黃 天，劉凱龍，劉曉曄，姚國強(qiáng)，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

益生菌是指攝入足夠量后，對人體健康產(chǎn)生益處的一類活的微生物的總稱[1]。乳桿菌屬、雙歧桿菌屬，以及乳球菌、嗜熱鏈球菌和酵母菌等作為目前益生菌產(chǎn)業(yè)中主要應(yīng)用的微生物[2]，其的安全性與穩(wěn)定性問題不容忽視。

益生菌株的篩選標(biāo)準(zhǔn)極嚴(yán)格，大多數(shù)菌株通常來自于無致病菌歷史、健康人群的胃腸道。菌株需具備在胃腸道中定植的能力，同時兼具較高的耐酸和耐膽鹽能力[3]。在此基礎(chǔ)上，通過對菌株全基因組測序結(jié)果進(jìn)行深度分析，并結(jié)合微生物學(xué)檢測和毒理學(xué)評價等，對其所攜帶的耐藥基因、致病性基因和環(huán)境抗性基因進(jìn)行系統(tǒng)闡述[4]。以人群試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)結(jié)果為重要評判指標(biāo)，最終確定菌株是否具有安全性[5]。然而，隨著菌株的流通和廣泛使用，菌株往往會出現(xiàn)衰退現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為，原有形態(tài)變得不典型，發(fā)酵周期變長，發(fā)酵特性變差，抗不良環(huán)境減弱等生物學(xué)特性。因此，深入研究與評估益生菌的遺傳穩(wěn)定性具有重要意義[6]。

鼠李糖乳桿菌Probio-M9 是由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)團(tuán)隊(duì)于2017 年從健康婦女母乳樣中分離得到的1 株具有潛在益生特性的益生乳酸菌[7]，其在胃腸液中具有較強(qiáng)的存活率，同時鼠李糖乳桿菌Probio-M9 還可通過腸道-腦軸途徑改善應(yīng)激后成人的心理和生理生活質(zhì)量以及通過調(diào)節(jié)腸道環(huán)境和改善炎癥來抑制大腸腫瘤的形成等[8-10]。本研究以鼠李糖乳桿菌Probio-M9 為研究對象，從菌株形態(tài)變化、碳水化合物利用能力以及菌株代謝特性等多方面對其在連續(xù)傳代培養(yǎng)（100 代）過程中的穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)評價，同時結(jié)合比較基因組學(xué)深入分析其遺傳穩(wěn)定性，找尋其進(jìn)化的基本規(guī)律，確保其具備優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性，為鼠李糖乳桿菌Probio-M9 后續(xù)更深層次的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來源 鼠李糖乳桿菌Probio-M9 菌株由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種資源庫（LABCC）提供。

1.1.2 設(shè)備與儀器 HWS28 型電熱恒溫水浴鍋，天津知署科技有限公司；立式低速離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科技儀器有限公司；DG250 厭氧工作站，英國DWS 公司；EF20 pH 計(jì)，瑞士梅特勒-托利多公司；UV-1100微量紫外分光光度計(jì)，NanoDrop 公司；BX50 光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；Applied biosystems PCR 儀，伯樂公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鼠李糖乳桿菌Probio-M9 連續(xù)傳代培養(yǎng)方法

1.2.1.1 繪制生長曲線 將鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始菌種從-80 ℃保藏環(huán)境中取出，活化后接種到液體MRS 培養(yǎng)基中（設(shè)置3 組平行），接種量為1%。在37 ℃恒溫條件下、厭氧培養(yǎng)24 h，每隔2 h 取樣，測定其在波長600 nm 處的吸光值，確定菌株到達(dá)穩(wěn)定期時間。

1.2.1.2 菌株連續(xù)傳代培養(yǎng) 將鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始菌種從-80 ℃保藏環(huán)境中取出，活化2 代后，在固體MRS 培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線操作，并將劃線后平板于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)72 h 后，隨機(jī)挑取3 個單菌落，每個單菌落分別接種于液體MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫條件下厭氧培養(yǎng)24 h，再接種到相應(yīng)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代，接種量為1%，將第0，25，50，75，100 代分別標(biāo)記為A0、A25、A50、A75 和A100。

