羅雅靜，董立學(xué)，田 娟，陸 星，郭忠寶，羅永巨，文 華*，蔣 明*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021)

磷是魚類正常生長發(fā)育所必需的常量礦物元素之一，是體內(nèi)三磷酸腺苷、核酸、磷脂和輔酶等物質(zhì)的組成成分，在碳水化合物[1]、脂肪[2]和氨基酸[3]等新陳代謝過程中起著重要作用。由于魚類不能很好地利用水中的磷，且水中磷的濃度較低，因此飼料中添加的磷就成為魚類獲取磷的主要來源。當(dāng)飼料磷缺乏時(shí)，魚類會(huì)出現(xiàn)生長緩慢、飼料效率降低、骨骼異常、頭部畸形、脊椎彎曲、體脂含量增加和組織器官不同程度的病理損傷等現(xiàn)象[4-5]；飼料磷過量則會(huì)減少肌肉和肝臟的脂肪沉積，抑制魚類生長[6]。同時(shí)磷的價(jià)格相對(duì)較高，飼料中添加過量的磷不僅增加成本，還可能導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化[7]。日糧中添加磷可以調(diào)節(jié)能量生成相關(guān)酶和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，提高低溫應(yīng)激下暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)的細(xì)胞活力、抗氧化能力、能量生成和脂質(zhì)運(yùn)輸[8]；飼料磷通過抑制脂肪合成和促進(jìn)脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)，減少中華絨螯蟹幼蟹 (Eriocheir sinensis) 肝胰腺的脂肪積累[9]。研究表明，磷能促進(jìn)魚體腸道菌群發(fā)育，提高有益菌群的數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，維持腸道健康[10]。適宜日糧無機(jī)磷水平可以通過改善暗紋東方鲀的肝臟和腸道形態(tài)、椎骨礦物質(zhì)沉積和提高消化能力來促進(jìn)生長[11]。

吉富羅非魚(GIFTOreochromis niloticus) 是經(jīng)遺傳性狀改良后的品系，具有生長快、食性雜、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)膩鮮美和易加工等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為我國羅非魚養(yǎng)殖的主要品系。關(guān)于羅非魚對(duì)飼料磷營養(yǎng)需求已有較多的研究，蔣明等[12]和Yao 等[13]分別報(bào)道了吉富羅非魚對(duì)飼料有效磷的需求量分別為0.85%和0.86%；Ribeiro等[14]和Boscolo 等[15]分別報(bào)道了尼羅羅非魚(O.niloticus)幼魚對(duì)飼料總磷的需求量為 1.10%和0.74%。但目前飼料磷水平對(duì)羅非魚的營養(yǎng)代謝和腸道微生物的影響還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以吉富羅非魚為研究對(duì)象，采用廣靶代謝組學(xué)和16SrRNA高通量測序技術(shù)從營養(yǎng)組學(xué)的角度系統(tǒng)研究飼料磷缺乏和過量對(duì)羅非魚營養(yǎng)代謝和腸道菌群的影響，以期擴(kuò)展對(duì)羅非魚的飼料磷營養(yǎng)學(xué)認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

以酪蛋白和明膠為蛋白源，魚油和豆油作為脂肪源，糊精作為糖源，磷酸二氫鈣(一水)作為磷源，配制成3 組飼料，其基本組成和營養(yǎng)成分見表1。根據(jù)國內(nèi)外已有研究結(jié)果，羅非魚幼魚飼料總磷的適宜水平為 0.74%～1.10%。在此基礎(chǔ)上，飼料中設(shè)計(jì)添加磷的含量為0%、0.5%和1.25%，經(jīng)實(shí)測其總磷水平分別為0.26%(低磷組)、0.81%(適磷組)和1.51%(高磷組)。將干性飼料原料粉粹后過40 目篩，按配方(表1)比例稱取原料，干性原料用混合機(jī)攪拌10 min 后，緩慢加入魚油和豆油繼續(xù)攪拌至無明顯油狀顆粒，加入45%蒸餾水繼續(xù)攪拌5 min，用小型絞肉機(jī)經(jīng)1 mm 篩擠壓成條狀，用烘干機(jī)烘干后，長條飼料經(jīng)破碎機(jī)簡單破碎后過20 目篩，篩上物置于-20 °C 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)飼料的組成及營養(yǎng)成分Tab.1 Ingredients and proximate chemical composition of the experimental diets

