丁 靜 劉偉玲 夏新新 藺麗慧

（1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院檢驗科，上海 201600；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院血液科，上海 201600）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一組克隆性造血干細胞疾病，異基因造血干細胞移植是目前唯一可能治愈MDS的方法[1]。系統(tǒng)性肥大細胞增多癥是克隆性、腫瘤性肥大細胞增殖性疾病，肥大細胞白血病在系統(tǒng)性肥大細胞增多癥各亞型中侵襲性最強、預后最差，患者中位生存時間僅約為2個月[2]。本研究回顧分析1例異基因造血干細胞移植后繼發(fā)肥大細胞白血病的MDS患者疾病進程，總結相關實驗室檢驗結果與疾病發(fā)生發(fā)展的關系，以提高臨床對該類疾病的認識。

1 材料和方法

1.1 研究對象

患者，女，60歲。2014年因白細胞、血紅蛋白降低確診高危型骨髓增生異常綜合征伴原始細胞增多1型（myelodysplastic syndrome with excess blasts 1，MDS-EB-1）。2014年9月行全相合異基因造血干細胞移植，移植成功。該患者移植術后6年間反復發(fā)熱；伴干咳、氣喘，并夜間加重；頭痛，盜汗，消瘦，乏力。2016年4月曾因“間斷發(fā)熱、咳嗽、咳痰”就診，骨髓檢查提示含嗜堿性顆粒的細胞增多（約占36%），外周血涂片示含嗜堿性顆粒的細胞約占10%，電子計算機斷層掃描提示肺部感染，行抗感染治療后稍好轉，但癥狀仍有反復。有過敏性鼻炎史。2020年7月，患者胸悶氣促加重、面色潮紅，血常規(guī)示兩系降低。于上海市第一人民醫(yī)院血液科住院治療。

住院期間骨髓病理檢查示：有核細胞高度增生，原始細胞高度增生、形態(tài)一致，正常造血細胞增生高度受抑，網狀纖維增生（MF Ⅱ級）。免疫組化：MPO（-）、CD20（-）、CD34（-）、CD2（-）、CD117（+）、BM2（+）、Ki-67（個別+）、CD42b（-）、CD7（-）、CD68（+）。正電子發(fā)射斷層顯像/X線計算機體層成像（positron emission tomography/computed tomography，PET/CT）提示全身多發(fā)骨病灶伴葡萄糖代謝輕度增高，肝脾腫大，傾向血液系統(tǒng)疾病。腹部B超提示肝脾大，門靜脈高壓，腹腔積液，提示肝硬化。行甲磺酸伊馬替尼聯(lián)合小劑量醋酸潑尼松片治療。2021年7月電話隨訪獲知預后良好。

1.2 實驗室檢驗

采集患者乙二胺四乙酸抗凝血，采用深圳邁瑞公司Mindray6800流水線及配套試劑進行血細胞計數。

收集患者骨髓細胞，制片后采用珠海貝索生物技術有限公司Wright-Giemsa染液染片，采用日本OLYMPUS公司CX33顯微鏡觀察。

抽取患者骨髓液，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。采用美國貝克曼庫爾特公司Navios流式分析儀及配套試劑進行免疫表型分析，采用江蘇康為世紀生物科技公司柱式抽提試劑盒提取總RNA，采用多重巢式聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測RUNX1-RUNX1T1、BCR-ABL1、CBFβ-MYH11、KMT2A-MLLT6、KMT2A-MLLT11、KMT2A-MLLT3，KMT2AMLLT10等56種急性白血病相關融合基因（上海源奇生物醫(yī)藥有限公司），以循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）＜33為陽性。采用逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司）合成cDNA；然后提取DNA，試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技公司；采用美國illumina公司illumina測序平臺進行測序，平均靶基因覆蓋率≥90%，平均測序深度≥1 000×；單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）檢測參照文獻[3]。

抽取患者肝素抗凝骨髓液，采用短期培養(yǎng)法對骨髓細胞進行染色體分析，培養(yǎng)基購自上海樂辰生物科技公司。

收集患者相關臨床表現和診療經過等相關資料。

2 結果

2.1 實驗室檢驗結果和診斷

2.1.1 血常規(guī)

