劉 偉 郭戰(zhàn)萍 郝迎軍 宋媛媛

（新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院檢驗科，河南 新鄉(xiāng) 453000）

活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）檢測常用于評價內(nèi)源性凝血途徑異常，也可用于分析凝血因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ或纖維蛋白原功能缺陷[1]?？诜鼓齽┗蚍翘禺愋砸种苿?，如狼瘡樣抗凝物（lupus anticoagulant，LA），可導致APTT延長。APTT還可用于評價臨床肝素抗凝效果，是一個重要的篩查指標，對血栓性疾病、出血和凝血性疾病的診斷和治療有重要的臨床意義。

目前，臨床實驗室主要通過在血漿中加入鞣花酸、膠質(zhì)硅等激活劑和磷脂（部分凝血活酶）、鈣離子來測定APTT。本研究旨在探討不同激活劑對APTT測定結果的影響，并比較基于不同激活劑的試劑檢測凝血因子、LA的敏感性，建立臨床普通肝素抗凝治療范圍，為臨床診療提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

采用含10%枸櫞酸鈉（109mmol/L）抗凝劑的真空采血管（容量3 mL）采集新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院住院、門診患者和健康體檢者無溶血、無凝固、無黃疸、無脂靜脈血標本156例，其中100例為2周內(nèi)未行肝素、華法林、阿司匹林等抗凝藥物治療患者的常規(guī)送檢LA的樣本，56例為行普通肝素抗凝治療患者樣本，采集后輕輕顛倒混勻，1 006×g離心15 min，分離血漿，進行相關檢測。

1.2 儀器和試劑

CS 5100自動凝血分析儀和APTT檢測試劑盒（Hemosil SynthAsil試劑，簡稱HS試劑，激活劑為膠質(zhì)硅；Dade Actin Activated Cephaloplastin Reagent試劑，簡稱DAACR試劑，激活劑為鞣花酸）均購自日本希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司。肝素鈉注射液（1.25萬U/2 mL，國藥準字H32023409）購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司。凍干乏Ⅻ、乏Ⅺ、乏Ⅸ、乏Ⅷ因子血漿和凍干標準血漿購自德國西門子公司。

1.3 方法

分別以膠質(zhì)硅和鞣花酸為激活劑，采用CS 5100全自動凝血分析儀測定100例臨床標本和42份含有不同濃度肝素鈉（每份血漿含肝素鈉終濃度分別為0.625、0.417、0.313、0.250、0.178、0.104、0.000 U/mL）血漿標本的APTT。檢測前先使用質(zhì)控血漿進行測定，質(zhì)控在控后再檢測臨床標本。

1.4 LA檢測敏感性評價

收集新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院門診或住院患者常規(guī)送檢LA的標本100例。采用2種試劑檢測APTT，比較2種試劑檢測LA的敏感性?；颊呒{入標準：2周內(nèi)未行肝素、華法林、阿司匹林等抗凝藥物治療。以凝血酶原國際標準化比值（international normalized ratio，INR）＞1.20為LA陽性，以INR＞1.50為中至強陽性。

1.5 凝血因子檢測敏感性評價

根據(jù)美國臨床實驗室標準化學會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）H47-A2文件[2]要求評價APTT因子敏感性：按比例將凍干標準血漿與單因子缺乏血漿（凍干乏Ⅻ、乏Ⅺ、乏Ⅸ、乏Ⅷ因子血漿）配制成不同單凝血因子活性的混合血漿，使凝血因子活性為1%～100%。所有標本均在采集后4 h內(nèi)完成測定。凝血因子檢測敏感性基于非線性回歸曲線與參考區(qū)間上限交叉點百分活度（%）評價。

