賈煥珍 焦 潔 高 歌#* 楊 慧#*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室,北京 101321;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系 北京腦重大疾病研究院帕金森病研究所 北京市神經(jīng)再生修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100069)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是第二大神經(jīng)退行性疾病,其主要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性、丟失及殘存神經(jīng)元中路易體的形成。PD除了出現(xiàn)肌僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、姿勢(shì)步態(tài)異常等運(yùn)動(dòng)癥狀外,還出現(xiàn)嗅覺障礙、便秘、快速動(dòng)眼睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)障礙,并且非運(yùn)動(dòng)癥狀出現(xiàn)早于運(yùn)動(dòng)癥狀10～20年,當(dāng)患者出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)癥狀后,其疾病已經(jīng)到不可挽回的地步,因此對(duì)于PD的早期診斷和治療顯得尤為重要。α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)是PD患者腦中路易體的主要成分,對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展起到關(guān)鍵作用。在生理?xiàng)l件下,α-syn不僅存在于黑質(zhì)、丘腦、皮質(zhì)和海馬以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,也在心臟、肌肉等外周組織中表達(dá)。它能結(jié)合突觸囊泡并調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,在突觸功能和可塑性中起重要作用[1],它能促進(jìn)囊泡與細(xì)胞膜結(jié)合,維持線粒體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài),增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜之間的相互作用[2]。而在病理狀態(tài)下,α-syn失去其天然結(jié)構(gòu)并聚集成富含β片的原纖維殘基, 第5～8、14～31和50～57氨基酸決定原纖維生長(zhǎng)速率[3]。許多因素會(huì)影響α-syn聚集,包括環(huán)境、點(diǎn)突變、C末端截?cái)嗪头g后泛素化、磷酸化和硝化等修飾[4],其聚集和傳播在疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。因此,α-syn可以作為PD的潛在診斷生物標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)以及疾病進(jìn)程的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

針對(duì)α-syn的特異性抗體是用于α-syn作為生物標(biāo)志物的試劑盒的制備、PD的免疫治療,以及發(fā)病機(jī)制的探索必不可少的。α-syn由140個(gè)氨基酸組成,由于其N端有一個(gè)跨膜序列,能與膜結(jié)構(gòu)結(jié)合,因此,被認(rèn)為是其發(fā)揮毒性作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。此外,由于α-syn的C端結(jié)構(gòu)域的129絲氨酸的磷酸化作為PD的毒性形式,增加毒性α-syn聚集和傳播[5],針對(duì)N端的抗體可以避開129位磷酸化的位點(diǎn),可以用作雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)中的捕獲抗體捕獲α-syn,為識(shí)別129 位絲氨酸磷酸化的抗體留出抗原識(shí)別表位。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功研發(fā)針對(duì)129位絲氨酸磷酸化的單克隆抗體[6]。因此,本課題組制備了針對(duì)其N端的α-syn抗體,并進(jìn)行了抗體效價(jià)的初步篩選和鑒定,為PD的發(fā)病機(jī)制的研究和治療提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Thy1-α-syn轉(zhuǎn)基因小鼠(Line 15)購(gòu)于美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào):0214AX18,雄性,月齡:9個(gè)月。小鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為2組:轉(zhuǎn)基因小鼠組(Thy1-α-syn transgenic mice,TG)及同窩對(duì)照野生小鼠組(wild-type mice, WT)。動(dòng)物倫理審查文件編號(hào)(AEEI-2020-017)。

1.2 抗體制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期制備單克隆抗體的方法[6],篩選出克隆號(hào)為1C16、2B8、2P21、3O18和1J6這5種單克隆抗體。簡(jiǎn)述如下:使用N端序列內(nèi)肽段(Ac-TKEGVVHGVAT-NH2)行皮下免疫BALB/c小鼠,選擇小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0)融合成雜交瘤細(xì)胞,采用間接酶聯(lián)免疫吸附法初步篩選出5株可識(shí)別免疫肽段的單克隆抗體用于后續(xù)驗(yàn)證。