1.2.1.3 菌株培養(yǎng)代數(shù)計(jì)算 以1.2.1.1 節(jié)確定的穩(wěn)定期時間作為傳代培養(yǎng)時間，將菌株以1%接種量接入新鮮液體培養(yǎng)基時的初始活菌數(shù)記為N0，穩(wěn)定期時的活菌數(shù)記為Nf，通過公式log2100（Nf／N0）計(jì)算一個生長周期內(nèi)的生長代數(shù)（也即細(xì)菌進(jìn)行分裂的次數(shù)）[11]。

1.2.1.4 菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)過程細(xì)胞、菌落形態(tài)觀察 鼠李糖乳桿菌Probio-M9 連續(xù)培養(yǎng)100 代過程中，對不同代時菌株進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察細(xì)胞、菌落形態(tài)，初步檢驗(yàn)菌株純度，并保留A0、A25、A50、A75 和A100 代革蘭氏染色鏡檢圖片。

1.2.1.5 菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)過程碳水化合物代謝能力檢測 鼠李糖乳桿菌Probio-M9 在連續(xù)培養(yǎng)100 代過程中，采用梅里埃碳水化合物鑒定（API 50CH）試劑盒分析其利用49 種碳水化物化合物（表1）的代謝能力，將A0、A25、A50、A75 和A100代菌懸液吸取至BioMerieux API 50CHL 碳水化合物鑒定試劑條中，并用無菌石蠟封口，37 ℃培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行結(jié)果判定。培養(yǎng)液中所含溴甲粉紫指示劑變?yōu)辄S色（25 號管變?yōu)楹谏殛栃苑磻?yīng)，表明該菌株可代謝對應(yīng)的碳水化合物；不變色為陰性反應(yīng)，表明該菌不可代謝對應(yīng)碳水化合物。

表1 API 50CHL 乳桿菌鑒定系統(tǒng)各種碳水化合物一覽表Table 1 API 50CHL Lactobacillus identification system list of various carbohydrates

1.2.1.6 菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)過程代謝產(chǎn)物檢測保留鼠李糖乳桿菌Probio-M9 A0、A25、A50、A75及A100 代菌液的上清液，以苯乳酸（Phenyllactic acid）、檸檬酸（Citric acid）、酒石酸（Tartaric acid）、蘋果酸（Malic acid）、琥珀酸（Succinic acid）、4-羥基苯乳酸（4-Hydroxyphenyllactic acid）、苯甲酸（Benzoic acid）、草酸（Oxalate）、水楊酸（Salicylic acid）、苯丙酸（Propionic acid）、乳酸（Lactic acid）、丙酸（Propionic acid）、丁酸（Butyrate）、己酸（Hexanoic acid）、乙酸（Acetic acid）物質(zhì)為標(biāo)品，進(jìn)行靶向代謝物測定。

1.2.2 鼠李糖乳桿菌Probio-M9 連續(xù)傳代過程比較基因組學(xué)研究

1.2.2.1 基因組DNA 提取及純度檢測 對鼠李糖乳桿菌Probio-M9 第0，25，50，75，100 代 的DNA 進(jìn)行提取，提取到的DNA 通過Nanodrop 超微量分光光度計(jì)平臺進(jìn)行純度測定，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對DNA 完整度及純度進(jìn)行檢測。使用經(jīng)典STE 法對菌株的全基因組進(jìn)行提取，純度檢測同上，使用Qubit 熒光定量儀進(jìn)行濃度檢測，滿足要求后通過Nanopore 三代測序平臺進(jìn)行全基因組的測序。

1.2.2.2 組裝及環(huán)化 通過NextDenovo 軟件完成3 代數(shù)據(jù)的組裝[12]，進(jìn)一步使用circlator 軟件將三代數(shù)據(jù)進(jìn)行環(huán)化[13]，采取CGview 在線軟件對環(huán)化結(jié)果可視化。通過pilon 軟件使用二代數(shù)據(jù)對三代數(shù)據(jù)進(jìn)行polish[14]。參照Perl 腳本統(tǒng)計(jì)15 株不同代時菌株基因組信息。

