夏妙然 周 航 王達祎 陳 萍

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學系,北京 100069)

哺乳動物的免疫系統(tǒng)保護宿主免受病原微生物的侵害,但是過強的免疫反應,會導致自身免疫疾病,對宿主造成嚴重的損害。在哺乳動物體內(nèi),一些T細胞會積極抑制異?；蜻^度的免疫反應,這類細胞稱為調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)。Treg根據(jù)來源可分為兩類:①胸腺來源的Treg(thymus-derived Treg cells,tTreg),直接從胸腺CD4+T細胞分化而來[1];②外周來源的Treg(peripherally derived Treg cells,pTreg),由次級淋巴器官中的初始T細胞在TGF-β作用下經(jīng)抗原刺激分化而來[2]。Treg在發(fā)育成熟后離開胸腺進入外周淋巴器官,成為靜息狀態(tài)的Treg(naive-like central Treg cell,cTreg),其特點為高表達歸巢型受體L-選擇素(CD62L)或CC趨化因子受體7(CC chemokine receptor 7, CCR7)。在抗原刺激下,cTreg可激活分化為活化狀態(tài)的效應Treg(activated effector Treg cell,eTreg),其CD62L表達下調(diào),高表達激活性標志物CD44分子[3-4]。與cTreg相比,eTreg表達更高水平的Treg效應分子,如細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)和誘導性協(xié)同共刺激分子(inducible co-stimulatory molecule,ICOS),有助于增強其免疫抑制功能,對維持體內(nèi)免疫平衡和免疫耐受發(fā)揮著重要作用[5]。

Treg的發(fā)育及功能行使依賴于叉頭框蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子P3(forkhead box protein P3,Foxp3)的表達[6]。此外,已有報道揭示多種表觀遺傳調(diào)控分子在其譜系分化和維持中發(fā)揮重要作用,如NFAT[7]、NF-κB[8]和AML1[9]。Lsd1是第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶[10],其可以脫去組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)或第9位賴氨酸(H3K9)上的一甲基或二甲基化修飾,從而發(fā)揮抑制或增強基因表達的作用。Lsd1在許多惡性腫瘤中異常表達,如前列腺癌[11]、乳腺癌[12]、非小細胞肺癌[13]等。Lsd1被認為是多種癌癥的有效治療靶點[14],并且能增強免疫檢查點阻斷劑的抗腫瘤效果。最近的研究[15]表明,Lsd1也調(diào)控T細胞的發(fā)育及功能。在小鼠早期未成熟T細胞中敲除Lsd1,會引起胸腺中雙陽性T細胞(CD4+CD8+)及CD4單陽性T細胞減少。此外,在胸腺單陽性T細胞中敲除Lsd1,可以維持外周終末分化的殺傷性CD8+T細胞數(shù)量,從而促進結(jié)腸癌程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein-1,PD-1)抑制劑的免疫治療效果[16]。而Lsd1對Treg的發(fā)育及分化是否有調(diào)控作用,目前尚無系統(tǒng)性的證據(jù)。

本文研究通過將Lck-Cre工具鼠與Lsd1fl/fl小鼠雜交,繁育出在早期未成熟T細胞中特異性敲除Lsd1的小鼠(Lsd1fl/flLck-Cre)。通過流式細胞術檢測胸腺及外周免疫器官(脾、淋巴結(jié))中Foxp3+Treg細胞的比例及數(shù)量,并分析其中eTreg/cTreg的比例,來探究Lsd1對Treg發(fā)育及活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Lsd1fl/fl小鼠和Lck-Cre小鼠由首都醫(yī)科大學地壇醫(yī)院傳染病研究所王璽教授課題組惠贈。Lsd1fl/fl小鼠是在Lsd1基因5號和6號外顯子兩側(cè)插入floxp序列的C57BL/6背景小鼠[17],Lck-Cre小鼠是Lck基因啟動子驅(qū)動Cre酶表達的C57BL/6背景小鼠[18]。將成年Lsd1fl/fl小鼠和Lck-Cre小鼠連續(xù)雜交篩選,獲得在早期CD4-CD8-T細胞中特異性敲除Lsd1的小鼠(Lsd1fl/flLck-Cre,KO),將同窩非敲除小鼠作為對照組小鼠(control,Ctrl),選取6～8周齡小鼠用于實驗。小鼠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物部動物飼養(yǎng)室,所有操作均經(jīng)過首都醫(yī)科大學動物實驗與實驗動物管理委員會審查批準(批準文號:AEEI-2023-084)。實驗動物使用許可證號: SYXK(京)2018-0003。

