吳凡,范紹輝,何國良,梁思宇,徐巖,唐柯*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室,江蘇 無錫,214122)2(廣東石灣酒廠集團(tuán)有限公司,廣東 佛山,528031)3(石灣清雅型酒研究院,廣東 佛山,528031)

作為世界蒸餾酒的重要組成部分,中國白酒自西漢時(shí)就有記載[1],因其獨(dú)特多樣的工藝、香氣和風(fēng)味,在蒸餾酒市場(chǎng)上受到越來越多的關(guān)注[2]。釀造白酒的原料以各種谷物為主,而香型特征的形成與原料的選擇和配比具有直接關(guān)系,行業(yè)內(nèi)也有“高粱產(chǎn)酒香、大米產(chǎn)酒凈、糯米產(chǎn)酒柔、小麥產(chǎn)酒純”的說法[3]。米香型白酒是以大米為主要原料,經(jīng)過小曲糖化、液態(tài)發(fā)酵、液態(tài)蒸餾等工藝步驟,釀造出具有“蜜香清雅、入口綿甜、落口爽凈、回昧怡暢”香氣風(fēng)格的白酒[4]。在濃清醬米4種基本香型的基礎(chǔ)上,白酒衍生出了12種香型[5],且隨著工藝的進(jìn)一步發(fā)展,更多衍生香型的白酒也在逐步投入市場(chǎng)[6]。清雅型石灣玉冰燒白酒以大米為主要發(fā)酵原料,采用野生菌和各種中草藥制作而成的藥曲為發(fā)酵劑,加水發(fā)酵,釜式蒸餾,經(jīng)過山洞陳釀,釀造出了具有獨(dú)特風(fēng)味特征的清雅型石灣玉冰燒白酒[7]。

近年來,隨著對(duì)白酒香氣的研究逐步深入,微量香氣化合物對(duì)白酒整體風(fēng)味的影響越來越得到研究人員的重視[8-9]。全二維氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜(two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry, GC×GC-TOFMS)是在一維氣相色譜的基礎(chǔ)上開發(fā)出來的化學(xué)鑒定手段,相比于傳統(tǒng)的一維分離,GC×GC-TOFMS具有2個(gè)色譜柱,可以更有效的分離出峰時(shí)間相近的化合物,改善化合物共流出對(duì)定性定量的影響[10]。因此,GC×GC-TOFMS被越來越多地應(yīng)用到白酒、白蘭地等具有復(fù)雜揮發(fā)性化合物組成的研究中來。如MU等[11]通過優(yōu)化和驗(yàn)證頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction-mass spectrometry, HS-SPME)與GC×GC-TOFMS檢測(cè)的方法,用于定量中國白酒中的痕量香氣化合物;李元一等[12]采用HS-SPME結(jié)合GC×GC-TOFMS和感官分析對(duì)來自中國煙臺(tái)和法國干邑的9種白蘭地的香氣特征進(jìn)行了分析和區(qū)別;凌與聽等[13]采用HS-SPME結(jié)合GC×GC-TOFMS系統(tǒng)分析了古井貢酒中的揮發(fā)性化合物,并明晰了陳釀時(shí)間對(duì)于古井貢酒造成的揮發(fā)性化合物組成的差異性。

在解析白酒香氣屬性特征時(shí),感官分析也是不可或缺的方法。目前,定量描述分析(quantitative descriptiv analysis, QDA)實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用于各類酒精飲料香氣的描述和量化中。經(jīng)過科學(xué)訓(xùn)練的感官人員能夠準(zhǔn)確描述和定量復(fù)雜香氣中的各類香氣屬性及其強(qiáng)度[14]。但QDA前期訓(xùn)練的周期長(zhǎng),成本高,促使研究人員逐漸開發(fā)并轉(zhuǎn)向更為簡(jiǎn)單便捷的感官分析方法[15]?？焖俑泄俜治黾夹g(shù)(Napping?)是一種基于感官位置的擺放從而確定樣品相似性和差異性的一種快速感官分析方法[16]。相比于傳統(tǒng)的感官分析方法,Napping?的培訓(xùn)難度低、周期短、成本少,近年來在國外的感官實(shí)驗(yàn)中越來越多被應(yīng)用。Napping?和ultra flash profiling(UFP)常常在感官實(shí)驗(yàn)中被結(jié)合使用,在感官圖旁邊自由寫下描述詞,其分析結(jié)果可以達(dá)到近似于QDA的結(jié)果[17]。