1.2.2.3 平均核苷酸一致性（ANI）計(jì)算 15 株不同代時菌株基因組與鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始基因組進(jìn)行ANI 計(jì)算，借鑒Goris 等[15]報道的方法，用自制Perl 腳本比較菌株之間的ANI 值。TBtools 軟件進(jìn)行ANI 聚類熱圖繪制[16]。

1.2.2.4 單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）位點(diǎn)分析 DNA 傳代過程中，SNP 位點(diǎn)常作為分子突變標(biāo)記之一[17]，單個堿基的插入或缺失導(dǎo)致的單個核苷酸發(fā)生突變從而導(dǎo)致DNA 序列的改變。利用Soapsnp 軟件對三代序列進(jìn)行SNP 位點(diǎn)檢測[18]。Samtools 軟件對二代數(shù)據(jù)進(jìn)行突變堿基識別[19]。

1.2.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將1.2.2.4 節(jié)中識別到的SNP 位點(diǎn)整理成序列，在軟件iTol（http：//https：//itol.embl.de/）內(nèi)將基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行可視化。

1.2.2.6 共線性分析 本研究中將鼠李糖乳桿菌Probio-M9 與5 個不同代時的15 株全基因組序列在Mauve（v2.3.1）軟件內(nèi)進(jìn)行共線性分析[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌Probio-M9 連續(xù)培養(yǎng)100 代過程中表型研究

2.1.1 繪制生長曲線 不同的生長周期，菌種的生理狀態(tài)有所差異，因此，菌種的傳代通常選擇對數(shù)生長期末期或者穩(wěn)定期初期為宜，以1%的接種量，將原始菌株接種于液體MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 過程中OD600nm值變化情況如圖1所示。

圖1 鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始菌株生長曲線Fig.1 Growth curve of original strain of L.rhamnosus Probio-M9

由圖1 可知鼠李糖乳桿菌 Probio-M9 在37℃恒溫培養(yǎng)24 h 過程中OD600nm值的變化趨勢，0～2 h 鼠李糖乳桿菌Probio-M9 處于延滯期，2～20 h處于對數(shù)生長期，20 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，這與Liu等[7]對鼠李糖乳桿菌Probio-M9 生長特性研究結(jié)果基本一致。活菌數(shù)變化趨勢與OD600nm值總體相似，初始接入活菌數(shù)為（1.37±1.40）×106CFU/mL，對數(shù)生長期（2～20 h）活菌數(shù)增加至（1.64±0.71）×108CFU/mL，且此后隨著時間推移活菌數(shù)不再增加。如圖1 所示，20～24 h 時雖OD600nm值略有增加，但活菌數(shù)基本維持不變，表明在20～24 h 期間鼠李糖乳桿菌Probio-M9 生長已處于穩(wěn)定期。參照1.2.1.3 節(jié)菌株生長代時計(jì)算方法，到達(dá)穩(wěn)定期鼠李糖乳桿菌Probio-M9 的生長代數(shù)約為6.90代，且一直培養(yǎng)到24 h 仍處于穩(wěn)定期，同時考慮到便于連續(xù)傳代操作，故選擇每個培養(yǎng)周期為（24±0.50）h 作為傳代周期。

2.1.2 菌株連續(xù)傳代過程中的菌體形態(tài)觀察 對鼠李糖乳桿菌Probio-M9 A0、A25、A50、A75 和A100 菌懸液進(jìn)行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌Probio-M9 連續(xù)傳100 代菌體形態(tài)均屬于鼠李糖乳酪桿菌典型形態(tài)，且在連續(xù)傳代過程中，各代時的菌體形態(tài)無明顯差異。

2.1.3 菌株連續(xù)傳代過程中碳水化合物利用能力

本試驗(yàn)對連續(xù)傳代培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌Probio-M9 的碳水化合物代謝能力進(jìn)行了分析。原始菌株及連續(xù)培養(yǎng)傳代過程中（0，25，50，75，100代）的菌株對49 種不同碳水化合物的代謝能力進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。

表2 不同代時鼠李糖乳桿菌Probio-M9 碳水化合物（API 50CH）利用情況Table 2 Utilization of carbohydrates（API 50CH）of L.rhamnosus Probio-M9 in different generations

