劉 潔,王雨婷,李正龍,張文龍,許添陽,謝宜瑜,王清萍,陳 穎,吳冰雨,吳鴻飛

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012)

高脂血癥是一種脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致的疾病,其主要臨床表現(xiàn)為患者血清三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)升高或高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)降低[1],以TG的升高最為常見[2]。研究[3]表明,血清TG水平與心血管疾病死亡率之間存在劑量依賴關(guān)系,可作為診斷、預(yù)測心血管疾病的依據(jù)。肝臟的內(nèi)源性合成是TG的主要來源之一,肝臟膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)和碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrate responsive element-binding protein,ChREBP)是TG合成途徑中的重要調(diào)控因子,二者激活可促進脂肪酸合成相關(guān)酶乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)的表達,調(diào)節(jié)機體TG合成[4-5]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的重要因子,SIRT1/腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)通路是TG合成的關(guān)鍵信號通路。SIRT1可激活A(yù)MPK,抑制SREBP-1與ChREBP表達[6],降低TG合成酶,減少肝臟TG合成。

高脂血癥可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痰濕”“胸痹”等范疇[7]。瓜蔞薤白藥對載于《金匱要略》治療胸痹的瓜蔞薤白白酒湯、瓜蔞薤白半夏湯等方劑中,具有疏肝化痰、理氣降濁的功效。前期研究[9]表明,瓜蔞薤白化痰降濁功效與其調(diào)節(jié)脂質(zhì)水平密切相關(guān),顯著改善載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠肝臟代謝輪廓,減少肝臟TG蓄積。但瓜蔞薤白調(diào)節(jié)脂質(zhì)水平的具體機制尚未明確,本研究旨在考察瓜蔞薤白對高脂血癥小鼠肝臟TG合成酶、相關(guān)蛋白及SIRT1/AMPK通路的影響,從肝臟TG合成的角度闡明瓜蔞薤白調(diào)節(jié)脂質(zhì)水平的作用機制,為瓜蔞薤白治療脂質(zhì)代謝疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 超靈敏多功能成像儀(Amersham Imager 600):美國GE;多功能酶標儀(Multiskan Spectrum):德國賽默飛世爾科技公司;低溫離心機(H1750R):湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司;熒光定量PCR儀(MX3000P):美國安捷倫公司。

1.2 試劑 阿托伐他汀鈣分散片(200707):廣東百科制藥有限公司;瓜蔞(180601)、薤白(190201):合肥同仁堂大藥房;TC(20210119)、TG(20210120)、LDL-C(20210119)、HDL-C(20210119)試劑盒:南京建成生物工程研究所;FAS(21010001)、ACC(21010003)試劑盒:上海江萊生物公司;RNA提取試劑盒(AC0202)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AG0304-B)、熒光定量PCR試劑盒(AH0104-A):山東思科捷生物技術(shù)有限公司;SREBP-1抗體(bs-1402R):北京博奧森生物科技有限公司;ChREBP抗體(13256-1-AP):proteintech公司;SIRT1抗體(R25721):成都正能生物技術(shù)有限責任公司;AMPK抗體(PAB30970):武漢貝茵萊生物科技有限公司。

1.3 藥物 瓜蔞、薤白由安徽中醫(yī)藥大學(xué)韓榮春副教授鑒定,符合2015年版《中華人民共和國藥典》標準。參考課題組前期研究[10],稱取瓜蔞、薤白,按2∶1比例混合,充分粉碎,用50%乙醇(藥材體積5倍量)充分浸泡1 h,80 ℃回流提取2次,每次2 h。過濾提取物,合并濾液,減壓濃縮,制備含生藥質(zhì)量濃度為0.6 g/mL的瓜蔞薤白溶液。

1.4 實驗動物 40只ApoE-/-雄性小鼠、8只C57BL/6J小鼠,兩種小鼠均購自江蘇省常州卡文斯實驗動物有限公司[動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2016-0010]。本實驗獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(批準號:AHUCM-mouse-2020018)。

2 方法

2.1 動物分組與給藥 高脂飲食法復(fù)制小鼠高脂血癥模型。40只8周齡ApoE-/-雄性小鼠用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,高脂飼料喂養(yǎng)20周,隨機分為模型組,瓜蔞薤白低、中、高劑量組,阿托伐他汀組,每組8只;另設(shè)8只C57BL/6J小鼠為空白組。

空白組與模型組小鼠灌胃生理鹽水,根據(jù)課題組前期研究[8-9],瓜蔞薤白低劑量(每日3 g/kg,相當于成人臨床用量0.5倍)、中劑量(每日6 g/kg)、高劑量(每日12 g/kg)組小鼠分別給予相應(yīng)劑量瓜蔞薤白提取液灌胃,阿托伐他汀組小鼠灌胃阿托伐他汀鈣混懸液(每日10 mg/kg,相當于成人臨床用量)。所有小鼠均在同一環(huán)境、同一時間內(nèi)接受灌胃處理,于模型復(fù)制20周后給予相應(yīng)藥物4周。

