/mL濃度時(shí)純化效果最佳,濃度過高可能導(dǎo)致樹脂吸附三萜成分呈過飽和狀態(tài),吸附不充分進(jìn)而導(dǎo)致純化后三萜含量下降,不利于樣品的有效利用。見圖2。

3.2.3 洗脫雜質(zhì)容積對(duì)純化總?cè)频挠绊?洗脫雜質(zhì)容積增大,得到的純化物總?cè)坪吭黾?尤其是洗脫雜質(zhì)容積為0～5 BV時(shí)。但過度洗脫雜質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致部分三萜損失,進(jìn)而導(dǎo)致純化產(chǎn)物總?cè)坪肯陆?。見圖2。

3.2.4 洗脫三萜容積對(duì)純化總?cè)频挠绊?隨著洗脫三萜容積的增加,純化物總?cè)坪砍噬仙厔?shì)。但過度洗脫可能會(huì)導(dǎo)致部分未完全洗去的雜質(zhì)流出,從而影響純化效果。見圖2。

3.3 正交試驗(yàn) 茯苓皮總?cè)萍兓Ч挠绊懸蛩匕从绊懗潭?全距)大小依次是洗脫雜質(zhì)容積、上樣濃度、洗脫三萜容積、上柱大孔樹脂質(zhì)量。改進(jìn)后茯苓皮總?cè)萍兓に嚍樯现罂讟渲|(zhì)量20 g,上樣濃度15 mg/mL,35%乙醇洗脫雜質(zhì)容積5 BV,95%乙醇洗脫三萜容積4 BV,所得純化物總?cè)坪繛?0.36%。見表2、表3、表4。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的描述性統(tǒng)計(jì)

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3.4 重復(fù)性驗(yàn)證 經(jīng)重復(fù)該工藝純化得到5份不同批次的茯苓皮總?cè)萍兓a(chǎn)物,經(jīng)“2.2.2”項(xiàng)下顯色方法測(cè)定純化后總?cè)坪?分別為70.36%、71.39%、67.83%、69.07%、66.19%,RSD為2.97%,提示該法重復(fù)性較好,純化產(chǎn)物總?cè)坪糠€(wěn)定。

3.5 富集總?cè)品椒ū容^ 經(jīng)對(duì)醇提法、萃取法、大孔樹脂吸附法獲取的茯苓皮總?cè)七M(jìn)行含量測(cè)定,其含量分別為29.97%、45.84%、70.36%,提示萃取法在一定程度上可富集茯苓皮中的總?cè)瞥煞?其中大孔樹脂吸附法富集總?cè)瞥煞肿罴选?/p>

3.6 體外抗炎活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

3.6.1 茯苓皮總?cè)茖?duì)細(xì)胞存活率的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果如圖3所示,各分組的細(xì)胞活力與空白組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示各分組濃度均無明顯的細(xì)胞毒性,故分組給藥濃度為50、150、250 μg/mL。

圖3 茯苓皮總?cè)茖?duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響

3.6.2 茯苓皮總?cè)茖?duì)細(xì)胞NO釋放量的影響 與空白組比較,模型組RAW 264.7細(xì)胞中NO濃度顯著增加(P<0.05)。與模型組比較,各給藥組RAW 264.7細(xì)胞中NO濃度均顯著降低(P<0.05)或呈降低趨勢(shì)(P>0.05),其中茯苓皮總?cè)萍兓M降低NO水平的效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。見圖4。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

3.6.3 茯苓皮總?cè)茖?duì)RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響 與空白組比較,模型組RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著增加(P<0.05);與模型組比較,各給藥組RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見圖5。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

4 討論

萜類物質(zhì)為許多中藥的主要活性成分,但存在提取含量低、種類復(fù)雜、不易分離等問題。本研究對(duì)醇提法、有機(jī)溶劑萃取法、大孔樹脂純化法提取茯苓皮中萜類物質(zhì)進(jìn)行了初步對(duì)比。結(jié)果表明,醇提法獲得總?cè)瞥煞值陌俜趾繛?9.97%,經(jīng)有機(jī)溶劑乙酸乙酯萃取后其總?cè)瓢俜趾扛患?5.84%,經(jīng)大孔樹脂純化后總?cè)坪靠蛇_(dá)70.36%。由此可見,大孔樹脂純化茯苓皮總?cè)剖且粋€(gè)切實(shí)可行的方法。

本研究以富含該成分較多的茯苓皮為研究對(duì)象進(jìn)行提取純化,建立一種HPD-100型大孔樹脂純化茯苓皮總?cè)频墓に?并通過體外實(shí)驗(yàn)對(duì)比其純化前后的抗炎活性。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,即上樣樹脂質(zhì)量、上柱大孔濃度、洗脫雜質(zhì)容積、洗脫三萜容積均對(duì)純化茯苓皮總?cè)频暮坑幸欢ㄓ绊?以純化后總?cè)坪繛橹笜?biāo),建立4因素3水平正交表,經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)獲取純化茯苓皮總?cè)频淖罴鸭兓瘲l件。根據(jù)文獻(xiàn)[17],改進(jìn)后的純化工藝為上柱樹脂質(zhì)量20 g,上樣濃度15 mg/mL,35%乙醇洗脫雜質(zhì)容積5 BV,95%乙醇洗脫三萜容積4 BV,茯苓皮總?cè)萍兓Ч绊懸蛩匕从绊懗潭却笮∨判蛞来问窍疵撾s質(zhì)容積、上樣濃度、洗脫三萜容積、上柱大孔樹脂質(zhì)量,得到化合物總?cè)坪繛?0.36%,較粗提制備的三萜含量提高40%,并且經(jīng)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該工藝純化總?cè)坪枯^穩(wěn)定。

LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞急性炎癥模型具有操作簡(jiǎn)易、模型穩(wěn)定、快速經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)[22]。炎癥遞質(zhì)NO參與炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)NO水平可能是發(fā)揮抗炎作用的重要途徑[23-26]。Bao等[27]依據(jù)三萜單體化合物抑制NO含量水平,篩選出發(fā)揮較好抗炎作用的單體成分,并依據(jù)其母核、官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的差異,探討其發(fā)揮抗炎效果的構(gòu)效關(guān)系。此外,也有許多研究[2,23,28]報(bào)道,以調(diào)節(jié)NO釋放量為參考,考察天然藥物的抗炎作用。

炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí),炎癥細(xì)胞可釋放出致炎因子,其生物標(biāo)志物為IL-1β、IL-6和TNF-α等[29-31],是研究藥物抗炎作用的常用指標(biāo)[23]。本研究通過建立細(xì)胞炎癥模型,測(cè)定細(xì)胞釋放的NO含量與炎癥因子水平,觀察粗提與純化的茯苓皮三萜抗炎作用。結(jié)果表明,粗提與純化的茯苓皮三萜能有效降低RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)NO含量與炎癥因子水平,純化后產(chǎn)物的抑制作用更明顯,這提示茯苓皮總?cè)剖前l(fā)揮抗炎作用的主要藥效成分。