1.2 實(shí)驗(yàn)魚和飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)的吉富羅非魚來源于廣西國家級(jí)羅非魚良種場，實(shí)驗(yàn)魚從南寧空運(yùn)至武漢后，在長江水產(chǎn)研究所室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)馴化4 周，馴化期間每日用基礎(chǔ)飼料飽食投喂3 次；正式實(shí)驗(yàn)前，停食36 h，選取健康活潑、規(guī)格一致的吉富羅非魚360 尾，隨機(jī)分在12 個(gè)養(yǎng)殖桶 (R=0.82 m，水深=0.75 m)中，每桶30 尾，分為3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組4 個(gè)重復(fù)。每天投喂3 次(8:30、12:30 和16:30)，日投喂率為體重的3%～5%，每次投喂直至達(dá)到表觀飽食為止，每2 周稱重1 次，根據(jù)體重變化調(diào)整投喂量，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)共8 周。實(shí)驗(yàn)期間水溫維持在28 °C，每天記錄實(shí)驗(yàn)魚攝食和死亡情況。每日早晚投喂前對(duì)養(yǎng)殖系統(tǒng)的過濾沙缸進(jìn)行反沖洗，同時(shí)補(bǔ)充約10%新水。每周檢測水質(zhì)參數(shù)1 次，實(shí)驗(yàn)期間主要水質(zhì)參數(shù)為：溶解氧>5 mg/L，pH：6.5～7.0，總氨氮<0.2 mg/L，亞硝酸鹽<0.05 mg/L，自然光照周期。

1.3 樣品采集與處理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束前2 周開始收集糞便樣本，采用虹吸法在吉富羅非魚排便高峰時(shí)間段(20：00～21：00)收集條狀、新鮮的糞便。將收集到的糞便進(jìn)行冷凍干燥后，貯存在-40 °C 的冰箱中保存，用于表觀消化率的測定。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，以桶為單位進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重，用于計(jì)算增重率和特定生長率。每桶取3 尾魚分別測量其體長、體重，然后進(jìn)行解剖，取內(nèi)臟、肝臟并稱其質(zhì)量，用于計(jì)算肝體比、臟體比和肥滿度等指標(biāo)。每桶3 尾魚取部分肝臟、中腸分別放在凍存管中，放入液氮急凍，于-80 °C 冰箱中保存?zhèn)溆?，用于肝臟代謝組學(xué)和腸道微生物的測定。每桶3 尾魚另取部分肝臟用于組織切片的制作。

實(shí)驗(yàn)過程中操作人員嚴(yán)格遵守《中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究獲得了中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(YFI-2021-JM05)，實(shí)驗(yàn)過程中操作人員嚴(yán)格遵守中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所倫理規(guī)范，并按照中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.4 測定指標(biāo)

生長性能測定 根據(jù)公式計(jì)算增重率(WGR)、特定生長率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)、肝體比(HSI)、臟體比(VSI)和肥滿度(CF)。

增重率(WGR，%)=(Wt-W0)/Wt×100%

特定生長率(SGR，%/)=(InWt-lnW0)/t×100%

飼料系數(shù)(FCR)=F/(Wt-W0)

肝體比(HSI，%)=Wh/Wt×100%

臟體比(VSI，%)=Wv/Wt×100%

肥滿度(CF，g/cm3)=W/L3×100

式中，Wt代表末體重(g)，W0代表初體重(g)，t為飼養(yǎng)天數(shù)(d)，F(xiàn)為投喂飼料的總質(zhì)量(g)，Wh為魚體肝臟質(zhì)量(g)，Wv為魚體內(nèi)臟質(zhì)量(g)，W為魚體重 (g)，L為魚體體長(cm)。

