陳治光 張 巍 何 文

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院超聲科,北京 100070)

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤,約占顱內(nèi)惡性腫瘤的80%,年發(fā)病率約為4.63例/10萬人,自1990年至2016年,其發(fā)病率增加了17.3%[1]。腦膠質(zhì)瘤具有高致殘率和高致死率的臨床特點(diǎn),5年生存率約為5%,給家庭及社會(huì)帶來了極大的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[2-3]。隨著相關(guān)研究的不斷深入,關(guān)于腦膠質(zhì)瘤的治療逐漸精準(zhǔn)化、個(gè)體化。目前主要的治療方式是手術(shù)切除結(jié)合放射治療和化學(xué)治療,但由于血腦脊液屏障、血腫瘤屏障、腫瘤的多形性以及腫瘤的多藥耐藥性,現(xiàn)有方法很難大幅改善腦膠質(zhì)瘤患者的平均生存率[4-5]。聲-壓電動(dòng)力治療作為一種新穎的治療方式,在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中具有顯著的抗腫瘤效果[6]。在本文研究中,筆者基于壓電材料的正壓電效應(yīng),擬通過基于偏氟乙烯(vinylidene fluoride, VDF)和三氟乙烯(trifluoroethylene, TrFE)的共聚物 [poly (VDF-TrFE), P(VDF-TrFE)]有機(jī)壓電材料構(gòu)建一種復(fù)合壓電納米粒子,通過外界超聲刺激使其具備一定的電荷用于腦膠質(zhì)瘤的治療。

1 材料與方法

1.1 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復(fù)合壓電納米粒子的合成

取10 mg P(VDF-TrFE)(30∶70 質(zhì)量比)粉末均勻鋪平至玻璃容器中,將其置于120℃烘箱內(nèi)恒溫加熱10 min,然后以1℃/min降至室溫,即獲得重結(jié)晶的P(VDF-TrFE)粉末。將上述粉末溶于2 mL 丙酮,制成濃度為5 mg/mL的P(VDF-TrFE)溶液。

取10 mg二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-四氮雜環(huán)配體 [1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly(ethylene glycol)-tetranitroheterocyclic ligand, DSPE-PEG-DOTA] 溶于三氯甲烷,取10 mg醋酸釓溶于乙酸,將兩種溶液緩慢匯合為反應(yīng)液,通過pH標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH為7.4,充分混勻,置于旋轉(zhuǎn)混合器于室溫下攪拌過夜,通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑,將沉淀重懸于1 mL雙蒸水,過濾除去未溶解沉淀即為DSPE-PEG-DOTA-釓造影劑 (DSPE-PEG-DOTA-Gd)。

按摩爾比為1∶1的DSPE-PEG-馬來酰亞胺脂 (DSPE-PEG-maleimide, DSPE-PEG-Mal) 和精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸合成肽 (Arg-Gly-Asp, RGD) 溶于500 μL的二甲基亞砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO),置于37℃恒溫箱攪拌過夜,通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)即獲得DSPE-PEG-Mal-RGD。

將DSPE-PEG-DOTA-Gd和P(VDF-TrFE)按一定摩爾比溶于丙酮,然后加入一定量的DSPE-PEG-Mal-RGD,劇烈攪拌,并使用尖端超聲儀分散10 min,將上述混合溶液置于旋轉(zhuǎn)混合器攪拌過夜(15 r/min,37℃);通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分有機(jī)溶劑,將殘余溶液進(jìn)行離心(2 500g,4 ℃,30 min)得到沉淀,將沉淀溶于超純水并以相同離心參數(shù)洗滌3次,即獲得P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD。

1.2 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復(fù)合壓電納米粒子的表征

通過動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)對(duì)粒子粒徑和ζ電位進(jìn)行表征,即取一定量濃度為2 mg/mL的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶液用雙蒸水稀釋為200 μg/mL的待測(cè)溶液,充分混勻后置于樣品池中,分別設(shè)置檢測(cè)目標(biāo)為粒子粒徑和ζ電位,每個(gè)樣品以6/次循環(huán)檢測(cè)。

