徐健,馮俊偉,黃霜,程潤喜,胡芳,王子豪,張瑞景,蔡鳳嬌,余啟,汪江波*

1(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院,工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,發(fā)酵工程教育部重點實驗室,工業(yè)微生物湖北省重點實驗室,湖北 武漢,430068)2(四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室,四川 宜賓,644000)3(路德環(huán)境科技股份有限公司,湖北 武漢,430000)

我國是蒸餾酒釀造大國,據(jù)國家統(tǒng)計局的數(shù)據(jù)顯示,2021年我國白酒產(chǎn)量為715.6萬kL,按照每生產(chǎn)1 t白酒約產(chǎn)生3 t酒糟計算[1],我國每年酒糟產(chǎn)生量超過1 900萬t。目前酒糟主要的處理方式是作為飼料和肥料,然而這種處理方式經(jīng)濟附加值低,同時所能處理的酒糟有限。酒糟含水率高,易腐敗,大量的酒糟得不到有效的處理而被浪費,對環(huán)境造成危害。酒糟營養(yǎng)豐富,含有未被完全利用完的淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[2]。近年來已有許多基于酒糟生產(chǎn)飼料、食品、燃料等產(chǎn)品的研究。MIRZOYAN等[3]利用大腸桿菌處理酒糟生產(chǎn)H2,MAYSUAN等[4]通過對比4種酒糟的處理方式,利用酒糟進行厭氧消化發(fā)電在獲得1 410萬澳元收入的同時,對環(huán)境也是最友好的。酒糟綜合利用既可以提高企業(yè)的經(jīng)濟效益,又可以推動企業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

丁醇憑借其優(yōu)異的理化特性和與燃油設(shè)備兼容的特點,被認(rèn)為是可以替代汽油的新一代燃料。然而丁醇發(fā)酵仍面臨諸多問題,傳統(tǒng)上利用微生物進行丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol,ABE)發(fā)酵,但是產(chǎn)物丙酮會腐蝕發(fā)動機,并且燃料性能差,將丙酮轉(zhuǎn)化為異丙醇進行異丙醇-丁醇-乙醇(isopropanol-butanol-ethanol,IBE)發(fā)酵被認(rèn)為具有更廣泛的應(yīng)用前景[5-6]。此外,原料成本高也是限制IBE發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的原因之一。實驗室前期采用白酒糟作為原料生產(chǎn)丁醇,但酒糟水解液(distillers’ grain waste hydrolysate, DGWH)中成分復(fù)雜,己酸等抑制物會對丁醇發(fā)酵造成嚴(yán)重抑制。為了綜合利用酒糟生產(chǎn)丁醇,需要研究己酸對丁醇發(fā)酵的影響,并對其去除方法進行探究[7]。

隨著丁醇發(fā)酵研究的深入有越來越多的脫毒方法應(yīng)用于丁醇脫毒的研究中,比如堿處理、活性炭、樹脂、生物炭等[8-10],這些脫毒方法在不同的生產(chǎn)案例中的脫毒效果不同,因此需要結(jié)合案例的實際情況綜合分析得出最優(yōu)脫毒方案。目前的評價準(zhǔn)則主要集中在脫毒方法對抑制物的脫除以及對丁醇產(chǎn)量的提升方面,然而僅考慮上述2方面的因素來評價脫毒方法是不足的,理想中的脫毒方法應(yīng)當(dāng)脫毒效果好、成本低、操作簡單、污染少,因此需要結(jié)合技術(shù)、經(jīng)濟、環(huán)境以及社會等多方面因素綜合評價。層次分析法(analytic hierarchy process, AHP)能同時基于一組不同標(biāo)準(zhǔn)進行定量和定性分析,把影響復(fù)雜問題的各個因素按支配關(guān)系構(gòu)成遞階層次結(jié)構(gòu),通過對同一層次中各因素的相對重要程度進行成對比較得出權(quán)重,然后利用權(quán)重對所有備選方案進行排序,得出最優(yōu)方案[11]。

本研究探索酒糟水解液中己酸對丁醇發(fā)酵的影響,利用層次分析法在技術(shù)、經(jīng)濟、社會、環(huán)境等多方面因素綜合評價活性炭、陰離子樹脂和生物炭對己酸的脫毒效果,并結(jié)合酒糟水解液中己酸的含量選擇最佳的脫毒策略,以期為酒糟發(fā)酵生產(chǎn)丁醇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