飼料和糞便營養(yǎng)成分的測定方法 采用冷凍干燥法測定水分；采用凱氏定氮法測定粗蛋白；采用索氏提取法測定脂肪；磷含量的測定采用磷鉬酸法。

表觀消化率的測定。使用TiO2指示劑測定，TiO2含量的測定采用分光光度計(jì)法測定。

干物質(zhì)表觀消化率和營養(yǎng)成分(粗蛋白、粗脂肪、磷)表觀消化率計(jì)算公式：

干物質(zhì)表觀消化率(ADC，%)=(1-飼料TiO2含量/糞便TiO2含量)×100%；

營養(yǎng)成分表觀消化率(ADC，%)=[1-(飼料TiO2含量×糞便營養(yǎng)素含量)/(糞便TiO2含量×飼料營養(yǎng)素含量)]×100%。

肝臟組織切片的制作 將固定好的肝臟樣品進(jìn)行修剪、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色(H.E 染色)、脫水封片。

肝臟代謝物檢測 將肝臟樣本放于冰上解凍。稱量50 mg 樣本，加入1 000 μL 預(yù)冷提取劑和鋼珠，勻漿3 min。取出鋼珠，渦旋1 min，冰上靜置15 min。之后在4 °C 下以12 000 r/min 離心10 min，取上清液到進(jìn)樣瓶內(nèi)襯管中，用于LC-MS/MS 分析。利用軟件Analyst 1.6.3 處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

腸道微生物群落結(jié)構(gòu)測定分析 提取吉富羅非魚腸道樣品的總DNA 后，以16SrRNA可變區(qū)V3～V4 區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物：338F(5′-ACTCC TACGGGAGGCAGCA-3′)/806R(5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′)。將吉富羅非魚腸道樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物有限公司進(jìn)行Illumina Miseq 高通量測序。之后對(duì)97%相似水平的可操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)代表序列進(jìn)行聚類，根據(jù)聚類結(jié)果進(jìn)行Alpha 多樣性分析，并在門、屬水平上對(duì)腸道菌群的組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

采用SPSS20.0 對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用Duncan 氏多重比較分析組間差異顯著性，所有的數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD，n=4)來表示，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料磷水平對(duì)吉富羅非魚生長性能的影響

低磷組吉富羅非魚表現(xiàn)出最低的生長性能，其增重率和特定生長率均最低。適磷組吉富羅非魚的增重率和特定生長率顯著高于低磷組和高磷組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)魚的飼料系數(shù)在適磷組最低。臟體比、肝體比和肥滿度指標(biāo)隨飼料磷水平的升高顯著下降(P<0.05)(表2)。

表2 飼料磷水平對(duì)吉富羅非魚生長指標(biāo)的影響Tab.2 Effects of dietary phosphorus levels on growth indicators of GIFT O. niloticus

2.2 飼料磷對(duì)吉富羅非魚表觀消化率的影響

適磷組吉富羅非魚的干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪和磷的表觀消化率均顯著高于低磷組和高磷組(P<0.05)(表3)。

表3 飼料磷水平對(duì)吉富羅非魚表觀消化率的影響Tab.3 Effects of dietary phosphorus levels on apparent

2.3 飼料磷水平對(duì)吉富羅非魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

適磷組羅非魚的肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列緊digestibility of GIFTO.niloticus%密，未見異常。低磷組和高磷組的肝臟細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞體積增大、細(xì)胞空泡變性和細(xì)胞核偏移的現(xiàn)象(圖版)。

圖版 飼料磷水平對(duì)吉富羅非魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響1.低磷組，2.適磷組，3.高磷組；細(xì)胞空泡變性(V)，核偏移(NM)，細(xì)胞核(N)。Plate Effects of dietary phosphorus levels on histological section of liver in GIFT O. niloticus1.low P treatment,2.moderate P treatment,3.high P treatment;vacuolar degeneration (V),Nuclear Migration (NM),nucleus (N) .