2.2 酶法檢測血脂變化 末次給藥后,各組小鼠禁食不禁水12 h,摘眼球取血,于4 ℃條件下,2 500 r/min離心20 min,取上清液。按試劑盒說明書檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

2.3 ELISA法檢測肝臟FAS、ACC水平 取小鼠肝臟,按肝臟質(zhì)量(g)與生理鹽水容積(mL)1∶9的比例加入生理鹽水,研磨勻漿,于4 ℃條件下,3 000 r/min離心10 min,取上清液,按試劑盒說明書,于酶標儀450 nm波長處檢測FAS、ACC水平。

2.4 qRT-PCR法檢測肝臟FAS、ACC、SREBP-1、ChREBP、SIRT1、AMPK mRNA表達水平 采用組織RNA快速提取試劑盒提取肝臟RNA,檢測RNA濃度;取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進行擴增,反應(yīng)體系(10 μL)為cDNA模板1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL,2×SYBR試劑5 μL,ROX Reference Dye Ⅰ 0.2 μL,不含RNA酶的H2O 3.4 μL。擴增條件為94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán);以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計算各mRNA的相對表達量。引物由上海生工生物有限公司提供,各引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 Western blot法檢測SREBP-1、ChREBP、SIRT1、AMPK蛋白表達水平 取肝臟適量,RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度,加入上樣緩沖液,100 ℃煮沸10 min,-20 ℃儲存。取適量蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳,200 mA濕法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉37 ℃封閉,TBST漂洗,加入一抗SREBP-1(1∶2 000)、ChERBP(1∶2 000)、SIRT1(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)4 ℃孵育;TBST漂洗,加入二抗(1∶10 000),室溫孵育,TBST漂洗,ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色,超靈敏多功能成像儀檢測,采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics)進行灰度分析。

3 結(jié)果

3.1 6組小鼠血脂水平比較 與空白組比較,模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高(P<0.05),HDL-C水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,瓜蔞薤白低、中、高劑量組和阿托伐他汀組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著降低(P<0.05),HDL-C水平顯著升高(P<0.05)。見圖1。

注:A.空白組;B.模型組;C.瓜蔞薤白低劑量組;D.瓜蔞薤白中劑量組;E.瓜蔞薤白高劑量組;F.阿托伐他汀組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.2 6組小鼠肝臟TG合成酶含量比較 與空白組比較,模型組小鼠肝臟FAS和ACC含量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,瓜蔞薤白低、中、高劑量組和阿托伐他汀組小鼠肝臟FAS含量顯著降低(P<0.05),瓜蔞薤白高劑量組、阿托伐他汀組小鼠肝臟ACC含量顯著降低(P<0.05)。見圖2。

注:A.空白組;B.模型組;C.瓜蔞薤白低劑量組;D.瓜蔞薤白中劑量組;E.瓜蔞薤白高劑量組;F.阿托伐他汀組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.3 6組小鼠肝臟TG合成酶mRNA表達水平比較 與空白組比較,模型組小鼠肝臟FAS和ACC mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,瓜蔞薤白低、中、高劑量組和阿托伐他汀組小鼠肝臟FAS mRNA表達水平顯著降低(P<0.05),瓜蔞薤白高劑量組、阿托伐他汀組小鼠肝臟ACC mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖3。

3.4 6組小鼠肝臟TG合成酶調(diào)控蛋白表達水平比較 與空白組比較,模型組小鼠肝臟SREBP-1、ChREBP表達水平顯著增加(P<0.05);與模型組比較,瓜蔞薤白中、高劑量組和阿托伐他汀組小鼠肝臟SREBP-1、ChREBP表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖4。

注:A.空白組;B.模型組;C.瓜蔞薤白低劑量組;D.瓜蔞薤白中劑量組;E.瓜蔞薤白高劑量組;F.阿托伐他汀組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.5 6組小鼠肝臟TG合成酶調(diào)控蛋白SREBP-1、ChREBP mRNA表達水平比較 與空白組比較,模型組小鼠肝臟SREBP-1、ChREBP mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,瓜蔞薤白中、高劑量組和阿托伐他汀組小鼠肝臟SREBP-1、ChREBP mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖5。

注:A.空白組;B.模型組;C.瓜蔞薤白低劑量組;D.瓜蔞薤白中劑量組;E.瓜蔞薤白高劑量組;F.阿托伐他汀組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.6 6組小鼠肝臟TG合成酶上游調(diào)控蛋白SIRT1、AMPK表達水平比較 與空白組比較,模型組小鼠肝臟SIRT1表達水平顯著降低(P<0.05),AMPK表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,瓜蔞薤白高劑量組和阿托伐他汀組小鼠肝臟SIRT1表達水平顯著升高(P<0.05),AMPK表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖6。

注:A.空白組;B.模型組;C.瓜蔞薤白低劑量組;D.瓜蔞薤白中劑量組;E.瓜蔞薤白高劑量組;F.阿托伐他汀組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.7 6組小鼠肝臟SIRT1、AMPK mRNA表達水平比較 與空白組比較,模型組小鼠肝臟SIRT1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05),AMPK mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,瓜蔞薤白高劑量組和阿托伐他汀組小鼠肝臟SIRT1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05),AMPK mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖7。