通過掃描電子顯微鏡對(duì)其形貌進(jìn)行表征,即取一定量濃度為2 mg/mL的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶液稀釋后滴于1.0 cm × 1.0 cm的硅片,自然風(fēng)干,通過離子濺射儀鍍金20 s后進(jìn)行拍照。

通過X-線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)對(duì)其成分進(jìn)行表征,即取一定量濃度為2 mg/mL的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶液滴于錫紙上,待樣品自然風(fēng)干后進(jìn)行XPS分析。

通過壓電響應(yīng)力顯微鏡對(duì)其壓電性能進(jìn)行表征,取一定量濃度為2 mg/mL的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶液,通過旋涂的方法將其固定于2 cm × 2 cm的導(dǎo)電硅片上,在壓電響應(yīng)力測(cè)試模式下隨機(jī)選擇1 μm × 1 μm的區(qū)域進(jìn)行壓電系數(shù)、壓電勢(shì)能的表征。

通過小動(dòng)物磁共振成像儀對(duì)其磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI) 能力進(jìn)行表征,簡(jiǎn)言之,通過計(jì)算Gd離子濃度,將其制為Gd濃度為0.1、0.2、0.4及0.6 mmol/L的溶液。

1.3 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復(fù)合壓電納米粒子細(xì)胞生物相容性檢測(cè)

通過U87-MG、A172、U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系評(píng)估P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的生物相容性,簡(jiǎn)單地說,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按4×104/孔濃度接種于96孔板中,細(xì)胞貼壁后將P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD按0、25、50、75、100、200、300、400及500 mg/mL的濃度與細(xì)胞共孵24 h,隨后進(jìn)行 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞活性。

1.4 超聲刺激下P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用

為評(píng)估單獨(dú)超聲刺激后細(xì)胞活性變化情況,設(shè)置超聲參數(shù)為頻率1 MHz、聲強(qiáng)1 W/cm2、占空比20%,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按4×104/孔濃度接種于96孔板中,細(xì)胞貼壁后,分別給予超聲刺激0、10、20、30、40及50 min,于刺激后24 h進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)估超聲對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。

將納米粒子按不同濃度與細(xì)胞共孵24 h后,給予有效超聲刺激,于治療后24 h行MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)估超聲聯(lián)合納米粒子對(duì)細(xì)胞的治療作用。

1.5 超聲刺激下P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲能力的影響

通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析各個(gè)實(shí)驗(yàn)組發(fā)生早期、晚期細(xì)胞凋亡的情況;通過傷口愈合實(shí)驗(yàn)評(píng)估在相應(yīng)處理后48 h細(xì)胞的遷移能力;通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell assay) 評(píng)估48 h時(shí)細(xì)胞穿過Transwell小室的數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的粒徑和電位

根據(jù)DLS表征可知P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復(fù)合壓電納米粒子粒徑為(226.8±2.13)nm(圖1A),而ζ電位為-27.6 mV(圖1B)。P(VDF-TrFE)作為該復(fù)合壓電納米粒子合成的原材料,粒子粒徑約為(377.7±5.2)nm(圖1A),ζ電位為-18.7 mV (圖1B)。將P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD溶于不同的溶劑進(jìn)行粒徑表征,在粒子合成后的第1天、第3天、第7天、第14天和第21天分別進(jìn)行了DLS檢測(cè),發(fā)現(xiàn)該粒子在DMEM中粒徑最穩(wěn)定,且保持在160 nm左右,且該粒子的ζ電位只有當(dāng)溶劑是雙蒸水時(shí)才能測(cè)出。

圖1 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD及P(VDF-TrFE)粒徑及成分表征Fig.1 Characterization of particle size and composition of P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD and P(VDF-TrFE)