丁醇生產(chǎn)菌ClostridiumbeijerinckiiLY-5,來源于實驗室-80 ℃甘油管保藏。

1.1.2 試劑

濃香型酒糟A(DGWA),湖北省咸寧市某酒廠;濃香型酒糟B(DGWB),湖北工業(yè)大學(xué)釀酒中試基地;濃香型酒糟C(DGWC),湖北省黃岡市某酒廠。酒糟經(jīng)烘干之后粉碎過篩(0.45 mm)備用。糖化酶(酶活力100 000 U/g),阿拉丁試劑有限公司;液化酶(酶活力20 000 U/mL),寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司;YZA207強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂,杭州泳洲水處理科技有限公司;玉米秸稈生物炭,晟利化學(xué)科技有限公司;活性炭,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDZ4-WS高速離心機,上海湘儀儀器有限公司;GC7890A氣相色譜儀,美國安捷倫公司;Thermo U3000高效液相色譜儀,賽默飛世爾科技公司;DK-S22電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;ZHJH-1214B超凈工作臺,上海智誠分析儀器制造公司;YXQ-LS-75SH高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊實業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 酒糟水解液制備

300 g的酒糟(DGWC)溶于1 L的純水中在60 ℃水浴2 h,用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0,然后用50 U/g高溫淀粉酶沸水浴2 h,再調(diào)節(jié)pH至4.0,用150 U/g糖化酶在60 ℃糖化2 h,8 000 r/min離心5 min得到酒糟水解液。向酒糟水解液中添加Ca(OH)2溶液調(diào)節(jié)pH至10.77,在搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min,33.5 ℃的條件下脫毒處理4.4 h,離心抽濾取上清液。隨后根據(jù)實驗需要分別加入不同濃度的己酸溶液,并將pH調(diào)至5.5,備用。

1.3.2 酒糟水解液脫毒

活性炭脫毒:在酒糟水解液中加入30 g/L的活性炭粉末,于30 ℃、180 r/min條件下處理3 h,離心取上清液,將pH調(diào)至5.5。

陰離子樹脂脫毒:在酒糟水解液中加入30 g/L的陰離子樹脂,于30 ℃、180 r/min條件下處理3 h,離心取上清液,將pH調(diào)至5.5。

生物炭脫毒:在酒糟水解液中加入30 g/L的生物炭粉末,于30 ℃、180 r/min條件下處理3 h,離心取上清液,將pH調(diào)至5.5。

1.3.3 丁醇發(fā)酵

種子液培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20、蛋白胨20、酵母膏10,115 ℃蒸汽滅菌20 min,34 ℃培養(yǎng)42 h。

將72 mL脫毒后的水解液裝于100 mL三角瓶中,經(jīng)過115 ℃滅菌20 min,將種子液按照10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入到水解液,加入3 g/L的CaCO3在34 ℃培養(yǎng)168 h,每24 h記錄重量,繪制失重曲線。

1.4 測定方法

發(fā)酵過程中還原糖的測定參照DB34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》;菌體干重的測定:取10 mL發(fā)酵液于離心管,8 000 r/min離心5 min,用去離子水洗滌離心后于105 ℃烘干至恒重;產(chǎn)物的測定;異丙醇、乙醇、丁醇采用氣相色譜測定,色譜柱使用DB-WAX 122-7032(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent Technologies,USA),進樣口溫度220 ℃,進樣量0.6 μL,分流比60∶1,分流流量48 mL/min,配備氫火焰離子檢測器,檢測器溫度220 ℃。柱箱升溫過程如下:起始40 ℃維持1 min,然后以10 ℃/min升至90 ℃維持5 min,最后以20 ℃/min升至220 ℃,維持10 min。乳酸、乙酸、丁酸、己酸采用液相色譜進行測定,Thermo U3000高效液相色譜儀,Acclaim OA色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)和紫外檢測器,柱溫25 ℃,檢測波長210 nm。流動相:(A)100 mmol/L Na2SO4溶液、(B)乙腈、(C)2.5 mmol/L甲磺酸溶液,流速:0.8 mL/min。梯度洗脫程序為0 min:100% A;6 min:100% A;10 min:100% C;13 min:100% C;20 min:80% B和20% C;25 min:80% B和20% C(均為體積分?jǐn)?shù)),具體步驟參考張瑞景等[12]的研究。