血紅蛋白73 g/L，紅細胞2.16×1012/L，白細胞2.45×109/L，中性粒細胞絕對值1.48×109/L，血小板193×109/L。

2.1.2 細胞形態(tài)學特征

骨髓有核細胞增生明顯活躍。肥大細胞約占96.5%。細胞中等偏大，多數規(guī)則，約8%為梭形；核中等，圓形，居中或稍偏位，染色質偏成熟；胞質偏多，布滿紫黑色粗大顆粒，可蓋于核上。約21%胞體偏大，核畸形，呈啞鈴樣或雙核，染色質偏細，可見少數細胞顆粒缺乏。細胞化學染色：過氧化物酶染色（-），特異性酯酶染色（+++），糖原染色（++），甲苯胺藍染色（+++），非特異性酯酶染色（++）且不被氟化鈉抑制。提示：肥大細胞增多癥骨髓象，肥大細胞白血病待排。形態(tài)學結果見圖1。

圖1 形態(tài)學涂片和染色結果（×1 000）

2.1.3 細胞免疫學分型結果

共分析約4.9 個萬細胞，其中異常細胞約占白細胞總數的88.35%，免疫表型為：CD45dimSSC高CD34-CD117+CD13+CD33+CD16+CD64partCD123dimCD2-CD25dimCD203c+FcεRI+，提示肥大細胞待排。見圖2。

圖2 細胞免疫學分型結果

2.1.4 基因檢測結果

檢出突變KITD816H48.57%，IDH2R140Q40.30%，DNMT3AW601X34.01%。融合基因未檢出。移植后SNP和骨髓肥大細胞比例始終呈負相關（圖3）。

圖3 SNP和骨髓肥大細胞的變化曲線

2.1.5 染色體

染色體核型分析結果示：46，XX[3]。

3 討論

系統(tǒng)性肥大細胞增多癥的確診需要符合主要標準和1個次要標準，或符合至少3個次要標準[4-5]。依據文獻[5]，本例患者存在外周血兩系減低、肝脾腫大伴肝功能異常等“C所見”表現，骨髓穿刺液形態(tài)學、流式細胞學和基因檢測結果符合3項次要標準，同時，骨髓穿刺液涂片示肥大細胞≥20%，可診斷為系統(tǒng)性肥大細胞增多癥中的肥大細胞白血病。

肥大細胞白血病預后極差，而回顧本例患者病史，2016年4月骨髓穿刺液中即出現肥大細胞，占骨髓有核細胞的36%，外周血肥大細胞占10%，已符合肥大細胞白血病診斷標準。直至2021年7月隨訪時狀態(tài)良好，與既往研究中的中位生存時間[2]分歧較大。

有研究發(fā)現，少數肥大細胞白血病患者病程較為緩慢、穩(wěn)定，有時甚至在早期沒有“C所見”[6]。此類患者疾病可能會進展，但總體預后優(yōu)于急性肥大細胞白血病患者，尤其是當沒有“C所見”時，其形態(tài)學也以典型肥大細胞或非典型肥大細胞Ⅰ型為主。另外，急性肥大細胞白血病通常顯示出高增殖率（Ki-67陽性肥大細胞＞50%），而慢性肥大細胞白血病則顯示出低增殖率（Ki-67陽性肥大細胞＜10%）[6]。肥大細胞在Wright-Giemsa染色中可顯示出4種形態(tài)：1）典型肥大細胞，圓形，顆粒豐富，圓形核居中；2）非典型肥大細胞Ⅰ型，具有細長的細胞表面呈紡錘形、胞質顆粒減少、核呈橢圓形且疏松中的2或3個特征；3）非典型肥大細胞Ⅱ型/前母細胞，具有雙葉或多葉核；4）異染性原始細胞，原始細胞伴有少量異染顆粒[6]。SPERR等[7]認為Ⅰ型非典型肥大細胞中，梭形肥大細胞相對于規(guī)則形狀肥大細胞更成熟，而高比例的Ⅱ型非典型肥大細胞與不良預后相關。本例患者的骨髓細胞形態(tài)多數為相對成熟的典型肥大細胞和Ⅰ型非典型肥大細胞，骨髓病理免疫組化Ki-67僅個別陽性，病程進展緩慢，符合慢性肥大細胞白血病的特征。

查閱國內外文獻，僅見2例異基因造血干細胞移植術后發(fā)生肥大細胞白血病的病例[8-9]，臨床病程、形態(tài)學特征、治療與預后見表1。

表1 本例患者與文獻報道的2例患者基本情況

與文獻報道的2例移植后發(fā)生肥大細胞白血病的患者對比后，我們發(fā)現本例患者與病例1在移植前均未發(fā)現肥大細胞，均接受了異基因造血干細胞移植，移植后肥大細胞形態(tài)均較為成熟，生存時間均超過5年，預后均符合文獻[6]。不同于本例患者移植后繼發(fā)肥大細胞白血病混合嵌合狀態(tài)，病例1通過供者淋巴細胞輸注有效實現了骨髓肥大細胞的清除。病例2在化療復發(fā)后即被診斷為系統(tǒng)性肥大細胞增多癥-急性髓系白血病，移植前骨髓中原始細胞占31.2%，肥大細胞占5.8%；半相合移植后骨髓中的肥大細胞增多，以異染性原始細胞和非典型肥大細胞Ⅱ型為主，肥大細胞脫顆粒后高水平的肝素引起臨床顯著出血，顱內出血是病例2死亡的主要原因。