1.3 試劑

大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)Tiangen公司;抗α-syn抗體購(gòu)于美國(guó)Santa cruz公司; 抗β-actin抗體購(gòu)于中國(guó)華安生物公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司;考馬斯亮藍(lán)染液購(gòu)于美國(guó)Biotium公司;SepharoseTM4B Beads購(gòu)于美國(guó)GE公司;聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)、硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC)和超濾管購(gòu)于美國(guó)Millipore公司;5×上樣緩沖液、放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay, RIPA)全細(xì)胞裂解液購(gòu)于中國(guó)普利萊公司;人凝血酶購(gòu)于中國(guó)Solarbio公司;異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;明膠購(gòu)于北京化工廠。

1.4 蛋白純化

實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)成功構(gòu)建了人源谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)-α-syn蛋白(human-α-syn,h-α-syn)的融合蛋白重組質(zhì)粒 pEGX-4T-1-h-α-syn[7],以及鼠源α-syn蛋白(mouse-α-syn,m-α-syn)、β-syn蛋白、人源α-syn/N蛋白、人源α-syn/ΔN端蛋白重組質(zhì)粒,根據(jù)文獻(xiàn)[8-9]的方法對(duì)這5種蛋白重組質(zhì)粒進(jìn)行體外純化。簡(jiǎn)述如下:IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒,裂解菌體后提取重組蛋白,使用人凝血酶行GST標(biāo)簽切割,經(jīng)純化柱洗脫,收集蛋白樣品,分別得到單體h-α-syn純蛋白、m-α-syn純蛋白、β-syn純蛋白、h-α-syn/N純蛋白、h-α-syn/ΔN端純蛋白,經(jīng)濃縮柱濃縮。

1.5 考馬斯亮藍(lán)染色

將體外純化后的5種蛋白加入Loading buffer后,行12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),結(jié)束后的凝膠浸沒在裝有考馬斯亮藍(lán)染液的暗盒中,水平搖床上孵育1 h,隨后用洗脫液洗去非特異結(jié)合,使用Gel DocTMEM Imager儀器(美國(guó)Bio-Rad公司)拍攝結(jié)果。

1.6 斑點(diǎn)印跡法(Dot blotting)檢測(cè)

使用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)將各種重組蛋白稀釋成100 ng/μL,取1 μL滴于0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))明膠包被的NC膜上,常溫晾干,用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶封閉1.5 h,三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽(triethanolamine buffered saline,TBS)/tween 20(T)洗膜3次,每次5 min。加入一抗,于孵育盒內(nèi)4 ℃ 孵育過夜,TBS/T洗膜3次,加入熒光二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,TBS/T洗膜3次,Odyssey掃描儀(美國(guó)LI-COR公司)成像。

1.7 蛋白印跡法檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)

冰上取小鼠皮質(zhì),加入RIPA裂解液后冰上孵育30 min,行超聲裂解。4 ℃ 12 000g離心30 min,取上清使用BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度,進(jìn)行12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) SDS-PAGE電泳,半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶孵育1 h,一抗于4 ℃ 孵育過夜,TBS/T洗膜3次,加入熒光二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,TBS/T洗膜3次,Odyssey掃描儀成像。

2 結(jié)果

2.1 制備h-α-syn、m-α-syn、β-syn、α-syn/N、α-syn/ΔN蛋白

α-syn分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖1A),N端是指1～60氨基酸(1～60 aa),非β淀粉樣結(jié)構(gòu)(nonamyloid component,NAC)區(qū)是61～90氨基酸(61～90 aa);C端是指91～140氨基酸(91～140 aa)。在大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)h-α-syn質(zhì)粒、m-α-syn質(zhì)粒、β-syn質(zhì)粒、α-syn/N質(zhì)粒和α-syn/ΔN質(zhì)粒后,誘導(dǎo)表達(dá)后提純的蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色(圖1B),結(jié)果顯示,在m-α-syn、h-α-syn和β-syn組的相對(duì)分子質(zhì)量17 000位置出現(xiàn)蛋白條帶,說明α-syn蛋白和β-syn蛋白純化成功。α-syn/N和α-syn/ΔN蛋白條帶的相對(duì)分子質(zhì)量分別在9 000和13 000。結(jié)果說明這5種形式的蛋白純化成功,可以用作標(biāo)準(zhǔn)抗原檢測(cè)抗體的效價(jià)。