1.5 己酸脫毒方法綜合評價模型的建立與綜合評分計算

1.5.1 己酸脫毒評價指標(biāo)的確立

為評價己酸脫毒方法,根據(jù)測定的指標(biāo)與相關(guān)文獻,設(shè)置技術(shù)、經(jīng)濟、社會、環(huán)境4個一級指標(biāo)[13],在技術(shù)指標(biāo)中設(shè)置丁醇產(chǎn)量、己酸去除率、糖損失率3個二級指標(biāo)。根據(jù)指標(biāo)間的相互關(guān)系以及層次隸屬關(guān)系,構(gòu)建目標(biāo)層、準(zhǔn)則層、指標(biāo)層和方案層,如表1所示。

表1 酒糟水解液中己酸脫毒評價指標(biāo)

1.5.2 指標(biāo)原始數(shù)據(jù)無量綱化處理

由于各評價指標(biāo)體系的單位和數(shù)量級不一致,因此需要對數(shù)據(jù)進行無量綱化處理,本文采用極差標(biāo)準(zhǔn)化法將數(shù)據(jù)統(tǒng)一映射到[0,1]區(qū)間。己酸去除率、丁醇產(chǎn)量和社會接受度為正指標(biāo),數(shù)值越大越好,因此需要進行正向化處理,如公式(1)所示;糖損失率、成本以及環(huán)境污染度為負(fù)指標(biāo),數(shù)值越小越好,因此需要逆向化處理,如公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:x′、x″,處理之后的數(shù)據(jù);x,指標(biāo)中原始數(shù)據(jù);max(x1)和min(x1)為指標(biāo)系列中最大值、最小值。

1.5.3 判斷矩陣的構(gòu)造

為了判斷不同指標(biāo)對脫毒方法綜合評價的重要性,需要確定各個指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)。綜合專家意見和數(shù)據(jù)分析,對不同脫毒方法的脫毒效果進行評價,根據(jù)卜壽珍等[14]的標(biāo)度法建立判斷矩陣,如表2所示。計算矩陣的最大特征向量和各指標(biāo)所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化特征向量,其標(biāo)準(zhǔn)化特征向量為各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)。

1.5.4 檢驗判斷矩陣的一致性

一致性指標(biāo)(consistency index,CI)和一致性比率(consistency ratio,CR)的計算如公式(3)和公式(4)所示:

(3)

(4)

式中:n,矩陣的階數(shù),RI,隨機一致性指標(biāo)均值,其值如表3所示。

表3 RI值

當(dāng)CR<0.1時,判斷矩陣通過一致性檢驗,否則需要修改矩陣。

1.5.5 綜合評分的計算

將極差標(biāo)準(zhǔn)化之后各指標(biāo)依據(jù)判斷矩陣得出的相應(yīng)權(quán)重加權(quán)做內(nèi)積,得到最終的綜合評分。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗均重復(fù)3次,實驗結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。實驗數(shù)據(jù)采用Origin 2021繪圖,SPSS 26統(tǒng)計軟件進行單因素ANOVA分析,P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃香型白酒糟水解液中4種酸的含量

白酒生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生各種有機酸,并在蒸餾過程中進入白酒中,是白酒重要的呈香呈味物質(zhì)。但丁酸、己酸等有機酸的沸點較高,仍有一部分會殘留在酒糟中,造成酒糟中的酸含量高。此外,酒糟的存儲過程中也會在產(chǎn)酸微生物的作用下持續(xù)產(chǎn)生有機酸。不同來源的酒糟中有機酸種類和含量會存在顯著差異。表4分析了不同來源的濃香型白酒糟中乳酸、乙酸、丁酸和己酸的含量。可以看出,乳酸的含量最高,達到了4.30～6.15 g/L,乙酸和丁酸的含量較低,分別為0.39～1.02 g/L和0.07～0.25 g/L,但這3種酸均低于所報道的抑制丁醇發(fā)酵的臨界濃度[15-17]。己酸的含量差異較大,最高可以達到0.47 g/L,然而目前尚沒有關(guān)于己酸抑制丁醇發(fā)酵的研究報道。研究表明,碳鏈越長的脂肪酸更易通過細胞膜,破壞細胞膜的完整性進而導(dǎo)致細胞活力下降,因此相比于短鏈酸對微生物細胞的損傷更大[18]。此外,實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),酒糟水解液經(jīng)過Ca(OH)2處理的丁醇產(chǎn)量最高,但仍低于合成培養(yǎng)基發(fā)酵水平,且仍有部分還原糖沒有被完全利用。同時,Ca(OH)2對己酸的去除效果不明顯(表4)。因此,研究己酸對丁醇發(fā)酵的影響并根據(jù)水解液中己酸的含量選擇合適的脫毒方法,對酒糟綜合利用生產(chǎn)丁醇具有重要意義。