清雅型白酒源于米香型,經(jīng)過釀造工藝的改良,風(fēng)味與傳統(tǒng)米香型具有較大差異,但是其物質(zhì)特征及風(fēng)格特點(diǎn)還尚未有過系統(tǒng)研究。因此,本研究以清雅型石灣玉冰燒白酒和傳統(tǒng)米香型白酒為研究對(duì)象,采用GC×GC-TOFMS儀器分析和Napping?-UFP感官分析技術(shù),對(duì)清雅型石灣玉冰燒白酒和傳統(tǒng)米香型白酒進(jìn)行化學(xué)分析和感官分析,區(qū)別兩者之間的化學(xué)組成差異和感官屬性差異。研究不僅豐富了以大米為主要原料的白酒風(fēng)味化學(xué)的理論體系,同時(shí)為其風(fēng)味的進(jìn)一步調(diào)控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

本研究選用了2款清雅型石灣玉冰燒白酒和4款傳統(tǒng)米香型成品白酒,每個(gè)樣品3瓶,具體信息如表1所示。

表1 白酒樣品信息

1.1.2 試劑

C7～C30直鏈正構(gòu)烷烴、愈創(chuàng)木酚(CAS:74495-69-5),均為色譜純,Sigma-Aldrich公司;NaCl,分析純,國藥集團(tuán)上海有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Pegasus?4D飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,美國Leco公司;KT-2001冷噴調(diào)制器,美國Zoex公司;Agilent 7890B氣相色譜,美國Agilent公司);MPS2頂空固相微萃取多功能自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng),德國Gerstel公司;2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取頭,美國Supelco公司;一維色譜柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美國Agilent公司;二維色譜柱Rxi-17Sil MS(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm),美國Restek公司;Mili-Q超純水儀,美國密理博公司;電子天平,Mettler-Toledo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 感官分析

參考GB/T 16291.1—2012《感官分析 選拔、培訓(xùn)與管理評(píng)價(jià)員一般導(dǎo)則 第1部分:優(yōu)選評(píng)價(jià)員》和研究室前期已建立的方法[18]進(jìn)行感官品評(píng)人員的篩選和品評(píng)小組的組建。實(shí)驗(yàn)室通過自愿報(bào)名,問卷調(diào)查的方式從報(bào)名的50人中篩選出22個(gè)無不良嗜好,具有白酒品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的人,進(jìn)行感官培訓(xùn)。感官小組進(jìn)行為期1月,1周1次的感官培訓(xùn),主要內(nèi)容包括香氣識(shí)別測(cè)試,差異測(cè)試和分類標(biāo)尺實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。最終通過測(cè)試的15人組成感官實(shí)驗(yàn)小組。

正式實(shí)驗(yàn)時(shí),每款白酒中取15 mL放入品評(píng)杯中,每一杯隨機(jī)設(shè)置三位數(shù),一起將6款白酒都交給品評(píng)員,要求品評(píng)員對(duì)6款白酒香氣進(jìn)行嗅聞,將6杯白酒按照香氣的相似性和差異性放置在A4紙上。在全部擺放完后,在每一杯白酒下用圓圈和對(duì)應(yīng)的數(shù)字做標(biāo)記,并根據(jù)香氣特點(diǎn),在每一杯旁邊寫3～5個(gè)香氣描述詞。