1.2 主要試劑

CD4 monoclonal antibody-Alexa Fluor700(56-0042-82)購自美國eBioscince公司,Ghost Dye Violet 510(13-0870-T100)、Purified anti-mouse CD16/CD32(70-0161-U500)、RBC lysis buffer(TNB-4300-L100)、Foxp3/Transcription factor staining buffer kit(TNB-0607)均購自美國Tonbo Biosciences公司,PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse CD8a(551162)、FITC rat anti-mouse CD44(553133)購自美國BD Biosciences公司, Brilliant Violet 421 anti-mouse CD62L antibody(104436)、PE anti-mouse Foxp3 antibody(126404)購自美國Biolegend公司。Histone H3 antibody(9715)、LSD1 antibody(2139)購自美國CST公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠基因型鑒定

剪取3周齡新生鼠鼠尾(2～4 mm)加入75 μL堿液(25 mmol/L NaOH,0.2 mmol/L EDTA),99 ℃加熱30 min裂解。每管加入75 μL酸液(40 mmol/L Tris-HCl)中和,混勻,即獲得小鼠DNA。以此為模板,分別使用針對Lsd1基因floxp位點引物及針對Lck-Cre基因引物(表1)進行多重聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction, PCR)擴增,擴增產(chǎn)物使用1.5%(質(zhì)量分數(shù))的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.2 蛋白印跡(Western blotting)

分別取6～8周齡對照組和敲除組小鼠,處死后分離胸腺,在200目篩網(wǎng)研磨,制備成單細胞懸液,加入紅細胞裂解液室溫下裂解5 min,使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌,300g離心7 min。棄掉上清,用Buffer A[10 mmol/L HEPES pH 7.9,10 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,0.34 mol/L Sucrose,10% (體積分數(shù))Glycerol,1 mmol/L DTT,0.1%(體積分數(shù))Triton X-100]重懸,冰上放置5 min,然后4 ℃ 1300g離心4 min,沉淀為細胞核,用蛋白上樣緩沖液重懸細胞核,超聲至溶液不再黏稠,置于金屬浴95 ℃煮5 min。配制12%(質(zhì)量分數(shù))的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyac-rylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠,之后進行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉封閉。用H3和Lsd1一抗4 ℃孵育過夜,TBST緩沖液(tris-buffered saline tween-20)洗膜3次,兔二抗室溫孵育1 h,TBST再次洗膜3次,使用Amersham Image Quant 800曝光分析。

1.3.3 淋巴器官指數(shù)測定

稱量小鼠體質(zhì)量,采取頸椎脫臼法處死小鼠。取腹股溝淋巴結(jié)及腋窩下淋巴結(jié)后,打開小鼠胸腔取出胸腺,打開腹腔取出脾,在PBS緩沖液中清洗,置于吸水紙上吸干水分,電子天平稱質(zhì)量。免疫器官指數(shù)按以下公式計算:臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/動物體質(zhì)量(g)。

1.3.4 流式細胞術

選取 6～8 周齡的對照組和敲除組小鼠各3只,分離胸腺、脾和淋巴結(jié),在200目篩網(wǎng)研磨,分別制備成單細胞懸液,紅細胞裂解液室溫裂解5 min,PBS洗滌并計數(shù)。每只小鼠分別取2×106個細胞進行染色。先使用Ghost Dye Violet 510染料室溫避光染色15 min,用以區(qū)分死細胞,洗滌后加入Anti-Mouse CD16/CD32封閉,4 ℃避光孵育5 min。隨后加入抗體(anti-CD4、anti-CD8、anti-CD62L、anti-CD44),室溫避光染色15 min,洗滌2次。用商品化試劑Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit進行固定及打孔,加入PE anti-mouse Foxp3抗體,室溫避光孵育45 min,洗滌、重懸后使用BD Fortessa流式細胞儀進行分析,分析并統(tǒng)計每只小鼠的流式結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定