圖1 體外制備不同的α-syn蛋白全長(zhǎng)及結(jié)構(gòu)域Fig.1 Preparation of full length and different domains of α-syn protein in vitro

2.2 初步篩選識(shí)別h-α-syn全長(zhǎng)和α-syn/N蛋白的抗體及效價(jià)檢測(cè)

免疫小鼠的肽段序列為:TKEGVVHGVAT(圖2A),其位于α-syn的第44～54個(gè)氨基酸,即N端結(jié)構(gòu)域內(nèi)序列。取h-α-syn(100 ng/μL)、m-α-syn(100 ng/μL)、β-syn(100 ng/μL)、α-syn/N-1(100 ng/μL)和α-syn/N-2(150 ng/μL)蛋白,各1 μL滴于NC膜上。Dot blotting結(jié)果顯示了篩選出的單克隆抗體的識(shí)別區(qū)域。結(jié)果顯示,市售的商品化抗體Santa Cruz (sc-69977)作為陽(yáng)性對(duì)照抗體僅識(shí)別h-α-syn和m-α-syn,而不識(shí)別α-syn/N肽段(圖2B膜1)。在不同的稀釋比例下(1∶5 000和1∶10 000)單克隆抗體1C16(1.5 mg/mL)只識(shí)別h-α-syn蛋白全長(zhǎng),不識(shí)別m-α-syn和β-syn(圖2B膜2和3)。單克隆抗體2B8(1.5 mg/mL)在1∶5 000的比例下識(shí)別h-α-syn、m-α-syn和α-syn/N,而在1∶10 000的比例下不再識(shí)別m-α-syn(圖2B膜4和5)。在2種不同的稀釋比例下,單克隆抗體2P21(1.5 mg/mL)也只識(shí)別h-α-syn蛋白全長(zhǎng)(圖2B膜6和7)。單克隆抗體3O18(1.5 mg/mL)在1∶5 000的比例下對(duì)h-α-syn、m-α-syn的識(shí)別比較弱,但是對(duì)α-syn/N的識(shí)別比較強(qiáng),而在1∶10 000的比例下僅對(duì)α-syn/N有微量識(shí)別(圖 2B膜8和9)。在1∶5 000的比例下,單克隆抗體1J6(1.5 mg/mL)識(shí)別h-α-syn、m-α-syn、β-syn和α-syn/N蛋白,而增加稀釋比例后在1∶10 000的稀釋比例下,1J6僅識(shí)別h-α-syn、m-α-syn和α-syn/N蛋白(圖 2B膜10和11)。結(jié)果顯示1C16只能識(shí)別h-α-syn蛋白全長(zhǎng),1J6是特異性識(shí)別N端α-syn的蛋白,而抗體2B8雖然有類似的結(jié)果,但是它的識(shí)別效率比較低。

圖2 使用Dot blotting方法篩選識(shí)別h-α-syn全長(zhǎng)和α-syn/N蛋白的抗體Fig.2 Using Dot blotting to detect the antibodies that could recognize the full length of h-α-syn and α-syn /N protein

2.3 篩選識(shí)別α-syn/N蛋白和α-syn/ΔN蛋白的抗體

取1 μL的h-α-syn、β-syn、α-syn/N和α-syn/ΔN純蛋白(100 ng/μL)加于NC膜上,用于進(jìn)一步驗(yàn)證各個(gè)抗體的識(shí)別區(qū)域。Dot blotting 結(jié)果顯示:在1∶10 000的稀釋比例下,1C16(1.5 mg/mL)抗體不識(shí)別α-syn/N蛋白,而識(shí)別α-syn/ΔN純蛋白。2B8抗體既識(shí)別全長(zhǎng)α-syn,也識(shí)別α-syn/N蛋白和α-syn/ΔN純蛋白。2P21抗體識(shí)別全長(zhǎng)α-syn和α-syn/ΔN純蛋白。3O18抗體與2B8類似,既識(shí)別全長(zhǎng)α-syn,也識(shí)別α-syn/N蛋白和α-syn/ΔN純蛋白,只是效價(jià)更低。1J6抗體識(shí)別全長(zhǎng)α-syn和α-syn/N蛋白,不識(shí)別α-syn/ΔN蛋白,對(duì)β-syn有比較低的識(shí)別效價(jià)(圖3)。

