李 琴 胡 悅 秦嘯峰 馮志紅 王 煒 孫 英*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)學(xué)系,北京 101300;2. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系,北京 100069;3. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院呼吸內(nèi)科,北京 100053)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種異質(zhì)性肺部疾病,以持續(xù)、進(jìn)行性氣流受限為特征[1]。COPD已成為全球第三大死因,預(yù)計(jì)到2040年死亡人數(shù)將達(dá)到每年440萬[2],其發(fā)病機(jī)制仍舊不明,但越來越多的證據(jù)[3-4]表明COPD的發(fā)生發(fā)展與肺部微生態(tài)相關(guān)?！皭盒匝h(huán)假說”認(rèn)為細(xì)菌定植到呼吸道,誘導(dǎo)肺部細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子,破壞肺組織和損傷免疫防御機(jī)制,進(jìn)一步有利于細(xì)菌的定植,從而形成一個(gè)不斷放大的正反饋循環(huán),促進(jìn)COPD的發(fā)生和發(fā)展[5]。有研究[6-7]顯示,80% COPD患者急性加重期與感染因素有關(guān),其中大約50%是細(xì)菌來源的。急性加重不僅大大降低患者生活質(zhì)量、增加醫(yī)療衛(wèi)生負(fù)擔(dān)和患者死亡風(fēng)險(xiǎn),而且頻繁的急性發(fā)作可引起肺功能快速下降[8-9]。

筆者課題組前期應(yīng)用16S核糖體核糖核酸(16S ribosomal ribonucleic acid,16S rRNA)基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)變形菌門腸桿菌科遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda)僅在COPD急性加重期患者誘導(dǎo)痰中檢出。該菌極少感染人類,感染者患有慢性疾病是重要的易感因素,最常見的是腸胃炎,腸外感染罕見,如菌血癥、敗血癥、膿腫、軟組織感染等,但腸外感染患者癥狀表現(xiàn)嚴(yán)重,病死率接近50%[10]。目前,遲緩愛德華菌感染僅局限于臨床病例的發(fā)現(xiàn),機(jī)制研究少有文獻(xiàn)報(bào)道。本文研究以遲緩愛德華菌為研究對(duì)象,分別采用遲緩愛德華菌體組分及代謝物構(gòu)建急性肺損傷小鼠模型和體外細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn),探討呼吸道遲緩愛德華菌誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng),為進(jìn)一步深入研究COPD的發(fā)展機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型C57BL/6J小鼠,SPF級(jí)、雌性、6～8周齡、體質(zhì)量為18～20 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXY(京)2021-0006。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(AEEI-2021-117)。

1.1.2 細(xì)胞系

A549細(xì)胞(ATCC CCL-185,人肺泡基底上皮細(xì)胞),MLE12細(xì)胞(ATCC CRL-2110,小鼠肺上皮細(xì)胞系),THP-1細(xì)胞(ATCC TIB-202,人單核細(xì)胞系),及RAW264.7細(xì)胞(ATCC SC-6003,小鼠巨噬細(xì)胞系)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

應(yīng)用SPF級(jí)野生型C57BL/6小鼠構(gòu)建遲緩愛德華菌滴鼻急性肺損傷模型,設(shè)立磷酸緩沖鹽液(phosphate buffer saline,PBS)對(duì)照組(Control組)、滅活菌體組(Body組)、細(xì)菌裂解物組(Lysate組)和細(xì)菌培養(yǎng)上清或代謝物組(Supernatant組)。每只小鼠于第1至3天連續(xù)滴鼻3 d,每次滴鼻50 μL細(xì)菌作用物,細(xì)菌作用物劑量是以相同細(xì)菌數(shù)下的產(chǎn)生量進(jìn)行計(jì)算。第4天殺鼠取材分析。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及其成分制備

遲緩愛德華菌(CICC 10630)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,用腦心浸液肉湯培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)菌生長至對(duì)數(shù)生長期,離心過濾收集細(xì)菌培養(yǎng)上清;細(xì)菌沉淀經(jīng)0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的甲醛溶液處理后制備滅活菌體;細(xì)菌沉淀超聲裂解至菌液透明清澈,離心收集上清,測(cè)定細(xì)菌裂解物的蛋白濃度。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