每只小鼠分別用針對Lck-Cre基因和Lsd1基因的引物進行檢測。對于Lck-Cre基因,在350 bp處出現(xiàn)明顯條帶的為陽性(圖1A中2、3、4、5號)。帶有floxp位點的等位基因擴增產(chǎn)物條帶位于169 bp(Lsd1-fl),不帶有floxp位點的等位基因擴增產(chǎn)物位于136 bp(Lsd1-wt);故圖中1號、3號Lsd1基因型為Lsd1fl/wt,2號、4號為Lsd1wt/wt,5號為Lsd1fl/fl。綜合兩個基因鑒定結(jié)果,圖1中5號小鼠為敲除組小鼠,基因型為Lsd1fl/flLck-Cre。Lck啟動子誘導的Cre酶可在胸腺未成熟雙陰性(CD4-CD8-)T細胞中特異性表達[18],切割帶有floxp位點的Lsd1基因序列,從而獲得在未成熟T細胞中特異性敲除Lsd1的小鼠。筆者利用Western blotting實驗檢測了對照組和敲除組小鼠胸腺細胞中Lsd1的表達量(圖1B),在敲除組小鼠胸腺細胞中幾乎檢測不到Lsd1的表達。

圖1 小鼠基因型鑒定及Lsd1表達水平檢測Fig.1 Genotype identification of mice and detection of Lsd1 expression level

2.2 敲除T細胞中Lsd1使小鼠胸腺萎縮

取敲除組小鼠和同窩對照小鼠各三只,取每只小鼠的胸腺、脾及腹股溝和腋窩下淋巴結(jié),稱質(zhì)量并拍照。與對照組相比,敲除組小鼠的胸腺明顯萎縮(圖2A),而其脾及淋巴結(jié)的大小(圖2A)無明顯區(qū)別。敲除組小鼠胸腺指數(shù)降低,但組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),胸腺細胞總數(shù)較對照組顯著降低(圖2B)。兩組小鼠脾、淋巴結(jié)的質(zhì)量及細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(圖2C、2D)。以上結(jié)果說明在未成熟T細胞中特異性敲除Lsd1可導致小鼠胸腺萎縮,但不影響外周免疫器官(脾、淋巴結(jié))的細胞總數(shù)。

圖2 Lsd1敲除對胸腺、脾及淋巴結(jié)質(zhì)量和細胞數(shù)的影響Fig.2 Effect of Lsd1 knockout on weight and cell numbers of thymus, spleen, and lymph nodes

2.3 敲除T細胞中Lsd1后小鼠胸腺中Treg的比例和數(shù)量明顯增加

采用流式細胞術分析對照組及敲除組小鼠胸腺細胞亞群(圖3A),結(jié)果顯示,與對照組相比,CD8單陽性T細胞數(shù)量有輕微下降但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而CD4單陽性T細胞數(shù)量顯著下降(P<0.05)(圖3B)。但敲除組小鼠胸腺Foxp3+Treg占CD4單陽性T細胞亞群的比例明顯上升(P<0.05)(圖3C),且占總胸腺細胞數(shù)的比例及絕對數(shù)也顯著增加(P<0.05)(圖3D)。這提示在胸腺早期T細胞中特異性敲除Lsd1促進了CD4+T細胞向Treg方向的發(fā)育。

圖3 小鼠胸腺T細胞亞群分析Fig.3 Analysis of thymic T cell subsets of mice

2.4 Lsd1敲除后小鼠外周eTreg的比例明顯增加

提取敲除組和對照組小鼠脾和淋巴結(jié)中的淋巴細胞,通過流式細胞術檢測,與對照組相比,敲除組脾(圖4A)和淋巴結(jié)(圖4B)CD4+T細胞的比例明顯減少(P<0.05)。Treg占CD4+T細胞的比例仍然升高,但升高幅度不及胸腺Treg,絕對數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖4C、4D)。以CD44及CD62L作為標志物,敲除組小鼠脾及淋巴結(jié)中eTreg(CD44+CD62Llo)的比例增加,cTreg(CD44loCD62L+)的比例降低,eTreg/cTreg比例顯著上升(P<0.05)(圖5A、5B)。不僅如此,對于脾及淋巴結(jié)中的cTreg亞群,其在Lsd1敲除后表達激活性分子CD44水平也顯著升高(P<0.05),而表達CD62L水平顯著降低(P<0.05)(圖5C、5D)。以上結(jié)果提示敲除T細胞中的Lsd1能夠促進小鼠脾和淋巴結(jié)中Treg的激活。

圖4 小鼠脾和淋巴結(jié)中Treg分析Fig.4 Analysis of Treg in mouse spleen and lymph nodes

圖5 小鼠脾和淋巴結(jié)中eTreg/cTreg分析Fig.5 Analysis of eTreg/cTreg in mouse spleen and lymph nodes