1.3.2 HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析

樣品前處理:參考研究室前期已建立的方法[19],使用超純水將每款白酒按照酒精度稀釋到10%vol,取5 mL稀釋后酒樣于20 mL氣相進(jìn)樣瓶中,并加入1.5 g NaCl和50 μL 20.88 mg/L同位素內(nèi)標(biāo)愈創(chuàng)木酚。

頂空萃取:采用頂空固相微萃取多功能自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣。在50 ℃下平衡5 min,萃取時(shí)間45 min,轉(zhuǎn)速400 r/min,萃取后在進(jìn)樣口解析5 min,接著運(yùn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜的程序,不分流進(jìn)行3次。

二維氣相色譜條件[20]:采用高純度He(純度>99.999 5%)為載氣,流速1 mL/min,樣品運(yùn)行設(shè)置為恒流模式。一維烘箱的起始溫度45 ℃,3 min后升溫至150 ℃,升溫速度4 ℃/min,保持2 min,繼續(xù)升溫到200 ℃,升溫速度6 ℃/min,最后升溫到230 ℃,升溫速度10 ℃/min,保持10 min。二維烘箱的溫度一直比一維烘箱高5 ℃。

飛行時(shí)間質(zhì)譜條件:EI電離源,離子源電壓70 eV,離子源溫度230 ℃,線溫度240 ℃。采集質(zhì)量數(shù)范圍m/z35～400,采集頻率100 spectra/s。檢測(cè)器電壓為1 430 V。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

1.4.1 全二維氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理

揮發(fā)性化合物定性[21]:采用軟件自帶的解析軟件ChromaTOF?4.61.1.0 software(LECO Corporation)進(jìn)行化合物的定性。識(shí)別信噪比>200的色譜峰,自動(dòng)解卷積并與軟件自帶的質(zhì)譜庫進(jìn)行對(duì)比。篩選相似度>700且3個(gè)平行中至少檢測(cè)到2次的化合物,刪除含有鹵族元素和柱流失的化合物。根據(jù)相同運(yùn)行程序條件下,C7～C30直鏈正構(gòu)烷烴的出峰時(shí)間,自動(dòng)計(jì)算出各個(gè)化合物的保留指數(shù)(retention index, RI),保留與文獻(xiàn)記錄的保留指數(shù)相差<50的化合物。

揮發(fā)性化合物半定量質(zhì)量濃度的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.4.2 數(shù)據(jù)處理

使用R語言處理Napping?-UFP實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),并繪制普氏多維向量分析圖(procrusts multiple factor, PMFA);SIGMA軟件處理差異性化合物數(shù)據(jù),并繪制主成分分析(principal component analysis, PCA)圖;HTML處理差異性化學(xué)物數(shù)據(jù),繪制聚類熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官分析

感官實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行香氣分析的重要一環(huán),往往和化合物分析相關(guān)聯(lián)。通過感官實(shí)驗(yàn)明確白酒的特征香氣屬性及其強(qiáng)弱,對(duì)產(chǎn)品的工藝環(huán)節(jié)和消費(fèi)偏好都有重要的指導(dǎo)意義。Napping?是一種快速感官分析方法,目前已廣泛應(yīng)用于各類食品風(fēng)味的解析中[22],而在白酒風(fēng)味感官實(shí)驗(yàn)中還尚未見報(bào)道。為了明確清雅型石灣玉冰燒白酒香氣的風(fēng)格特點(diǎn)以及和米香型白酒的差別,本研究采用快速感官分析技術(shù)Napping?-UFP進(jìn)行分析。匯總和處理Napping?和UFP實(shí)驗(yàn)結(jié)果后,分別繪制6種白酒的聚類特征圖和香氣特征相關(guān)性圖(圖1)。觀察Napping?實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制出的聚類特征圖(圖1-a),2款清雅型石灣玉冰燒白酒聚在一起,位于x軸左側(cè),而4款米香型白酒聚在一起,位于x軸右側(cè),這說明清雅型石灣玉冰燒白酒和米香型白酒在香氣特征上具有明顯的差異,且這種差異遠(yuǎn)大于酒精度帶來的區(qū)別。結(jié)合UFP實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制出的香氣特征相關(guān)性圖(圖1-b)發(fā)現(xiàn),清雅型石灣玉冰燒白酒在植物、油脂香、中藥、甘草、薄荷、雪碧等屬性上明顯區(qū)別于米香型白酒,而米香型白酒的香氣則更多表現(xiàn)為米香以及水果、蜂蜜、糖果等甜香的香氣特性。