2.4 飼料磷水平對(duì)吉富羅非魚肝臟非靶向代謝組的影響

正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA 分析) 低磷組和適磷組，高磷組和適磷組之間的R2Y 值均大于0.9，Q2Y 值均大于0.7，說明低磷組和適磷組，高磷組和適磷組之間的吉富羅非魚肝臟樣本獲得了可靠的分類，都能被很好的區(qū)分，具有較明顯的差異(圖1)。

圖1 OPLS-DA 得分圖及模型評(píng)價(jià)圖(a) (b) (c) (d) 低磷組與適磷組OPLS-DA 分析，(e) (f) (g) (h) 高磷組與適磷組OPLS-DA 分析；(a) (e)模型驗(yàn)證，(b) (f)模型概述，(c) (g)觀測診斷，(d) (h) PLS-DA 得分。Fig.1 OPLS-DA score chart and model evaluation chart(a) (b) (c) (d) OPLS-DA analysis for low vs.moderate phosphorus treatment,(e) (f) (g) (h) OPLS-DA analysis for high vs.moderate phosphorus treatment;(a) (e) model validation,(b) (f) model overview,(c) (g) observation diagnostics,(d) (h) PLS-DA scores.

差異代謝物篩選 基于OPLS-DA 分析，選取VIP 值>1 的代謝物作為差異代謝物。在低磷組與適磷組的對(duì)比中共篩選出200 個(gè)差異代謝物，其中下調(diào)的有174 種，主要是氨基酸及其代謝物(L-蘇氨酸、L-苯丙氨酸、Ala-Gln、Val-Glu 等)、有機(jī)酸及其衍生物(檸檬酸、異檸檬酸)；上調(diào)的有26 種，主要是脂肪酰類(游離脂肪酸、氧化脂質(zhì))、甘油磷脂類(LPE(20:4/0:0)、LPA(18:1/0:0))等(圖2)。高磷組與適磷組共篩選出87 個(gè)差異代謝物，其中下調(diào)的有75 種，主要是氨基酸及其代謝物(Val-Gly、Asp-Leu、Asp-Ile、Val-Thr、Val-Glu 等)；上調(diào)的有12 種，主要是有機(jī)酸及其衍生物(2-羥基-4-(甲硫基)丁酸、α-酮戊二酸等)、氨基酸衍生物(己酰甘氨酸、1,3-二甲基尿酸、3-N-甲基-L-組氨酸等)(圖3)。

圖2 低磷組和適磷組的肝臟差異代謝物數(shù)量1.下調(diào)，2.上調(diào)；下同。Fig.2 Number of hepatic differential metabolites in the low and moderate phosphorus treatments1.down,2.up;the same below.

圖3 高磷組和適磷組的肝臟差異代謝物數(shù)量Fig.3 Number of hepatic differential metabolites in the high and moderate phosphorus treatments

差異代謝物KEGG 注釋分析 利用KEGG 數(shù)據(jù)庫，對(duì)篩選到的差異代謝物進(jìn)行KEGG 注釋和富集分析，獲得差異代謝物富集較多的代謝通路。低磷組和適磷組的差異代謝物主要?dú)w屬的代謝通路：氰胺酸代謝(cyanoamino acid metabolism)、葡萄糖酸酯的生物合成(glucosinolate biosynthesis)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(alanine,aspartate and glutamate metabolism)和脂肪酸合成(fatty acid biosynthesis)(圖4)。高磷組和適磷組的差異代謝物主要?dú)w屬的代謝通路：精氨酸和脯氨酸代謝(arginine and proline metabolism)、苯丙酸的生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)和氨基糖和核苷酸糖的代謝(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)(圖5)。

圖4 低磷組和適磷組差異代謝物KEGG通路分布數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖1.氰胺酸代謝，2.葡萄糖酸酯的生物合成，3.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，4.脂肪酸合成。Fig.4 Statistics of the number of KEGG pathway distribution of differential metabolites in the low and moderate phosphorus treatments1.cyanoamino acid metabolism,b.glucosinolate biosynthesis,c.alanine,aspartate and glutamate metabolism,d.fatty acid biosynthesis.