2.2 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的成分分析

通過XPS對(duì)P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD元素組成進(jìn)行分析,由于原材料P(VDF-TrFE)中只含有C、H和F元素,以DSPE-PEG-DOTA-Gd和DSPE-PEG-Mal-RGD進(jìn)行親水性改善,因此,XPS分析結(jié)果在C和F元素的基礎(chǔ)上出現(xiàn)了P元素、Gd元素、N元素、O元素以及Na元素(圖1D)。對(duì)P(VDF-TrFE)和P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的C元素單獨(dú)分析,發(fā)現(xiàn)P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD中C元素第二峰的結(jié)合能有明顯提高(圖1E)。通過多峰擬合可以發(fā)現(xiàn)P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD中C元素各價(jià)位結(jié)合能趨于平穩(wěn)(圖1F)。

2.3 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的形貌和壓電性能

通過壓電響應(yīng)力顯微鏡對(duì)P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD的壓電性能進(jìn)行表征,在外加電場(chǎng)±10 V的作用下,P(VDF-TrFE)和重塑后的P(VDF-TrFE)壓電材料的表面電勢(shì)發(fā)生了改變,材料表面經(jīng)過高溫重塑后更為光滑(圖2A),而未重塑的材料表面相對(duì)不光平整(圖 2B)。圖2C 是P(VDF-TrFE)的壓電響應(yīng)振幅圖,可以觀察到壓電材料呈現(xiàn)出典型的蝴蝶形曲線,重塑后的粒子表面電勢(shì)明顯增加,約為4.2 mV,而沒有經(jīng)過高溫重塑的P(VDF-TrFE)材料表面電勢(shì)較低,僅約1.1 mV。圖 2D是壓電響應(yīng)相位圖,說明材料在外加電壓的情況下發(fā)生了自發(fā)極化,因此被認(rèn)為具有良好的鐵電特性。

P(VDF-TrFE)壓電納米粒子在掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)下呈現(xiàn)為大小相對(duì)均一的球形結(jié)構(gòu)(圖2E),經(jīng)過晶型重塑和親水性改善后粒子間相對(duì)分散(圖2F)。以水作為對(duì)照,對(duì)P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復(fù)合壓電納米粒子的MRI成像能力進(jìn)行檢測(cè),當(dāng)Gd離子濃度為0.4 mmol/L時(shí)即有明顯的成像效能,在0.6 mmol/L時(shí)成像性能更為明顯(圖2G)。

2.4 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對(duì)細(xì)胞的殺傷作用

本文研究設(shè)定的超聲聲強(qiáng)為1 W/cm2,頻率為1 MHz,占空比為20%,為明確超聲作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞的殺傷作用,分別對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG、A172以及U251細(xì)胞系進(jìn)行了0 min到50 min的超聲刺激。發(fā)現(xiàn)對(duì)于U87-MG和U251細(xì)胞系,在超聲作用30 min及以上時(shí),細(xì)胞活性明顯減低且與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A),而A172細(xì)胞系在超聲作用20 min時(shí)細(xì)胞活性即有顯著降低(P<0.05)(圖3A)。通過復(fù)合壓電納米粒子進(jìn)入細(xì)胞時(shí)間節(jié)點(diǎn)的實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在24 h時(shí)納米粒子與溶酶體發(fā)生了明顯的共定位,即說明粒子已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞(圖3B),通過流式定量分析可知,納米粒子進(jìn)入細(xì)胞的量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增多(圖3C)。

圖3 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對(duì)細(xì)胞活性的影響Fig.3 Effect of P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD on cell viability

選擇納米粒子與細(xì)胞共同孵育24 h后再給予處理,發(fā)現(xiàn)不同濃度的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用效果不同。P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對(duì)U-251和U87-MG細(xì)胞系沒有明顯的毒性作用,而當(dāng)粒子濃度為100 μg/mL時(shí)即對(duì)A172細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的毒性作用(P<0.01)(圖3D)。在超聲作用下時(shí),U87-MG和A172細(xì)胞系活性明顯受損,就U87-MG細(xì)胞系而言,當(dāng)粒子濃度為300 μg/mL時(shí),細(xì)胞活性就顯著低于對(duì)照組(P<0.001)(圖3E)。而在超聲作用下,P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復(fù)合壓電納米粒子能產(chǎn)生更多的活性氧,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖3F和圖3G)。