1.6 普通肝素抗凝治療范圍的建立和動態(tài)監(jiān)測趨勢比

分別用2種試劑檢測54例行普通肝素抗凝治療患者血漿APTT，同時檢測血漿肝素濃度（抗Ⅹa活性），將APTT和血漿肝素濃度（抗Ⅹa活性）檢測結果進行線性回歸分析，確定抗Ⅹa活性為0.3～0.7 IU/mL時相應的APTT。隨機選取2例行普通肝素抗凝治療的患者，收集其連續(xù)監(jiān)測數(shù)據(jù)，評價2種試劑APTT檢測結果的變化趨勢是否一致。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2種試劑檢測結果比較

以鞣花酸為激活劑的DAACR試劑APTT檢測結果為（29.5±4.8）s，以膠質(zhì)硅為激活劑的HS試劑APTT檢測結果為（38.2±8.1）s，2種試劑檢測結果差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 含不同濃度肝素鈉血漿標本2種試劑APTT檢測結果

隨著肝素鈉濃度的增加，以鞣花酸為激活劑的DAACR試劑和以膠質(zhì)硅為激活劑的HS試劑APTT檢測結果均明顯延長；DAACR試劑組變化更明顯。見表1。

表1 含不同濃度肝素鈉血漿標本2種試劑APTT檢測結果 s

2.3 2種試劑檢測LA的敏感性比較

100例常規(guī)送檢LA的標本INR為0.72～2.52，其中LA陽性54例，LA中至強陽性32例；以膠質(zhì)硅為激活劑的HS試劑APTT檢測結果為22.5～62.8 s，以鞣花酸為激活劑的DAACR試劑APTT檢測結果為19.8～61.1 s。54例LA陽性標本中，HS試劑和DAACR試劑陽性檢出率分別為42.9%和55.1%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；32例LA中至強陽性標本中，HS試劑和DAACR試劑陽性檢出率分別為54.3%和69.8%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.4 2種試劑凝血因子檢測敏感性

HS試劑參考區(qū)間上限為37.2 s，DAACR試劑參考區(qū)間上限為32.1 s。HS試劑檢測凝血因子Ⅷ的敏感性＞50%（超敏感），檢測凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅺ、凝血因子Ⅻ的敏感性為30%～50%（中度敏感）。DAACR試劑檢測凝血因子Ⅺ的敏感性＞50%（超敏感），檢測凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅻ的敏感性為30%～50%（中度敏感）。見表2。

表2 2種試劑檢測凝血因子的敏感性 %

2.5 臨床普通肝素抗凝治療范圍

抗Ⅹa活性為0.3～0.7 IU/mL時，HS試劑檢測APTT對應的普通肝素治療范圍為56.9～104.7 s，DAACR試劑對應的普通肝素治療范圍為45.3～78.2 s（圖1）?？耿鷄活性＞0.8 IU/mL時，DAACR試劑和HS試劑檢測APTT結果差異較大。2種試劑連續(xù)監(jiān)測2例樣本的趨勢一致（表3、表4、圖2）。