a-聚類特征;b-香氣特征相關(guān)性圖

2.2 HS-SPME-GC×GC-TOF/MS分析

2.2.1 揮發(fā)性化合物組分定性分析

采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS,在清雅型石灣玉冰燒和米香型白酒中共定性出了400種揮發(fā)性化合物見電子版增強(qiáng)出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035392),其中2款清雅型石灣玉冰燒白酒中含有292種,具體各類別揮發(fā)物結(jié)果見表2。2款清雅型石灣玉冰燒白酒中鑒定出的揮發(fā)性化合物中含有酯類化合物78種,米香型白酒中鑒定到的酯類化合物數(shù)量大致相同,有83種。以往的白酒香氣化合物研究中,酯類化合物的往往數(shù)量最多[23],這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。從單個(gè)樣品來看,2款清雅型石灣玉冰燒白酒的酯類化合物均多于對(duì)照組米香型白酒。由于主要原料是大米或者糯米,大量氨基酸在酵母的作用下轉(zhuǎn)化為高級(jí)醇[24],因此大米為原料釀造的白酒往往具有較多的醇類物質(zhì)。本研究在清雅型石灣玉冰燒和米香型白酒中共檢測(cè)到55種醇類化合物,其中清雅型石灣玉冰燒中含有52種,而米香型白酒占40種。某些高級(jí)醇具有調(diào)和香氣和后味的作用,而醛類化合物主要起到影響香氣釋放和香氣質(zhì)量的作用[25]。清雅型石灣玉冰燒白酒中的醛類化合物的種類明顯高于米香型白酒。己醛類的醛類化合物往往給白酒帶來生青、草本類的香氣[26]。清雅型石灣玉冰燒檢測(cè)到的萜類化合物共有25種。先前的研究中,何張?zhí)m等[27]通過對(duì)肉桂葉的揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)其中含有多種萜類化合物。而清雅型石灣玉冰燒白酒的制曲過程中加入了甘草、肉桂葉、八角等多種中草藥,因此酒中檢測(cè)到大量的萜類化合物可能部分會(huì)來源于酒曲中加入的中草藥,同時(shí)萜類物質(zhì)也是感官特征中植物、中草藥香氣的重要來源。此外,從檢測(cè)到化合物的數(shù)量來看,清雅型石灣玉冰燒白酒比米香型白酒含有的化合物更多。

表2 HS-SPME-GC×GC-TOFMS中鑒定的揮發(fā)性化合物

2.2.2 揮發(fā)性化合物組分半定量濃度分析

并不是所有的揮發(fā)性化合物都具有香氣特征,因此又進(jìn)一步通過檢索Flavornet Home(http://www.flavornet.org/index.html)和Flavor DB(https://cosylab.iiitd.edu.in/flavordb/)2個(gè)香氣數(shù)據(jù)庫,對(duì)定性出的揮發(fā)性化合物進(jìn)行篩選,鎖定了292種具有香氣特征的揮發(fā)性化合物。將上述香氣化合物的半定量濃度[見電子版增強(qiáng)出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035392)]進(jìn)行單因素方差分析,篩選具有顯著差異的化合物(P<0.01),并依據(jù)半定量濃度進(jìn)行聚類熱圖分析和主成分分析。根據(jù)PCA結(jié)果(圖2)可以發(fā)現(xiàn),2款清雅型石灣玉冰燒白酒和對(duì)應(yīng)的米香型白酒分別位于X軸兩側(cè),這表明清雅型石灣玉冰燒白酒在差異性香氣化合物種類和濃度方面明顯區(qū)別于米香型白酒。