圖3 篩選識(shí)別α-syn/N結(jié)構(gòu)域和α-syn/ΔN結(jié)構(gòu)域的抗體Fig.3 Screening antibodies to recognize α-syn/N domain and the α-syn/ΔN domain

2.4 在動(dòng)物腦組織中驗(yàn)證1C16和1J6是否能用于Western blotting

Dot blotting實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了1C16和1J6能識(shí)別非變性狀態(tài)下的純蛋白。接下來(lái)驗(yàn)證其是否能識(shí)別變性蛋白。使用1C16檢測(cè)變性處理后的α-syn、β-syn、α-syn/N、 α-syn/ΔN純蛋白(各1 μg)和 TG、WT(各10 μg)小鼠皮質(zhì)提取蛋白,Western blotting結(jié)果顯示,抗體1C16(1∶10 000)孵育后,α-syn純蛋白和TG小鼠樣品組均在17 000的位置出現(xiàn)條帶,在13 000的α-syn/ΔN純蛋白組也出現(xiàn)條帶(圖4A),不識(shí)別變性后的β-syn純蛋白,同一張PVDF膜進(jìn)行β-actin抗體孵育,作為上樣內(nèi)參(圖4B)?？贵w1J6(1∶10 000)僅能識(shí)別變性狀態(tài)下的9 000的α-syn/N純蛋白(圖4C),為了驗(yàn)證上樣量的準(zhǔn)確性,同一張PVDF膜進(jìn)行1C16(1∶10 000)和β-actin抗體孵育,結(jié)果顯示,α-syn純蛋白和TG小鼠樣品組均有存在α-syn(圖4D)。這提示,抗體1C16可以識(shí)別變性的人源的α-syn,而1J6不識(shí)別變性后的全長(zhǎng)α-syn純蛋白。

圖4 使用Western blotting 方法驗(yàn)證1C16和1J6對(duì)變性蛋白的識(shí)別情況Fig.4 Using 1C16 and 1J6 to verify the recognition of denatured proteins by Western blotting

3 討論

α-syn是由140個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),其結(jié)構(gòu)分為N端(1～60 aa),該結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有7個(gè)KTKEGV不完全重復(fù)序列,使α-syn與磷脂具有較高的親和性而易于與富含磷脂的細(xì)胞膜結(jié)合;高度疏水性的NAC區(qū)(61～90 aa),該結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)α-syn聚集過程中纖維結(jié)構(gòu)的形成中起到重要作用; C端(91～140 aa)富含酸性殘基和脯氨酸,產(chǎn)生無(wú)序而靈活的結(jié)構(gòu)域。PD患者腦中路易體內(nèi)主要由全長(zhǎng)α-syn組成,其中90%為129位絲氨酸磷酸化形式的α-syn[10],此外還有少量約10 000～15 000的α-syn各種截短體[11]。α-syn的幾種天然C-末端截短形式(1～119或1～122)可能在促進(jìn)α-syn聚集中及體內(nèi)的纖維生成中起關(guān)鍵作用。在PD患者腦和α-syn轉(zhuǎn)基因小鼠中,發(fā)現(xiàn)C端截短的α-syn積聚在軸突,這與神經(jīng)元功能障礙相關(guān)[12]。