表4 濃香型白酒糟水解液中4種酸的含量

2.2 不同濃度的己酸對酒糟水解液生產(chǎn)丁醇的影響

向經(jīng)過Ca(OH)2處理之后的酒糟水解液(DGWC)中添加己酸至所需的濃度,研究不同濃度的己酸對酒糟水解液生產(chǎn)丁醇的影響。如圖1所示,隨著酒糟水解液中己酸濃度的升高,其對丁醇發(fā)酵的抑制作用顯著增強,丁醇發(fā)酵速率下降,菌體量減少,糖利用率降低,丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量顯著下降。當(dāng)己酸質(zhì)量濃度為0.2 g/L時,菌體量與對照組相比下降了10.1%,糖利用率降低13.1%,丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別減少了14.2%和13.9%。當(dāng)己酸質(zhì)量濃度為1.1 g/L時,發(fā)酵受到嚴(yán)重抑制,丁醇產(chǎn)量下降了89.5%。MADDOX等[19]的研究表明,有機酸會通過細胞膜進入到細胞內(nèi)發(fā)生解離,使得細胞內(nèi)的pH降低進而影響細胞的新陳代謝與丁醇的生產(chǎn)。相比于乙酸和丁酸,己酸的碳鏈更長,對微生物細胞的抑制作用更加明顯,因此少量的己酸就會對丁醇發(fā)酵造成嚴(yán)重抑制。

a-丁醇產(chǎn)量;b-菌體干重、IBE、殘?zhí)?c-失重曲線

2.3 不同脫毒方法對酒糟水解液中己酸的脫除效果

在酒糟水解液中添加己酸至所需濃度,再用陰離子樹脂、活性炭和生物炭進行脫毒處理,測定脫毒后己酸的質(zhì)量濃度和還原糖的損失率,如表5所示。

表5 不同脫毒方法對酒糟水解液中己酸的脫除效果

將己酸從開始抑制的質(zhì)量濃度0.2～0.4 g/L設(shè)為低濃度組,0.4～0.6 g/L為中濃度組,以及抑制作用較為明顯的質(zhì)量濃度0.6～1.1 g/L作為高濃度組。從表5中的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn),活性炭對己酸的去除效果最好,能將0.4 g/L的己酸降至0.07 g/L,去除率達到82.5%,即使己酸的質(zhì)量濃度高達1.1 g/L,也能達到76.3%的去除率。生物炭的去除效果次之,去除率在31.7%～47.5%,同時對低濃度己酸脫除的同時,還原糖的損失僅為1.6%。MONLAU等[20]利用生物炭去除花旗松水解液中35%的乙酸和59%的甲酸,并且?guī)缀鯖]有造成糖損失,這與本實驗結(jié)果基本一致。陰離子樹脂對己酸的脫除效果為7.5%～23.3%,且隨著己酸濃度的升高,脫毒處理造成的水解液糖損失率增加,最高達到了16.1%。FERNANDES等[21]也得到了類似的結(jié)果,他們在使用陰離子樹脂脫除乙酸時,糖損失率高達28%。