小鼠經(jīng)過量麻醉致死后行氣管插管,用無菌PBS進(jìn)行肺泡灌洗,支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)經(jīng)離心后,細(xì)胞懸液制備涂片,瑞氏染色進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。共計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞,分別計(jì)算巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.4 肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)33陽性細(xì)胞的檢測(cè)

肺組織切片經(jīng)剛果紅染色后,進(jìn)行嗜酸性粒細(xì)胞的計(jì)數(shù);經(jīng)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肺組織中IL-33的表達(dá)。

1.2.5 遲緩愛德華菌及其成分作用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

A549細(xì)胞、MLE12細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞為貼壁生長的細(xì)胞,用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 的DMEM培養(yǎng)基;THP-1細(xì)胞為懸浮生長的細(xì)胞,用含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的PRMI 1640培養(yǎng)基,用于細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)前需加入100 ng/mL的佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)誘導(dǎo)分化,成為貼壁細(xì)胞;以上細(xì)胞均在37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2條件下培養(yǎng)。將計(jì)數(shù)后的細(xì)胞懸液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)24 h后,更換無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h,分別加入遲緩愛德華菌滅活菌體、細(xì)菌裂解物和細(xì)菌培養(yǎng)上清進(jìn)行刺激,作用12 h和24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)BALF和細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性細(xì)胞因子的含量

BALF和細(xì)胞培養(yǎng)上清按適宜比例稀釋后,應(yīng)用商品化ELISA試劑盒檢測(cè)炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的含量,按照試劑說明書操作,全波長酶標(biāo)儀(Perkin Elmer,美國)檢測(cè)450 nm波長下的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 遲緩愛德華菌引起氣道內(nèi)炎癥反應(yīng)

遲緩愛德華菌菌體、裂解物和培養(yǎng)上清分別作用于呼吸道,檢測(cè)BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量和促炎細(xì)胞因子的濃度,結(jié)果顯示四組間各炎性細(xì)胞數(shù)量和促炎細(xì)胞因子水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,裂解物和培養(yǎng)上清刺激組中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.05),而滅活菌體組未見明顯改變(P>0.05)(圖1A、B、D);只有裂解物組嗜酸性粒細(xì)胞顯著增加(P<0.05)(圖1C);同時(shí),裂解物組和培養(yǎng)上清組促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05),滅活菌體組未見顯著升高(P>0.05)(圖1E、F、G)。

圖1 BALF炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子檢測(cè)Fig.1 Differential counting of cells and detecting proinflammatory cytokines in BALF

2.1 遲緩愛德華菌刺激小鼠肺部表達(dá)IL-33細(xì)胞變化

在BALF細(xì)胞因子的檢測(cè)中,各組均未檢出IL-33。為進(jìn)一步探討肺組織中表達(dá)IL-33的細(xì)胞是否會(huì)增加,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺部IL-33的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,四組間肺組織中IL-33+細(xì)胞數(shù)量和百分比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較顯示,與對(duì)照組相比,滅活菌體可刺激肺組織中IL-33+細(xì)胞數(shù)量和百分比明顯增加(P<0.05);裂解物組IL-33+細(xì)胞數(shù)量和百分比均有下降(P>0.05),培養(yǎng)上清組IL-33+細(xì)胞數(shù)量有增加的趨勢(shì)(P>0.05),但百分比略有下降趨勢(shì)(P>0.05)(圖2B、C),可能與肺組織大量炎癥細(xì)胞浸潤有關(guān)。

圖2 遲緩愛德華菌誘導(dǎo)肺組織IL-33+細(xì)胞變化Fig.2 Variation of IL-33+ cells in the lung tissue induced by Edwardsiella tarda

2.3 遲緩愛德華菌刺激肺部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤

肺組織中IL-33的表達(dá)增加,是否會(huì)引起肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤。結(jié)果顯示,四組間肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤情況差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較顯示,與對(duì)照組相比,滅活菌體組和培養(yǎng)上清組嗜酸性粒細(xì)胞浸潤顯著增加(P<0.05),裂解物刺激組則未見明顯改變(P>0.05)(圖3A、B、C)。

圖3 遲緩愛德華菌誘導(dǎo)肺組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤Fig.3 Infiltration of eosinophil in the lung tissue induced by Edwardsiella tarda

