陳馨寧 黃 斐 姜惠琴 沈敏娜 潘柏申 王蓓麗 郭 瑋

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032）

使用血液樣本進行血漿表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因檢測已經(jīng)成為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）臨床診療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。本研究報道1例EGFR：c.2572_2573delinsAG陽性NSCLC患者，采用改進的突變擴增阻礙系統(tǒng)（super amplification refractory mutation system，Super-ARMS）檢測血漿循環(huán)游離DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），未檢出該突變；采用抑制探針置換擴增（blocker displacement amplification，BDA）法檢出該突變位點。

1 病例資料

1.1 簡要病史

患者，男，87歲，發(fā)現(xiàn)肺部惡性腫瘤1年，因無癥狀未行治療，2020年11月31日主訴“近期胸痛、吞咽困難”就診。2020年12月1日行單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)/電子計算機斷層掃描顯像結(jié)合全身骨平面顯像，考慮為全身多處骨轉(zhuǎn)移。

1.2 血漿EGFR基因檢測結(jié)果

采集患者靜脈血10 mL，乙二胺四乙酸抗凝。采用兩步離心法，4 ℃ 1 600×g離心10 min，分離血漿，4 ℃ 16 000×g再次離心10 min，吸取上清4 mL，采用核酸提取試劑（廈門艾德生物醫(yī)藥公司）抽提ctDNA，分別采用Super-ARMS和BDA法檢測。Super-ARMS試劑盒購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司，BDA法試劑盒購自上海閱爾基因技術(shù)有限公司，檢測儀器均為7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

血漿EGFR基因檢測結(jié)果見圖1。Super-ARMS未檢出EGFR突變，BDA法檢出EGFR基因21號外顯子L858R突變，位點為c.2572_2573delinsAG，該位點不在Super-ARMS檢測范圍內(nèi)。

圖1 患者血漿EGFR基因突變檢測結(jié)果

隨后使用Sanger測序[委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進行，上游引物為5'-GCTCCCAGTACCTGCTCAAC-3'，下游引物為5'-TGATAGGCACTTTGCCTCCT-3']和二代測序[試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，檢測儀器為 MiSeq測序儀（美國Illumina公司）]進行復(fù)核，結(jié)果同BDA法。同時，為避免存在克隆造血影響，對患者基因組DNA中該位點進行檢測，結(jié)果為陰性。

2 討論

Super-ARMS技術(shù)基于ARMS，是腫瘤相關(guān)分子檢測的主要技術(shù)之一，檢測下限為0.2%～0.8%[2-3]?；谠摷夹g(shù)的EGFR試劑盒是中國國家藥品監(jiān)督管理局首次按照伴隨診斷試劑標準審評并批準上市的產(chǎn)品。BDA法是基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的突變富集技術(shù)，在野生型DNA背景下選擇性地擴增基因突變，利用引物和抑制探針之間的競爭關(guān)系提高PCR的效率和低豐度突變檢出率，檢測下限為0.01%～0.10%[4]。

基于特定突變位點探針和引物的PCR方法只能檢測有限數(shù)量和已知的特異性突變，而測序可以揭示所有分析序列中的異常，包括罕見和未知突變，見圖2。由于Sanger測序靈敏度相對較低（10%），因此采用BDA技術(shù)補充檢測EGFR第18～21號外顯子全部突變，具有在常規(guī)EGFR基因突變基礎(chǔ)上獲得更多臨床和科研價值[5]的優(yōu)勢。

圖2 3種檢測方法原理

EGFR基因與腫瘤的發(fā)展、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，根據(jù)EGFR基因突變結(jié)果指導(dǎo)NSCLC患者進行表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）治療已經(jīng)成為標準臨床實踐方法[1]。然而，臨床診療過程中肺癌組織受檢率并不高，導(dǎo)致基于驅(qū)動基因突變靶點的個體化治療策略難以實施。多項回顧性和前瞻性研究結(jié)果均表明，當腫瘤組織難以獲取時，血液ctDNA檢測是合適的突變分析替代選擇[1]。和傳統(tǒng)活檢相比，液體活檢具有無創(chuàng)、可實時檢測、克服腫瘤異質(zhì)性等特點。因此，血液EGFR基因突變檢測的臨床價值逐漸突顯[6]。

EGFR基因21 號外顯子L858R 突變占所有突變的32%，常見的突變形式為c.2573T＞G，也有c.2573_2574delinsGT和c.2573_2574delinsGA突變相關(guān)報道[7]。本例患者檢出的c.2572_2573delinsAG位點也屬于L858R突變，但鮮有報道。L858R突變患者為EGFR敏感突變，此類患者酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的療效優(yōu)于化療。因此，L858R突變的檢出無疑增加了患者的治療選擇和機會。除了常見突變外，其余突變也可以幫助臨床為患者做出更好的臨床決策。非經(jīng)典突變主要包括G719X（18號外顯子）、S768I（20號外顯子）、L861Q（21號外顯子）突變[8]，目前基本已包括在基于PCR方法的商品化診斷試劑盒的檢測范圍內(nèi)。但另有罕見突變，如18del、E709X和19ins，其發(fā)生頻率＜0.5%，在非測序方法中被忽視。E709X對一代TKI的反應(yīng)介于經(jīng)典EGFR突變和EGFR野生型之間。18del、E709X和19ins均對二代TKI敏感，但相關(guān)臨床數(shù)據(jù)較少，僅有相關(guān)病例報道患者治療后獲部分緩解[9]。此外，常見突變類型中特定的突變位點可能對TKI表現(xiàn)出獨特甚至相反的選擇性，如EGFR基因第19外顯子缺失中p.L747-A750＞P與其他缺失類型相比，患者接受厄洛替尼治療獲得的臨床結(jié)局更差[10-11]；除p.A763_Y764insFQEA和p.A763_Y764insLQEA外，攜帶EGFR基因第20外顯子插入的患者對EGFR-TKI治療普遍不敏感[12-13]。因此，更深入、更全面地開展腫瘤分子檢測可以幫助了解罕見突變?nèi)绾斡绊慐GFR蛋白結(jié)構(gòu)和TKI結(jié)合效力[14-15]，為NSCLC患者提供更有價值的治療見解，以實現(xiàn)精準的個體化治療。