2.4 不同脫毒方法處理之后酒糟水解液發(fā)酵

將含有不同質(zhì)量濃度己酸的酒糟水解液分別經(jīng)過陰離子樹脂、活性炭和生物炭處理之后進行丁醇發(fā)酵。如圖2所示,經(jīng)過不同方法脫毒后的酒糟水解液丁醇產(chǎn)量均有提升,其中含有0.4 g/L己酸的酒糟水解液經(jīng)過陰離子樹脂和生物炭處理后丁醇產(chǎn)量與不含己酸的酒糟水解液接近,分別達到了9.7和9.2 g/L,陰離子樹脂雖然去除己酸的效果不明顯,但它對物質(zhì)具有廣泛地吸附性,可能去除了其他的一些抑制物進而提高丁醇的產(chǎn)量。GOTTUMUKKALA等[22]在研究樹脂對稻草水解液脫毒生產(chǎn)丁醇時發(fā)現(xiàn),樹脂XAD7去除甲酸和乙酸的能力均優(yōu)于樹脂Seralite SRA-400,然而經(jīng)樹脂Seralite SRA-400脫毒后的稻草水解液丁醇產(chǎn)量更高,這可能由于其對乙酰丙酸、糠醛等其他抑制物有更好的脫毒效果。生物炭具有高孔隙率、豐富的官能團、pH緩沖能力和能提供營養(yǎng)物質(zhì)等特點[23],同時比陰離子樹脂對己酸有更好的脫除效果,以及比活性炭損失的糖更少,可能導(dǎo)致其在低濃度己酸的情況下具有良好的脫毒效果。在這3種方法中活性炭去除己酸的效果最好,但它同時也損失了更多的糖,這可能導(dǎo)致其丁醇產(chǎn)量相較于另2種脫毒方法更低。當(dāng)己酸含量為0.6和1.1 g/L時,活性炭處理的酒糟水解液丁醇產(chǎn)量更高,相較于陰離子樹脂與生物炭處理分別提升了21.2%、25.9%和17.0%、49.8%,這得益于其對己酸有更好的去除效果。

a-對丁醇產(chǎn)量的影響;b-對異丙醇的影響;c-對乙醇的影響

2.5 脫毒方法評價

使用層次分析法對脫毒方法進行評價,構(gòu)造判斷矩陣是關(guān)鍵,為得到科學(xué)矩陣,通過多次征詢10位相關(guān)領(lǐng)域的專家意見后得到表6和表7的判斷矩陣。

表6 準(zhǔn)則層判斷矩陣

表7 方案層(技術(shù))判斷矩陣

所有CR值<0.1,判斷矩陣通過一致性檢驗。水解液脫毒的目的是提高丁醇的產(chǎn)量,己酸去除率則是評估脫毒方法對己酸脫毒效果的重要指標(biāo),而糖損失率則是衡量脫毒所帶來的負(fù)面影響。經(jīng)濟方面由于本文所采用的脫毒方法處理條件以及添加量基本一致,因此影響因素為脫毒劑自身的價格。社會層面主要為社會接受度,環(huán)境層面則主要為脫毒過程中對環(huán)境所造成的污染[13]。

基于本文的研究數(shù)據(jù)和市場價格,形成如表8所示的評價體系中的初步數(shù)據(jù),對原始數(shù)據(jù)進行無量綱化處理,得到評價指標(biāo)值,再結(jié)合判斷矩陣所得到的權(quán)重,經(jīng)過線性加權(quán)之后,得到評價得分。當(dāng)酒糟水解液中己酸濃度處于低濃度時,生物炭的評價得分最高,為0.57。此外,生物炭可由酒糟經(jīng)過高溫裂解制備而成[24],將進一步減低生物炭的成本,提升酒糟綜合利用的效益。當(dāng)酒糟水解液中己酸濃度處于中、高濃度時,活性炭的評價得分最高,達到0.54和0.53,這得益于其對己酸良好的脫除效果。

表8 評價指標(biāo)體系初步數(shù)據(jù)及得分

3 結(jié)論

濃香型白酒糟水解液中超過0.2 g/L的己酸即會降低丁醇發(fā)酵速率,影響菌體生長,降低糖利用率和丁醇產(chǎn)量?；钚蕴俊㈥庪x子交換樹脂與生物炭處理等脫毒方法對己酸均具有一定的脫除效果,其中活性炭的己酸脫除效果最好,達到76.3%～82.5%。結(jié)合技術(shù)、經(jīng)濟、社會、環(huán)境等因素考慮,當(dāng)己酸的質(zhì)量濃度<0.4 g/L時,生物炭是最佳的己酸脫除方法。而己酸質(zhì)量濃度>0.4 g/L時,選擇活性炭處理更優(yōu)。本研究為綜合利用白酒糟工業(yè)化生產(chǎn)丁醇提供了參考。