2.4 遲緩愛德華菌刺激小鼠氣道細(xì)胞炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生增多

為進(jìn)一步明確BALF中炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生來源,應(yīng)用遲緩愛德華菌作用于呼吸道上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。結(jié)果顯示,作用于小鼠呼吸道上皮細(xì)胞(圖4A、B、C),細(xì)菌裂解物刺激組細(xì)胞培養(yǎng)上清中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)均明顯增加,且顯著高于其他刺激組(P<0.05);滅活菌體不能刺激MLE12細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子(P>0.05);細(xì)菌培養(yǎng)上清僅能上調(diào)小鼠上皮細(xì)胞IL-6的表達(dá)(P<0.05)(圖4B)。作用于小鼠巨噬細(xì)胞,細(xì)菌裂解物刺激組促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)均增加且IL-1β顯著高于其他各組(P<0.05);細(xì)菌培養(yǎng)上清刺激組IL-6和TNF-α表達(dá)顯著增加(P<0.05);滅活菌體刺激組細(xì)胞上清中未檢測(cè)到IL-1β和IL-6,但TNF-α的表達(dá)異常顯著(P<0.05)(圖4D、E、F)。

圖4 遲緩愛德華菌對(duì)小鼠氣道細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Edwardsiella tarda on expression of proinflammatory cytokines by murine airways epithelial cells and macrophages

2.5 遲緩愛德華菌刺激人氣道細(xì)胞炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生增多

為明確遲緩愛德華菌對(duì)小鼠模型及細(xì)胞的炎癥作用在人源細(xì)胞也存在,應(yīng)用遲緩愛德華菌滅活菌體、裂解物和培養(yǎng)上清作用于人肺泡上皮細(xì)胞和人單核-巨噬細(xì)胞。結(jié)果顯示,在上皮細(xì)胞受到作用后,各刺激組細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-6表達(dá)均顯著增加(P<0.05),細(xì)菌裂解物刺激組細(xì)胞上清中IL-6表達(dá)增加明顯高于其他各組(P<0.05)(圖5A);各組均未能檢測(cè)到IL-1β的表達(dá)。作用于人巨噬細(xì)胞,各刺激組細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-1β和IL-6表達(dá)均增加(P<0.05)(圖5B、C)。

圖5 遲緩愛德華菌對(duì)人氣道細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Edwardsiella tarda on expression of proinflammatory cytokines by human airways epithelial cells and macrophages

3 討論

COPD是我國第三大死亡原因,是近年國家重點(diǎn)關(guān)注的重大慢病之一。該疾病具有高度的異質(zhì)性,不同臨床類型的患者具有不同的病理生理改變、治療反應(yīng)及疾病進(jìn)展,慢性阻塞性肺疾病全球倡議2023年版(Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease,GOLD2023)[11]提出了基于危險(xiǎn)因素的COPD分型,將感染相關(guān)COPD單列一類。COPD急性加重主要與感染因素有關(guān)。目前已報(bào)道[12],從COPD患者呼吸道標(biāo)本最常檢出的細(xì)菌是變形菌門流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等和厚壁菌門肺炎鏈球菌等。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)變形菌門遲緩愛德華菌僅在COPD急性加重期患者中檢出。遲緩愛德華菌是一種革蘭陰性兼性厭氧菌,屬腸桿菌科愛德華菌屬,宿主廣泛,多感染水生魚類、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物等[13],且是其菌屬中唯一能夠感染人類的細(xì)菌[14],但有關(guān)人類疾病的研究多局限于病例報(bào)道,少有深入的機(jī)制研究。為此,本研究初步探討了遲緩愛德華菌不同組分對(duì)肺部炎癥的作用。