注:A.空白組;B.模型組;C.瓜蔞薤白低劑量組;D.瓜蔞薤白中劑量組;E.瓜蔞薤白高劑量組;F.阿托伐他汀組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

高脂血癥是心血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ),TG水平的升高是心血管疾病發(fā)病的獨立危險因素。本實驗以高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠復(fù)制高脂血癥模型,探討瓜蔞薤白對高脂血癥的治療作用。結(jié)果顯示,瓜蔞薤白能夠顯著降低高脂血癥小鼠血清TG、TC、LDL-C水平,升高HDL-C水平,表明瓜蔞薤白能夠改善血脂紊亂,治療高脂血癥。

肝臟內(nèi)源性TG合成紊亂是誘發(fā)機體血脂異常的關(guān)鍵因素,調(diào)節(jié)肝臟TG內(nèi)源性合成是治療脂質(zhì)代謝疾病的重要策略,其中,ACC與FAS是調(diào)控TG合成的關(guān)鍵酶。ACC參與脂肪酸合成的第一步——催化乙酰輔酶A(acetyl-CoA,Ac-CoA)羧化為丙二酰輔酶A(malonyl-CoA),是脂肪酸合成的限速酶[12]。FAS是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶,催化Ac-CoA與Malonyl-CoA生成脂肪酸,促進TG的合成[13]。研究[14-15]表明,阿托伐他汀能顯著降低SD大鼠肝臟及油酸誘導(dǎo)的肝細胞ACC及FAS水平。本實驗結(jié)果顯示,瓜蔞薤白及阿托伐他汀治療后,高脂血癥小鼠肝臟ACC、FAS含量和mRNA水平顯著降低,表明瓜蔞薤白能夠降低ACC與FAS含量及基因水平,以減少TG的合成,降低TG水平。ACC及FAS的表達主要受到SREBP-1、ChREBP的調(diào)控。SREBP-1直接與ACC及FAS的轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)合,或與ChREBP結(jié)合發(fā)揮協(xié)同作用,激活FAS、ACC的表達,促進肝臟TG合成[16]。ChREBP與ACC、FAS mRNA啟動子區(qū)序列結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)肝臟TG合成[17]。阿托伐他汀能顯著降低高脂血癥小鼠肝細胞SREBP-1蛋白表達水平,抑制大鼠ChREBP水平[14,18-19]。本實驗結(jié)果顯示,瓜蔞薤白及阿托伐他汀能夠降低高脂血癥小鼠SREBP-1和ChREBP蛋白及mRNA水平,表明瓜蔞薤白減少ACC與FAS含量及基因水平,降低TG水平,這可能與其抑制SREBP-1、ChREBP蛋白及其mRNA表達水平有關(guān)。

SIRT1一種去乙酰化酶,通過去乙?；嚓P(guān)轉(zhuǎn)錄因子與蛋白調(diào)節(jié)細胞能量代謝[20]。SIRT1過表達能夠改善高脂飲食導(dǎo)致的肝臟脂肪變性,其缺失則導(dǎo)致肝細胞TG的蓄積[21]。AMPK可通過磷酸化參與機體能量代謝,下調(diào)脂質(zhì)合成相關(guān)因子,減少TG等脂質(zhì)合成[22]。研究[23-24]表明,SIRT1可促進AMPK磷酸化,調(diào)節(jié)SREBP-1及ChREBP的表達,抑制TG合成酶的表達,減少TG合成。本實驗結(jié)果顯示,瓜蔞薤白能顯著增加高脂血癥小鼠肝臟SIRT1蛋白及mRNA水平,減少AMPK蛋白及mRNA水平,表明瓜蔞薤白調(diào)節(jié)TG合成關(guān)鍵蛋白及合成酶水平,調(diào)節(jié)肝臟TG合成可能與其激活SIRT1/AMPK通路有關(guān)。

槲皮素、芹菜素、山柰酚等為瓜蔞薤白主要成分[25]。槲皮素可減少2型糖尿病誘發(fā)的非酒精性脂肪肝小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積[26],激活大鼠軟骨細胞SIRT1/AMPK通路[27]。芹菜素可激活HepG2細胞AMPK-SREBP途徑[28],抑制ACC磷酸化[29]。山柰酚可激活大鼠SIRT1通路,降低HepG2細胞SREBP-1及FAS表達,抑制TG累積[30-31]。上述物質(zhì)可能為瓜蔞薤白激活SIRT1/AMPK通路,減少肝臟TG合成的物質(zhì)基礎(chǔ),具體機制有待深入探究。

綜上所述,瓜蔞薤白對高脂血癥小鼠的血脂紊亂具有改善作用,其機制可能與其激活SIRT1/AMPK通路,抑制TG合成相關(guān)蛋白SREBP-1、ChREBP表達,降低TG合成酶ACC、FAS水平,減少肝臟TG合成有關(guān)。本研究從肝臟TG合成的角度出發(fā),探索瓜蔞薤白改善小鼠脂質(zhì)水平紊亂相關(guān)機制,可為瓜蔞薤白類方的臨床應(yīng)用提供參考。