2.5 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對(duì)細(xì)胞增殖的影響

流式圖中Q1、Q2、Q3、Q4分別對(duì)應(yīng)了壞死、晚期凋亡、早期凋亡和正常健康細(xì)胞群體(圖4A)。對(duì)照組約有0.18%的細(xì)胞群發(fā)生了壞死,而約99.8%為健康細(xì)胞群;在單獨(dú)納米粒子組(健康細(xì)胞93.5%,早期凋亡細(xì)胞5.05%,晚期凋亡細(xì)胞1.23%)和單獨(dú)超聲組(健康細(xì)胞87.1%,早期凋亡細(xì)胞10.8%,晚期凋亡細(xì)胞1.54%)中觀察到了輕微的凋亡。然而,在超聲聯(lián)合作用下,P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD能引起31.1%的細(xì)胞發(fā)生早期凋亡, 9.26%的細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡,而健康細(xì)胞僅58.2%,與對(duì)照組細(xì)胞凋亡情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=53.165,P<0.001)(圖4B)。

圖4 P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD對(duì)細(xì)胞凋亡、侵襲和遷移的影響Fig.4 Effects of P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD on cell apoptosis, invasion, and migration

傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明在24 h時(shí),對(duì)照組愈合已超過55%,單獨(dú)超聲組和單獨(dú)納米粒子組愈合分別約為36.19%和41.35%,而超聲+納米粒子組愈合僅約15.41%,明顯低于其他各組(P<0.01);在24 h時(shí),對(duì)照組細(xì)胞通過Transwell細(xì)胞數(shù)約為190個(gè),同等時(shí)間內(nèi),單獨(dú)超聲組和納米粒子組細(xì)胞通過Transwell細(xì)胞數(shù)約為150個(gè),占對(duì)照組的78.95%,而在超聲聯(lián)合納米粒子組細(xì)胞通過Transwell細(xì)胞數(shù)僅約為51個(gè),約為對(duì)照組的26.84%(P<0.01)?；诖?本研究證實(shí)了P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD在超聲激發(fā)后能夠引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡,同時(shí)能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。

3 討論

壓電材料是指在受到機(jī)械應(yīng)力作用后在材料表面發(fā)生電荷輸出的材料,且電荷輸出量與應(yīng)力大小成正比,這種效應(yīng)又稱為壓電效應(yīng)[7]。壓電效應(yīng)的本質(zhì)是機(jī)械能與電能之間的轉(zhuǎn)化,當(dāng)機(jī)械能作用于壓電材料產(chǎn)生電能時(shí)稱為正壓電效應(yīng),壓電納米材料可以克服當(dāng)前電刺激治療的局限性,通過外部機(jī)械刺激激活(如超聲波)產(chǎn)生內(nèi)部電場(chǎng),在神經(jīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖中有著重要的作用[8]。壓電納米材料分為有機(jī)材料和無機(jī)材料,目前研究最多的是無機(jī)材料,如鈦酸鋇 (BaTiO3)等,通過超聲激發(fā)觸發(fā)的聲-壓電動(dòng)力治療導(dǎo)致腫瘤發(fā)生可逆性電穿孔、產(chǎn)生的單線態(tài)氧等進(jìn)一步殺傷腫瘤細(xì)胞[9-11]。與傳統(tǒng)的氧化鋅(ZnO)、BaTiO3、鈮酸鋰等無機(jī)壓電材料相比,P(VDF-TrFE)有著優(yōu)異的柔韌性、生物相容性、更高的殘余極化和機(jī)電耦合因子,因此被廣泛應(yīng)用于聲學(xué)傳感器[12]、電致伸縮裝置[13]、壓電傳感器[14]等領(lǐng)域中。因其壓電性能相對(duì)較弱,目前應(yīng)用最為廣泛的是將P(VDF-TrFE)制備為薄膜在體外進(jìn)行相關(guān)研究[15-18]。P(VDF-TrFE)親水性差[19],目前將P(VDF-TrFE)制成納米粒子用于體內(nèi)的研究尚少,Pucci 等[20]將抗腫瘤治療藥物Nutlin-3搭載于功能化后的P(VDF-TrFE)納米粒子,在外部超聲的激發(fā)下產(chǎn)生了優(yōu)異的壓電電勢(shì)并激活細(xì)胞凋亡和抗增殖途徑,與Nutlin-3聯(lián)合引起的電化學(xué)效應(yīng)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生了有效的殺傷作用,這項(xiàng)研究開辟了P(VDF-TrFE) 材料應(yīng)用領(lǐng)域的新方向,即將其以納米粒子的形式直接作用于細(xì)胞,有望實(shí)現(xiàn)通過壓電效應(yīng)刺激組織生長(zhǎng)或殺傷靶細(xì)胞。