圖2 清雅型石灣玉冰燒和米香型白酒差異性化合物主成分分析

熱圖的聚類結(jié)果(圖3)同樣驗(yàn)證了PCA的結(jié)果,6款白酒中2個(gè)香型的白酒分別聚成一類,說明在顯著差異性化合物的種類和濃度上,清雅型石灣玉冰燒和米香型白酒均具有各自的特征。熱圖顯示清雅型石灣玉冰燒白酒中含量較高的物質(zhì)主要是醛類、醇類、萜類等化合物。酯類化合物是白酒香氣中貢獻(xiàn)水果屬性的重要化合物,清雅型石灣玉冰燒白酒中酯類化合物較多,但XU等[23]研究中具有重要香氣影響的酯類化合物(如異戊酸乙酯、乙酸苯乙酯)在米香型白酒中的濃度更高,這和感官結(jié)果中米香型白酒具有更多更強(qiáng)的水果香氣屬性相符。清雅型石灣玉冰燒中較多醛類和醇類化合物的濃度明顯高于米香型白酒,這2類物質(zhì)往往貢獻(xiàn)出生青和植物的香氣,極有可能是清雅型石灣玉冰燒感官特性中各類植物香氣屬性的來源。alpha-松油醇和反式橙花叔醇等萜類化合物在清雅型石灣玉冰燒中的濃度略高于米香型白酒,這些萜類化合物的閾值往往極低,可能是構(gòu)成植物類和香料類香氣屬性的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。感官實(shí)驗(yàn)結(jié)果中清雅型石灣玉冰燒具有較為明顯的烘焙類香氣,這可能由呋喃和內(nèi)酯類化合物貢獻(xiàn)。許多呋喃類化合物的閾值偏低,且具有烘焙、堅(jiān)果類的香氣,往往是構(gòu)成白酒中烘焙糧香屬性的重要化合物。顯著差異性化合物中,呋喃類化合物數(shù)量較多,其中2-戊基呋喃和糠醛等化合物的含量較高,明顯多于米香型白酒?？啡┳鳛橐环N具有杏仁、焦香香氣的揮發(fā)性化合物,被證明是醬香型白酒和芝麻香型白酒的重要呈香物質(zhì)[28]。而清雅型石灣玉冰燒中含有濃度明顯高于米香型白酒的糠醛,這可能是造成清雅型石灣玉冰燒白酒中焦糖和杏仁屬性的重要物質(zhì)。

圖3 顯著性差異香氣組分熱圖分析和 HCA 聚類分析

3 結(jié)論

以清雅型石灣玉冰燒白酒和米香型白酒為研究對(duì)象,采用GC×GC-TOFMS結(jié)合Napping?-UFP感官實(shí)驗(yàn),探究其香氣的化學(xué)構(gòu)成和感官差異。GC×GC-TOFMS定性出了400種揮發(fā)性化合物,通過香氣數(shù)據(jù)庫篩選出了292種香氣化合物,以酯類、醇類、醛酮類、萜類化合物為主。聚類熱圖和PCA結(jié)果顯示,清雅型石灣玉冰燒白酒和米香型白酒在香氣化合物的種類和濃度具有明顯差異。Napping?-UFP結(jié)果顯示,植物、油脂香、中藥、甘草、薄荷、雪碧是清雅型白酒區(qū)別于米香型白酒的主要香氣屬性。該研究明確了清雅型石灣玉冰燒白酒的風(fēng)味組成和感官特性,豐富了以大米為主要原料的白酒風(fēng)味化學(xué)研究體系。