圖1 2種試劑普通肝素抗凝治療范圍

圖2 普通肝素治療患者連續(xù)監(jiān)測樣本APTT檢測結果變化趨勢

表3 病例1（普通肝素治療）2種試劑連續(xù)監(jiān)測APTT結果 s

表4 病例2（普通肝素治療）2種試劑連續(xù)監(jiān)測APTT結果 s

3 討論

凝塊激活部分的凝血活酶時間測試最早出現(xiàn)于1954年，當時為復鈣時間測定法，隨后發(fā)展為部分凝血活酶時間（partial thromboplastin time，PTT），并添加了一種由磷脂組成的兔腦組織提取物（腦磷脂），作為血小板替代物，因為不包括組織因子，被認為是“部分凝血活酶”。當添加帶負電荷顆粒的接觸活化劑（高嶺土、二氧化硅、鞣花酸或硅藻土）以提高反應性和重現(xiàn)性時，被稱為“活化”[3]。目前，大多APTT試劑使用的是大豆基合成磷脂和非沉降活化劑（膠體二氧化硅）。當一種APTT試劑被加入乏血小板血漿中時，可通過激活凝血因子Ⅻ在體外觸發(fā)血栓形成[4]。APTT可對內(nèi)在和/或共同途徑中的缺陷作出反應，并隨共同途徑中顯著單因素缺陷或多個缺陷延長。CLSI H47-A2文件[2]指出：對于APTT試劑及其檢測系統(tǒng)，當內(nèi)源性凝血因子Ⅷ、Ⅸ或Ⅺ活性降低到約30%（0.3 IU）或更低時，APTT應表現(xiàn)為延長；纖維蛋白原水平降至2.94 μmol/L（100 mg/dL）以下時，APTT才會延長。本研究中，2種試劑對凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的敏感性均＞30%，符合CLSI的要求。激活劑是影響APTT試劑檢測凝血因子敏感性的重要因素[5-6]。本研究中，以鞣花酸為激活劑的DAACR試劑檢測內(nèi)源性凝血因子的敏感性高于以膠質(zhì)硅為激活劑的HS試劑，也證實了這一點。

LA是一種能作用于磷脂或磷脂蛋白質(zhì)復合物的IgG或IgM型免疫球蛋白，屬于“抗磷脂抗體”家族[7]。LA與抗磷脂綜合征、靜脈和動脈血栓形成，以及產(chǎn)科并發(fā)癥相關的血栓密切相關[8]，是病理性循環(huán)抗凝物質(zhì)，對依賴磷脂的各種途徑的凝血和抗凝因子具有干擾作用，可影響凝血反應，延長凝血時間。實驗室基于LA在體外實驗中表現(xiàn)出的抗磷脂作用導致的凝血時間延長來判斷機體是否存在LA[9-10]。不同試劑對LA的敏感性與磷脂的含量、來源、濃度和組成，特別是磷脂酰絲氨酸含量密切相關。另外，激活劑類型也很重要。有研究發(fā)現(xiàn)，HS試劑含有硅成分的活化劑，更適用于LA檢測[11]。

APTT還被用于監(jiān)測普通肝素的抗凝作用，目前，監(jiān)測普通肝素抗凝作用最常用的2種方法是APTT和抗凝血因子Ⅹa（抗Ⅹa）肝素測定。APTT檢測比抗Ⅹa檢測更易自動化，成本更低[9]。APTT主要是對凝血級聯(lián)固有和共同途徑功能的檢測，普通肝素抗凝目標治療范圍以魚精蛋白滴定法測定相應肝素濃度0.2～0.4 U/mL為基礎，或以抗凝劑Ⅹa測定法測定相應肝素濃度0.3～0.7 U/mL為基礎[12]，但受不同試劑差異和一些不能反映肝素活性生物因素影響[13-14]，每批新的APTT試劑都必須進行性能驗證或更新目標范圍；不同試劑對Ⅹa和Ⅱa因子的抑制反應不同，指導肝素治療，應建立一個試劑特異性APTT治療范圍，相當于肝素濃度（抗Ⅹa活性）0.3～0.7 U/mL。

本研究中，當抗Ⅹa活性為0.3～0.7 IU/mL時，HS試劑APTT檢測對應的普通肝素治療范圍為56.9～104.7 s，DAACR試劑APTT檢測對應的普通肝素治療范圍為45.3～78.2 s?？耿鷄活性＞0.8 IU/mL時，DAACR試劑和HS試劑APTT的檢測結果差異較大；2種試劑對2例患者連續(xù)監(jiān)測標本的檢測結果顯示，APTT的變化趨勢一致。

綜上所述，分別以膠質(zhì)硅和鞣花酸為激活劑的2種試劑均能滿足臨床對凝血因子、LA敏感性的需求，但對肝素、LA、凝血因子敏感性差異較大。本研究分別確定了DAACR試劑、HS試劑檢測APTT對應的普通肝素治療范圍。試劑對APTT測定的影響應引起臨床重視，實驗室應針對相應試劑與儀器建立自己的參考區(qū)間，從而更好地指導臨床合理用藥。