COPD以肺部持續(xù)性炎癥反應(yīng)為主要特征。氣道中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量以及促炎細(xì)胞因子水平的增加與COPD的急性加重和嚴(yán)重程度直接相關(guān)[12, 15]。已有研究[16]報(bào)道肺炎鏈球菌經(jīng)鼻感染香煙煙霧暴露小鼠,可進(jìn)一步誘導(dǎo)肺損傷和導(dǎo)致肺氣腫發(fā)展。研究[17]表明流感病毒和流感嗜血桿菌合并感染誘導(dǎo)COPD小鼠急性加重,促進(jìn)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞在肺部募集。金黃色葡萄球菌慢性定植的肺氣腫小鼠的肺功能下降、組織損傷及中性粒細(xì)胞浸潤程度比其他呼吸道條件致病菌更顯著且其代謝產(chǎn)物同型半胱氨酸加速COPD肺功能下降[18]。本文研究結(jié)果可見遲緩愛德華菌不同組分作用有所差異,其中裂解物和代謝物滴鼻組可明顯誘導(dǎo)小鼠氣道中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增加。值得注意的是遲緩愛德華菌菌體和代謝物可引起肺部嗜酸性粒細(xì)胞的增加,而細(xì)菌裂解物刺激可誘導(dǎo)BALF中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量增加。有研究[19]表明COPD患者急性加重期氣道嗜酸性粒細(xì)胞水平升高尤為明顯,嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)升高是與哮喘和COPD患者預(yù)后較差相關(guān)的炎癥標(biāo)志物[20],與頻繁急性加重和疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)[21]。研究[22-23]表明炎癥介質(zhì)驅(qū)動(dòng)的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥在COPD中發(fā)揮作用,且嗜酸性粒細(xì)胞可通過組織蛋白酶L促進(jìn)肺基質(zhì)破壞和肺氣腫。因此,遲緩愛德華菌引起肺部及氣道嗜酸性粒細(xì)胞增加可能參與COPD進(jìn)展。IL-33可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞增加[24],筆者課題組已發(fā)表數(shù)據(jù)[25]顯示,IL-33可促進(jìn)抗自身肺組織抗體的產(chǎn)生。本文研究顯示遲緩愛德華菌僅滅活菌體滴鼻可引起肺部IL-33+細(xì)胞的增加,但嗜酸性粒細(xì)胞的增加是否與肺部IL-33表達(dá)增加相關(guān),以及IL-33產(chǎn)生是否可誘導(dǎo)此條件下的自身抗體產(chǎn)生,繼而參與COPD的發(fā)生發(fā)展,尚待進(jìn)一步深入研究。

已知IL-1β、IL-6和TNF-α在COPD患者肺部持續(xù)性炎癥反應(yīng)和疾病的惡化中發(fā)揮著重要的作用[26-27]。IL-1β和IL-6可以通過促進(jìn)抗原呈遞、炎癥細(xì)胞活化和參與基質(zhì)降解酶的表達(dá)來激活免疫系統(tǒng)并促進(jìn)急性炎癥反應(yīng)[28]。本文研究顯示滴注遲緩愛德華菌不同組分可刺激小鼠氣道促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)增加。體外實(shí)驗(yàn)也證明遲緩愛德華菌菌體、裂解物和代謝物可刺激人和小鼠呼吸道上皮細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞不同程度表達(dá)IL-1β、IL-6和TNF-α。因此,遲緩愛德華菌可誘導(dǎo)氣道細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子參與肺部炎癥反應(yīng)。

已有研究[16]報(bào)道肺炎鏈球菌經(jīng)鼻感染香煙煙霧暴露小鼠,可進(jìn)一步誘導(dǎo)肺損傷和導(dǎo)致肺氣腫發(fā)展。本文研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明遲緩愛德華菌能夠造成肺部急性損傷,可能通過中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞以及多種促炎細(xì)胞因子介導(dǎo),在COPD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。結(jié)果也顯示,不同成分誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)存在差異。因此,進(jìn)一步深入研究遲緩愛德華菌何種自身菌體成分或代謝產(chǎn)物主要誘導(dǎo)肺部炎癥損傷及其損傷機(jī)制,有助于揭示呼吸道遲緩愛德華菌在COPD加重中的作用,可能為COPD的診斷提供一個(gè)新的檢測(cè)指標(biāo),同時(shí)也為COPD急性加重的治療提供新的證據(jù)和思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明李琴:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)研究,數(shù)據(jù)分析,撰寫文章;胡悅:實(shí)驗(yàn)研究,分析數(shù)據(jù),文章撰寫;秦嘯峰、馮志紅:技術(shù)支持;孫英、王煒:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),審訂論文。