由表2 可知，鼠李糖乳桿菌Probio-M9 可利用28 種碳水化合物：丙三醇、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉靈-檸檬酸鐵、水楊苷、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-乳糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-松三糖、D-龍膽二糖、D-土倫糖、D-來蘇糖、D-塔格糖和葡萄糖酸鉀。鼠李糖乳桿菌Probio-M9 在連續(xù)培養(yǎng)100 代過程中，5 個不同代時（A0/A25/A50/A75/A100 代）的碳水化合物利用能力無變化，說明鼠李糖乳桿菌Probio-M9 連續(xù)培養(yǎng)100 代對其碳水化合物的代謝能力沒有影響，菌株在此連續(xù)培養(yǎng)傳代過程中穩(wěn)定。

2.1.4 菌株傳代過程靶向代謝物分析 本研究對鼠李糖乳桿菌Probio-M9 在連續(xù)傳代過程中，各代時（0/25/50/75/100 代）菌株有機(jī)酸及短鏈脂肪酸代謝物進(jìn)行分析，結(jié)果表明如圖3 所示，各代時（0/25/50/75/100 代）在苯乳酸（Phenyllactic acid）、檸檬酸（Citric acid）、酒石酸（Tartaric acid）蘋果酸（malic Acid）、琥珀酸（Succinic acid）、4-羥基苯乳酸（4-Hydroxyphenyllactic acid）、苯甲酸（Benzoic acid）、草酸（Oxalate）、水楊酸（Salicylic acid）、苯丙酸（Propionic acid）、乳酸（Lactic acid）、丙酸（Propionic acid）、丁酸（Butyrate）、己酸（Hexanoic acid）、乙酸（Acetic acid）等代謝物質(zhì)之間無明顯差異。

圖3 不同代時鼠李糖乳桿菌Probio-M9 靶向代謝特征比較Fig.3 Comparison of targeted metabolic characteristics of L.rhamnosus Probio-M9 in different generations

2.2 鼠李糖乳桿菌Probio-M9 連續(xù)傳代過程中比較基因組學(xué)分析

2.2.1 基因組信息 本研究中不同代時菌株組裝的基因組信息如表3 所示，鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始菌株基因組大小3.00 Mb，GC 含量46.76%。傳代過程中菌株的平均基因組大小為（3.00±0.002）Mb，GC 含量（46.76±0.007）%。

表3 5 個不同代時15 株菌基因組信息Table 3 Genomic information of 15 strains from 5 different generations

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 本研究中利用系統(tǒng)發(fā)育樹來描述傳代過程中菌株的進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)而判斷菌株在連續(xù)培養(yǎng)過程中的穩(wěn)定性[21]。以鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698 作為外群，使無根樹轉(zhuǎn)為有根樹，鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始基因組為參考基因組，使用Soapsnp 方法得到的15 個菌株的SNP 位點(diǎn)連成序列，通過鄰接法（NJ 法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

如圖4 所示，系統(tǒng)發(fā)育樹共分為兩個分支，5個代時的15 株菌聚在同一系統(tǒng)發(fā)育分支，親緣關(guān)系極近，且明顯與外群基因組處于不同分支。

圖4 基于SNP 位點(diǎn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on SNP locus

2.2.3 平均核苷酸一致性分析 平均核苷酸一致性（ANI）是在核苷酸的水平上，用以比較兩個基因組之間親緣關(guān)系的常用指標(biāo)，其特點(diǎn)是對于近緣種群的區(qū)分度更高[22]。在比較基因組學(xué)分析中，常用ANI 評估基因組間的多態(tài)性和相似性，當(dāng)ANI大于95%時，即表示為同一個種[23]。通過計(jì)算鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始基因組和15 株不同代時菌株基因組間的ANI 值，并繪制成熱圖。

由圖5 可知，鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始基因組和15 株不同代時菌株基因組，兩兩菌株間的ANI 值均在99.00%，菌株之間表現(xiàn)出極高的相似性，且高于種間鑒定標(biāo)準(zhǔn)，可準(zhǔn)確鑒定為同一亞種，表明連續(xù)培養(yǎng)100 代過程中菌株均屬同一亞種即鼠李糖乳桿菌Probio-M9。

圖5 基于5 個不同代時基因組序列繪制ANI 熱圖Fig.5 Heatmap of ANI based on genome sequences of five different generations strains