研究者根據(jù)不同的研究目的設(shè)計(jì)了不同的抗體,比如syn-O1、 -O2、 和 -O4和Syn-10H能識(shí)別α-syn的寡聚體,Syn-F1 及Syn-F2是針對(duì)識(shí)別α-syn的纖維而設(shè)計(jì)的抗體[13],1H7、5C1、CT(A1-A6)是識(shí)別α-syn的C端的抗體,值得一提的是,PRX002是第一個(gè)被用于治療PD的抗體藥物[14],NAC32和VH14是針對(duì)NAC區(qū)研發(fā)的抗體,NAC32能降低A53T細(xì)胞株的神經(jīng)毒性[15]。由于N端能與膜結(jié)構(gòu)結(jié)合,因此針對(duì)它的抗體比較少。也有針對(duì)α-syn單一位點(diǎn)的抗體,比如針對(duì)129絲氨酸的磷酸化抗體[6]。本課題組研發(fā)針對(duì)N端的特異性單克隆抗體除了可以探討α-syn引起PD的發(fā)病機(jī)制、免疫治療,還可以用于開發(fā)PD早期診斷試劑盒。N端抗體對(duì)α-syn的特異性捕捉,可以留出引起聚集的NAC結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域,針對(duì)這2個(gè)區(qū)域的大量的抗體可以作為捕獲抗體,可以應(yīng)用在檢測(cè)α-syn和p-α-syn的ELISA診斷試劑盒中。

由于α-syn/N端的TKEGVVHGVAT有更高的表位活性,因此,使用此序列進(jìn)行免疫用于制備單克隆抗體。為了篩選出特異性識(shí)別N端的抗體,不僅純化了人源α-syn全長(zhǎng)蛋白,也純化了m-α-syn蛋白、β-syn蛋白、h-α-syn/N和h-α-syn/ΔN純蛋白,其中α-syn/N(9 000)的條帶與電泳前沿雖然沒有形成明顯的分離,但是膠前沿的條帶是在α-syn/N的下方,因此能證明α-syn/N純蛋白制備成功。在鑒定α-syn/N蛋白的時(shí)候,電泳前沿著色是溴酚藍(lán)作為跑膠的指示劑加入到需要鑒定的蛋白質(zhì)內(nèi)的,而在后期鑒定中Dot blotting實(shí)驗(yàn)并不加入溴酚藍(lán),同樣在Western blotting實(shí)驗(yàn)中使用特異性抗體檢測(cè)目的蛋白,溴酚藍(lán)也不會(huì)著色。因此不會(huì)影響其專一性,也不會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。結(jié)果提示,1J6 可以作為識(shí)別 α-syn /N 的抗體,1C16 和2P21 可以用于識(shí)別 α-syn /ΔN 的抗體,2P21 的效價(jià)較1C16 低。 2B8 和 3O18 抗體不能用于 α-syn 檢測(cè)。Dot blotting 結(jié)果篩選出抗體1J6可以作為識(shí)別α-syn/N,1C16可以用于識(shí)別α-syn/ΔN的抗體。Western blotting 進(jìn)一步驗(yàn)證了這2種抗體對(duì)變性蛋白的識(shí)別情況。結(jié)果提示,抗體1C16可以識(shí)別非變性的人源α-syn純蛋白和小鼠腦組織中的變性的人源α-syn蛋白,不識(shí)別鼠源的α-syn和β-syn?？贵w1J6僅識(shí)別非變性的人源的α-syn及α-syn/N純蛋白, 不識(shí)別變性后的全長(zhǎng)α-syn純蛋白和小鼠腦組織中的變性人源α-syn蛋白,可以用于雙抗夾心的ELISA的捕獲抗體。

綜上,本課題組初步篩選出2種可以應(yīng)用于ELISA和Western blotting檢測(cè)的特異性識(shí)別α-syn/N端結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體及初步效價(jià)檢測(cè),將進(jìn)一步驗(yàn)證其在ELISA檢驗(yàn)及免疫治療中的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明賈煥珍:提出研究思路,研究過程的實(shí)施,整理數(shù)據(jù),撰寫論文;焦?jié)?研究過程的實(shí)施,數(shù)據(jù)整理;高歌、楊慧:提出研究思路,研究的可行性分析,負(fù)責(zé)文章質(zhì)量控制及論文審定。