圖5 高磷組和適磷組差異代謝物KEGG 通路分布數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖1.精氨酸和脯氨酸代謝，2.苯丙酸的生物合成，3.氨基糖和核苷酸糖代謝。Fig.5 Statistics of the number of KEGG pathway distribution of differential metabolites in the high and moderate phosphorus treatments1.arginine and proline metabolism,2.phenylpropanoid biosynthesis,3.amino sugar and nucleotide sugar metabolism.

2.5 飼料磷對(duì)吉富羅非魚腸道微生物的影響

腸道微生物組測序結(jié)果分析 本實(shí)驗(yàn)樣品共出現(xiàn)1 782 個(gè)OTU，其中低磷組、適磷組和高磷組平均OTU 數(shù)分別為966、1 157 和1 352 個(gè)，每組OTU 數(shù)量排序：高磷組>適磷組>低磷組(圖6)。因此，飼料磷含量的提高增加了吉富羅非魚腸道菌群數(shù)量。3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組共有OTU 的數(shù)量為546 個(gè)，其中低磷組和適磷組共有的OTU 數(shù)為58 個(gè)，適磷組和高磷組共有的OTU 數(shù)為336 個(gè)。低磷組、適磷組和高磷組特有的OTU 數(shù)量分別為151、221 和263 個(gè)。

圖6 三個(gè)處理組共同OTU 的維恩圖Fig.6 Venn diagram for the three treatments with a common OTU

腸道細(xì)菌群落的豐富度和多樣性 高磷組中Ace 指數(shù)和Chao1 指數(shù)均顯著高于適磷組和低磷組(P<0.05)，高磷組的Shannon 指數(shù)最大。吉富羅非魚腸道菌群的豐度和多樣性排序?yàn)楦吡捉M>適磷組>低磷組(表5)。

表5 各組腸道菌群的豐度和多樣性統(tǒng)計(jì)Tab.5 Abundance and diversity statistics of intestinal flora in each treatment

吉富羅非魚腸道細(xì)菌群落的組成分析在門水平上，厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidota)為吉富羅非魚腸道菌群中的優(yōu)勢菌門(圖7)。在3 組樣本中厚壁菌門的平均相對(duì)豐度為38.49%、放線菌門為10.30%、變形菌門為14.04%、擬桿菌門為12.09%。由此可見厚壁菌門的豐度在吉富羅非魚腸道中具有絕對(duì)優(yōu)勢。其中，厚壁菌門和變形菌門的豐度隨著飼料磷含量的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢；放線菌門和擬桿菌門的豐度隨著飼料磷含量的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。

圖7 門水平上吉富羅非魚的腸道菌群結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度圖Fig.7 Structure and relative abundance of intestinal flora of GIFT O. niloticus at the phylum level

在屬水平上，羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)和鯨桿菌屬(Cetobacterium)為吉富羅非魚腸道菌群中的優(yōu)勢菌屬(圖8)。在3 組樣本中羅姆布茨菌屬的平均相對(duì)豐度為9.72%、分枝桿菌屬為7.77%、擬桿菌屬為6.71%、鯨桿菌屬為7.38%。羅姆布茨菌屬和鯨桿菌屬的豐度隨著飼料磷含量的增加呈現(xiàn)升高后降低的趨勢，即在適磷組的豐度最高；分枝桿菌屬和擬桿菌屬的豐度隨著飼料磷含量的增加呈現(xiàn)降低趨勢。

圖8 屬水平上吉富羅非魚的腸道菌群結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度圖Fig.8 Structure and relative abundance of intestinal flora of GIFT O. niloticus at the genus level