2.2.4 共線性分析 共線性可用來描述同一染色體上基因的位置關(guān)系，對不同的基因組間通過基因排列順序?qū)ζ涔餐嫦冗M(jìn)行探索[24]，基因組相關(guān)性越高則其中同源序列一致性越高。本研究選取鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始基因組序列作為參考，利用Mauve 軟件對15 株不同代時基因組進(jìn)行共線性分析。

結(jié)果如圖6 所示，15 株不同代時培養(yǎng)的菌株與鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始基因組的共線性較好，具有極高的相似性，每個基因組中均未檢測到基因片段的倒位。與鼠李糖乳桿菌Probio-M9比較，A50-3 和A75-2 有大片段缺失，約為15 kb，主要包含整合酶家族蛋白、組氨酸激酶、核糖核酸酶、假設(shè)蛋白、tuf、cobB_1 和ATP 結(jié)合酶蛋白等基因。其余菌株均有小片段缺失，且基因缺失位置隨機(jī)。

圖6 基于15 株不同代時序列組裝結(jié)果與鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始基因組的共線性分析Fig.6 Collinearity analysis based on the sequence assembly results of 15 strains at different generations and the original genome of L.rhamnosus Probio-M9

2017 年，Zhang 等[25]發(fā)現(xiàn)一種由asp23 基因編碼的堿性休克蛋白參與了干酪乳桿菌Zhang 對慶大霉素的適應(yīng)性，從蛋白質(zhì)組學(xué)對其適應(yīng)性機(jī)制進(jìn)行探究，通過比較含有慶大霉素的培養(yǎng)基中生長的asp23 基因缺失突變體及其親本菌株的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)與asp23 突變株相比，一些膜相關(guān)蛋白在親本菌株中顯著上調(diào)，表明asp23 編碼的堿性休克蛋白能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜蛋白來適應(yīng)慶大霉素的環(huán)境脅迫。本研究中15 株不同代時培養(yǎng)的菌株均有一定的基因片段缺失現(xiàn)象發(fā)生，因此對于本研究中缺失片段所表達(dá)的基因功能還有待進(jìn)一步研究。

2.2.5 SNP 突變位點(diǎn) 以鼠李糖乳桿菌Probio-M9 為參考菌株，利用Soapsnp 軟件對15 株不同代時鼠李糖乳桿菌Probio-M9 菌株進(jìn)行SNP 位點(diǎn)識別，同時使用Samtools 軟件對測序數(shù)據(jù)檢測到的突變位點(diǎn)進(jìn)行過濾，剔除假陽性結(jié)果，結(jié)果見表4。

表4 15 株不同代時菌株提取的SNP 突變位點(diǎn)及注釋信息Table 4 SNP mutation sites and annotation information extracted from 15 strains of different generation

以鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始菌株基因組為參照，鼠李糖乳桿菌Probio-M9 在連續(xù)培養(yǎng)100代時的不同代時菌株中共發(fā)現(xiàn)16 個SNP 位點(diǎn)，SNP 位點(diǎn)分布及功能如表4 所示，包括6 個同義突變和4 個非同義突變，6 個位于非編碼區(qū)。非同義突變主要位于編碼酪氨酸受體激酶YwqD（Tyrosine-protein kinase）和假設(shè)蛋白（Hypothetical protein）的基因上。根據(jù)突變位點(diǎn)對其穩(wěn)定性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，連續(xù)培養(yǎng)100 代過程中高頻突變數(shù)量較少，檢測到2 個SNP，且首次發(fā)生在第0 代基因組與參考基因組之間，一旦建立將穩(wěn)定遺傳。菌株低頻突變檢測到的個數(shù)均小于21。研究表明，SNP個數(shù)小于21 時，可將其鑒定為同一物種[26]。不同代時15 株菌所識別到的SNP 位點(diǎn)均小于21 個，表明15 株不同代時菌株可鑒定為同一物種。

5 個代時菌株SNP 位點(diǎn)隨機(jī)產(chǎn)生，從0 代到25 代、25 代到50 代、50 代 到75 代、75 代 到100代的菌株中，均未發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定存在的突變位點(diǎn)。表明鼠李糖乳桿菌Probio-M9 在連續(xù)傳代100 代時過程中，遺傳穩(wěn)定性良好。