3 討論

在本研究中,在早期胸腺T細胞中敲除組蛋白去甲基化酶Lsd1后,小鼠胸腺明顯萎縮、細胞數(shù)顯著減少。雖然外周免疫器官(脾臟、淋巴結(jié))細胞數(shù)無明顯差異,但其中T細胞比例及數(shù)量均顯著降低。以上提示Lsd1在維持正常T細胞發(fā)育及數(shù)量的過程中發(fā)揮著至關重要的作用。在一項利用Cd2-Cre工具酶敲除Lsd1的研究[15]中,也發(fā)現(xiàn)了類似的胸腺及外周的Treg數(shù)量減少的現(xiàn)象。在本文研究中,雖然胸腺中CD4+T細胞數(shù)量下降明顯,但Treg比例及細胞數(shù)卻顯著上升,這提示Lsd1的敲除促進了CD4+T細胞向Treg方向的分化。報道[15]顯示,Lsd1敲除后,胸腺細胞中干擾素通路上調(diào),外周淋巴結(jié)CD8+T細胞呈現(xiàn)天然記憶(innate-memory)狀態(tài),胸腺及外周的Treg表面免疫檢查點受體(PD-1、CTLA-4、Nrp1等)表達升高。筆者推測,這種在未成熟階段過早活化的狀態(tài),有可能導致T細胞反饋性上調(diào)抑制性分子的表達并促進抑制性Treg細胞的生成。但Lsd1如何調(diào)控這一通路并影響T細胞發(fā)育,還有待研究。

在敲除組小鼠的外周免疫器官,Treg占CD4+T細胞比例同樣顯著升高。但由于在胸腺萎縮的情況下,外周的Treg數(shù)量也顯著減少,最終計算出外周脾及淋巴結(jié)Treg的絕對數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。在生理狀態(tài)下,Treg在抗原刺激后向eTreg方向分化[19]。本文研究中,敲除組小鼠的外周eTreg比例顯著升高,cTreg的比例顯著降低,且cTreg表面激活性受體CD44的表達水平也顯著升高,提示其也正在向激活狀態(tài)轉(zhuǎn)化,這可能也與上文中提及的過早激活的干擾素信號有關。此外,eTreg的增殖及歸巢能力均低于cTreg[3],且cTreg本身歸巢受體CD62L表達水平顯著降低,這也可能是外周免疫器官中Treg細胞數(shù)沒有明顯升高的原因之一。

在Treg細胞分化發(fā)育過程中,轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是必不可少的。值得一提的是,有文獻[20]報道,Foxp3能夠招募CoREST復合體抑制Treg中IFN-γ及IL-2等靶基因的轉(zhuǎn)錄。CoREST復合體由核心組分Rcor1及組蛋白去乙?；窰dac1/2和組蛋白去甲基化酶Lsd1共同構(gòu)成[21]。在Treg中特異性敲除CoREST復合體核心組分Rcor1會損害Treg細胞功能,外周淋巴組織中Treg比例有微弱的數(shù)量減少,且Treg分泌IFN-γ及IL-2增多。在此報道[20]中,Rcor1敲除后胸腺Treg細胞比例不受影響,其外周Treg的激活也變化不大。雖然同樣也是CoREST復合體的組成成分之一,在本文研究中,Lsd1條件性敲除對Treg的影響更大。一方面,這可能是由于該研究[20]中僅用Foxp3-Cre工具酶在Treg細胞中進行基因敲除,而本文實驗中敲除Lsd1的階段更早,因此對其分化發(fā)育影響更大。另一方面,這也提示Lsd1還參與調(diào)控其他的通路和靶基因。

Treg在建立并維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著關鍵作用[22]。其主要通過直接接觸或分泌TGF-β、IL-10等細胞因子的方式負調(diào)控免疫應答[22]。Treg的缺失及功能低下與多種自身免疫性疾病相關。本文研究表明抑制Lsd1有助于促進Treg的發(fā)育及活化。有研究[23]發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞中敲除Lsd1能抑制細胞功能并改善類風濕性關節(jié)炎小鼠模型的嚴重程度。當前,Lsd1抑制劑在腫瘤治療中的應用已有廣泛研究[14],本文研究提示其在自身免疫病的治療中也具有潛在的應用價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明夏妙然、周航:負責實驗設計與操作,撰寫與修改論文;王達祎:參與實驗操作;陳萍:修改與審定論文。