3 討論

3.1 飼料磷水平對(duì)吉富羅非魚生長的影響

本研究表明，飼料中添加適量的磷能促進(jìn)吉富羅非魚的生長，提高飼料利用率。當(dāng)飼料磷含量缺乏或過量時(shí)，魚體表現(xiàn)為生長緩慢，對(duì)飼料的利用率較低，這與草魚(Ctenopharyngodon idella)[16]、翹嘴鲌 (Culter alburnus)[17]、日本鱸(Lateolabrax japonicus)[18]、大黃魚(Larimichthys crocea)[19]等的研究結(jié)果相似。在本研究中，吉富羅非魚干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、磷的表觀消化率隨飼料磷水平的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與大口黑鱸[20]、吉富羅非魚[21]等的研究結(jié)果相似。吉富羅非魚各營養(yǎng)素的表觀消化率均在適磷組最高，此時(shí)吉富羅非魚的增重率也最高，說明適宜的飼料磷水平可以促進(jìn)吉富羅非魚對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而提高其對(duì)飼料的利用率，促進(jìn)羅非魚的生長。再次證明飼料磷的缺乏和過量都會(huì)影響吉富羅非魚的生長。

3.2 飼料磷對(duì)吉富羅非魚肝臟營養(yǎng)代謝的影響

本研究中，在低磷組和適磷組中篩選的差異代謝物，下調(diào)的主要是氨基酸類和有機(jī)酸類，即當(dāng)飼料磷缺乏時(shí)，魚體消耗氨基酸進(jìn)行供能；上調(diào)的主要是脂肪酰類和甘油磷脂類，即當(dāng)飼料磷缺乏時(shí)，影響了魚體脂肪酸合成通路，魚體合成脂肪酸的進(jìn)程加快，造成魚體脂肪堆積。Lu 等[1]研究花鱸在缺磷組和適磷組的肝臟轉(zhuǎn)錄組之間，大多數(shù)差異表達(dá)基因與蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物的代謝有關(guān)，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類似。相關(guān)研究表明，當(dāng)飼料磷含量不足時(shí)，影響魚體對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪的蓄積比例，從而影響魚體的蛋白質(zhì)和脂肪含量，如在草魚[22]、日本鱸[18]、大黃魚[19]、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)[23]等的研究中發(fā)現(xiàn)飼料磷含量缺乏會(huì)導(dǎo)致魚體脂肪蓄積，而消耗蛋白質(zhì)作為主要的能源物質(zhì)提供能量，本研究結(jié)果與其一致。

磷作為核酸、磷脂和輔酶等的組成成分，參與了許多重要的代謝過程中，如糖酵解和磷酸核糖途徑等[21,24]。當(dāng)飼料磷含量過多時(shí)，會(huì)刺激糖異生作用，將葡萄糖作為主要的能源物質(zhì)為魚體提供能量[25]。在高磷組和適磷組中篩選的差異代謝物，主要是下調(diào)的氨基酸類，即當(dāng)飼料磷過量時(shí)，吉富羅非魚的氨基酸代謝受到抑制。另有相關(guān)研究表明，鱸[26]、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[26]、鯉(Myxocyprinus asiaticus)[3]、石斑魚(Epinephelus coioides)[27]等魚體蛋白質(zhì)含量也隨著飼料磷含量的增加而增加，即飼料磷含量的增加會(huì)促進(jìn)吉富羅非魚對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，顯著提高飼料利用效率，減少內(nèi)臟脂肪蓄積。當(dāng)飼料磷過量時(shí)，多數(shù)氨基酸在肝臟中轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?，為魚體提供能量。此時(shí)，蛋白質(zhì)合成速率減小，魚體蛋白沉積率下降。

3.3 飼料磷對(duì)吉富羅非魚腸道微生物的影響

魚類腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和機(jī)體免疫的器官，極易受飼料和環(huán)境等因素變化的影響，進(jìn)而影響其腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)[28]。本研究中，隨著飼料磷含量的增加，吉富羅非魚腸道微生物豐富度和多樣性增加，說明磷可以促進(jìn)吉富羅非魚的腸道健康。