2.2.6 碳水化合物活性酶注釋 碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（CAZy）是物質(zhì)對碳水化合物及其衍生物的合成及分解的酶類數(shù)據(jù)資源庫[24]。本研究通過該數(shù)據(jù)庫對鼠李糖乳桿菌Probio-M9 碳水化合物活性酶功能基因進(jìn)行分析，在基因組水平觀察鼠李糖乳桿菌Probio-M9 菌株在連續(xù)培養(yǎng)100 代時對碳水化合物利用能力的穩(wěn)定程度。

如圖7 所示，從15 株不同代時基因組中共注釋到6 大類碳水化合物活性酶的68 個小類基因家族，主要以GHs（糖苷水解酶）和GTs（糖苷轉(zhuǎn)移酶）酶類的含量最為豐富。大部分基因家族在不同代時無顯著差異，雖然極個別菌株注釋到的酶類存在不一致情況，但不會穩(wěn)定遺傳，且總體碳水化合物利用情況相同，遺傳穩(wěn)定性較好，與表型中不同代時碳水化合物利用能力相同的結(jié)果相吻合。

圖7 不同代時菌株碳水化合物活性酶注釋Fig.7 Results of active enzyme annotation of carbohydrate in different generations

3 結(jié)論

遺傳穩(wěn)定性即子代產(chǎn)生的性狀與親本擁有相同的基因型[27]。在生物進(jìn)化過程中，遺傳變異會經(jīng)常出現(xiàn)，如不嚴(yán)格進(jìn)行人工選擇，就會導(dǎo)致菌種的衰退，從而導(dǎo)致菌種在生產(chǎn)應(yīng)用過程中出現(xiàn)低產(chǎn)、不穩(wěn)定現(xiàn)象[28]。研究表明，菌株在培養(yǎng)及使用過程中，因保藏方法不同、培養(yǎng)基選擇、傳代代次和人工操作等原因會導(dǎo)致菌種出現(xiàn)衰退現(xiàn)象[29]。早在1983 年，Clements 等[30]發(fā)現(xiàn)不同批次用相同方法制備的乳桿菌在治療腹瀉的效果上存在顯著的差異。引發(fā)了人們對于遺傳穩(wěn)定性的關(guān)注。

近年來，益生菌愈加的受大眾歡迎，而在選擇益生菌時，不應(yīng)該僅僅考慮菌株的功能，更要參考菌株的遺傳穩(wěn)定性和生存能力等，這些性能關(guān)系到益生菌在腸道中的生存和定殖以及在生產(chǎn)應(yīng)用中其益生特性的發(fā)揮[31]。鼠李糖乳桿菌Probio-M9是2017 年從中國多地的健康母乳中分離出的一株益生菌[7]，多項(xiàng)研究證實(shí)，鼠李糖乳桿菌Probio-M9 具有耐酸、耐膽鹽特性，其顯著的益生特性體現(xiàn)在能夠活著進(jìn)入人體腸道，對腸道菌群起到調(diào)節(jié)作用并增強(qiáng)機(jī)體免疫力[8-10]，其在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用，而目前所做研究更多的停留在生理生化水平，對菌株的遺傳穩(wěn)定性研究少之又少。

本研究中，對鼠李糖乳桿菌Probio-M9 在MRS 培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基）中連續(xù)培養(yǎng)5 個代時（0，25，50，75，100 代）過程中的表型特征及基因組穩(wěn)定性進(jìn)行分析。采用全基因組及重測序方法對不同代時15 株菌進(jìn)行測序，基因組大小、GC 含量表明15 株連續(xù)培養(yǎng)的菌株與鼠李糖乳桿菌Probio-M9 原始菌株基因組均無明顯差異，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明15 株菌與原始基因組具有較近的親緣性。在識別到的SNP 位點(diǎn)來看，每兩個傳代代時間均未發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定遺傳的突變位點(diǎn)，且菌株共線性良好。同時，從基因組水平編碼基因的突變水平證實(shí)了鼠李糖乳桿菌Probio-M9 在連續(xù)培養(yǎng)100代過程中具有穩(wěn)定表型特征及代謝特性。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果表明鼠李糖乳桿菌Probio-M9 在連續(xù)傳代過程中具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可為其后期開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。