值得注意的是，本例患者雖然在移植前無肥大細胞浸潤證據，但其全部病程進展很可能涉及肥大細胞合并克隆性造血組織非肥大細胞系疾?。╝ssociated haematological neoplasm，AHN），這類血液系統(tǒng)惡性腫瘤多為髓系，如MDS、骨髓增生性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）、MDS/MPN或急性髓系白血病，5%～40%的系統(tǒng)性肥大細胞增多癥病例，AHN在其診斷的同時、之前或之后均可被發(fā)現。疾病初發(fā)時肥大細胞可能被造血系統(tǒng)腫瘤細胞的增殖掩蓋，而在治療引起的增生減低或造血恢復后變得明顯[10]。目前，關于肥大細胞合并AHN的發(fā)病機制有2種理論，一種是突變的骨髓干細胞由于存在c-KIT突變而分化并增殖為肥大細胞，另一種是具有獲得性C-KIT突變的骨髓祖細胞亞克隆轉化導致共存的肥大細胞增多癥[11]。CRAIG等[12]的研究中納入64例具有C-KIT突變的患者，其中患MDS、MPN或MDS/MPN的患者約占1/3，形態(tài)學和免疫表型特征表明有91%的患者檢出肥大細胞；隊列中有30名肥大細胞合并AHN患者，其中近1/3在疾病初期未檢出肥大細胞[12]。FRITSCHE-POLANZ等[13]發(fā)現，在101例急性髓系白血病患者中，有7例（6.9%）檢出KIT D816V伴肥大細胞，最終診斷為肥大細胞合并急性髓系白血病。JAWHAR等[14]認為，肥大細胞合并AHN時，2種疾病可能互相掩蓋，他們發(fā)現KITD816mut/CBFnegSMAML和KITD816mut/CBFnegAML2個數據庫顯著相似，提示很大比例的急性髓系白血病患者體內有潛在的肥大細胞，并可通過檢測血清類胰蛋白酶、規(guī)范骨髓活檢，提高肥大細胞的檢出率。

已發(fā)表的關于肥大細胞-急性髓系白血病伴t（8；21）的研究顯示了關于移植后肥大細胞來源的不同觀點，有研究認為移植后肥大細胞可檢出t（8；21），來源于受者[15-17]，而CHEN等[18]在1例t（8；21）的MCL-AML患者移植后31 d，發(fā)現了供體來源肥大細胞，該患者移植前后均未發(fā)現C-KIT突變。本病例移植后SNP結果和骨髓肥大細胞的比例變化呈負相關，SNP檢測異基因造血干細胞移植術后供者細胞嵌合率降低，提示供者來源細胞減少，受者來源細胞增多，間接提示肥大細胞可能來源于受者自身，有待于基因測序加以確認。

綜上所述，本例罕見的MDS行異基因造血干細胞移植術后發(fā)生慢性肥大細胞白血病的病例，揭示了較成熟的肥大細胞形態(tài)與良好預后的相關性。人類肥大細胞主要分布于機體與外界環(huán)境相通的組織器官，如皮膚、呼吸道和消化道，這些部位經?？梢越佑|到病原體、變應原，以及環(huán)境中的其他物質。因此，當血液腫瘤患者出現反復、不明原因的發(fā)熱、潮紅、骨質疏松癥、過敏反應、呼吸道和胃腸道疾病或慢性腹部絞痛癥狀時，應高度懷疑肥大細胞增殖。建議具有KITD816V突變的急性髓系白血病、MDS、MPN或MDS/MPN的患者均應通過血清類胰蛋白酶檢測、骨髓活檢篩查肥大細胞。由于持續(xù)肥大細胞增多癥會增加出血風險和其他不良影響，因此可能需要考慮積極的干預措施，如輸注供體淋巴細胞。血液學檢驗工作者在日常工作中應提高對罕見疾病的敏感性，加強對疾病進展的認識，完善疾病的診斷，為臨床工作提供幫助。