P(VDF-TrFE)粒子有著多種晶型,在常溫下以α晶型為主,然而β晶型含量越多其壓電性能越好。通過加熱、拉伸或施加強(qiáng)電場(chǎng)等方式均可使α晶型轉(zhuǎn)變?yōu)棣戮?即晶型重塑。有學(xué)者[21-22]通過對(duì)P(VDF-TrFE)薄膜進(jìn)行熱退火處理獲得了更好的結(jié)晶相,即獲得了更多的β晶型從而增加了材料的極性進(jìn)而獲得了更好的壓電性。同時(shí),研究[19,23]發(fā)現(xiàn)通過溶液共混法或表面涂層法可對(duì)PVDF材料進(jìn)行改性。因此,在本文研究中,筆者通過熱退火處理對(duì)P(VDF-TrFE)粒子的晶型進(jìn)行重塑,以DSPE-PEG-Mal-RGD和DSPE-PEG-DOTA-Gd改善其親水性。

在本文研究中,筆者基于P(VDF-TrFE)壓電納米材料制備了兼具M(jìn)RI成像功能與靶向治療腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的復(fù)合壓電納米粒子,該粒子有著穩(wěn)定的粒徑,尤其是在DMEM溶液中,這可能是由于DMEM中含有大量的氨基酸(如苯丙氨酸、賴氨酸)和葡萄糖,它們可吸附于納米材料表面形成一層吸附分子,避免了納米粒子間的互相聚集,從而增加了粒子的穩(wěn)定性[24-26]。而該粒子的ζ電位只有在雙蒸水中能夠測(cè)出,0.9%NaCl、PBS和DMEM溶劑中有著大量的Na+、K+等,電荷的排斥作用會(huì)導(dǎo)致納米顆粒的帶電量變小,使ζ電位達(dá)到等電點(diǎn),從而不穩(wěn)定,以至于不能獲得ζ電位圖[27-28]。重要的是,該粒子在超聲作用下可以產(chǎn)生一定量的活性氧,從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且影響細(xì)胞的侵襲和遷移能力。其作用機(jī)制可能是因?yàn)殡姶碳ねㄟ^影響K+通道抑制了細(xì)胞分裂,并在細(xì)胞分裂過程中干擾細(xì)胞骨架的形成,尤其在有絲分裂過程中干擾紡錘體的形成[29-31]。同時(shí),低強(qiáng)度電刺激能夠在不使用任何藥物的情況下影響細(xì)胞增殖,而且可以通過影響多耐藥蛋白的質(zhì)膜異位來降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性[32]。

總之,本文研究構(gòu)建的P(VDF-TrFE)@DOTA-Gd@RGD復(fù)合壓電納米粒子可以作為一種MRI顯像劑,在精準(zhǔn)、個(gè)體化治療中可實(shí)現(xiàn)分子影像的實(shí)時(shí)引導(dǎo),同時(shí)該納米粒子作為一種聲敏劑可用于癌細(xì)胞的聲動(dòng)力治療,在雞尾酒療法中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明陳治光:設(shè)計(jì)研究方案,數(shù)據(jù)分析,撰寫論文;張巍、何文:提出研究思路,總體把關(guān),審定論文。