在門水平上，厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門為吉富羅非魚腸道菌群中的優(yōu)勢菌屬，這與Liu 等[29]的對(duì)雜交羅非魚的研究結(jié)果相似。本研究中，吉富羅非魚厚壁菌門的豐度隨著飼料磷含量的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，擬桿菌門豐度隨著飼料磷含量的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的組成與機(jī)體糖代謝和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，其中擬桿菌門和厚壁菌門可能是影響機(jī)體能量代謝的主要菌群[30]。擬桿菌門和厚壁菌門可以產(chǎn)生多糖水解酶，進(jìn)而產(chǎn)生單糖和短鏈脂肪酸，促進(jìn)魚體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，有助于維持腸道免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，保持宿主的腸道健康[31-32]。同時(shí)擬桿菌門和厚壁菌門可以增強(qiáng)魚體對(duì)碳水化合物的代謝[33]，這可能是導(dǎo)致高磷組吉富羅非魚氨基酸代謝物表達(dá)下調(diào)的原因之一。放線菌門包含的很多菌種可分泌抗生素和酶[34-35]，在動(dòng)物腸道和海洋微生態(tài)系統(tǒng)中均有重要作用，因此放線菌門可作為衡量動(dòng)物腸道健康的部分依據(jù)[36]。放線菌門含有多種致病菌，如分枝桿菌。變形菌門豐度的提高可能是腸道菌群失衡的一個(gè)重要標(biāo)志[37]。本研究中，在一定范圍內(nèi)隨著飼料磷含量的增加，放線菌門豐度呈現(xiàn)降低的趨勢，而變形菌門的豐度呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，這表明飼料磷水平的增加可能會(huì)降低吉富羅非魚的致病率，平衡腸道菌群，有利于吉富羅非魚的腸道健康。

在屬水平上，羅姆布茨菌屬、分枝桿菌屬、擬桿菌屬和鯨桿菌屬為吉富羅非魚腸道菌群中的優(yōu)勢菌屬。羅姆布茨菌屬被認(rèn)為是與腸道健康有影響的，可以利用不同種類簡單碳水化合物合成氨基酸和維生素，促進(jìn)宿主的生長[38-39]。在本研究中羅姆布茨菌屬豐度隨著飼料磷含量的增加呈現(xiàn)升高后降低的趨勢。鯨桿菌屬是在淡水魚腸道中常見的一種益生菌，有研究表明鯨桿菌屬可以產(chǎn)生乙酸，可促進(jìn)蛋白質(zhì)及碳水化合物和脂肪的代謝，并在生長和發(fā)育中起重要作用[40]。在本研究中，飼料添加適宜的磷可提高鯨桿菌屬的豐度，促進(jìn)吉富羅非魚對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。擬桿菌屬是發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸的主要菌群[41]，在將復(fù)雜分子加工成簡單分子的過程中起著重要作用，是機(jī)體用于脂肪酸及葡萄糖從頭合成的原料[42]。本研究中，當(dāng)飼料磷含量較低時(shí)，擬桿菌屬的豐度更高，在一定程度上可以促進(jìn)吉富羅非魚體脂肪酸的合成與沉積，這與前文低磷組脂肪酰類和甘油磷脂類代謝物表達(dá)上調(diào)的結(jié)果相吻合。分枝桿菌屬多為潛在致病菌，有許多菌株被證實(shí)是病原菌，可在魚體的皮膚、鰓、內(nèi)臟、肌肉等組織中分離得到[43]。本研究中，分枝桿菌屬的豐度隨著飼料磷含量的增加呈現(xiàn)降低趨勢，說明飼料磷含量的增加，可能減少吉富羅非魚相關(guān)疾病的發(fā)生。

本研究表明，飼料中適量的磷能提高吉富羅非魚對(duì)干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、磷的表觀消化率。對(duì)篩選到的差異代謝物進(jìn)行KEGG 注釋和富集分析得到，飼料磷的缺乏或過量會(huì)影響體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收代謝過程，即當(dāng)飼料磷缺乏時(shí)，吉富羅非魚的氨基酸代謝受到抑制，脂肪酸合成進(jìn)程加快；當(dāng)飼料磷過量時(shí)，吉富羅非魚的氨基酸代謝受到抑制。通過高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)飼料中適量的磷提高了腸道菌群中有益菌的豐度和多樣性，有利于吉富羅非魚健康。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）