劉 慧，穆同娜，林 立，耿健強，姜 潔

（北京市食品檢驗研究院（北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心），國家市場監(jiān)管重點實驗室（食品安全重大綜合保障關(guān)鍵技術(shù)），北京 100094）

吡咯里西啶類生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物為防御昆蟲和病原體及動物等而產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，在自然界分布極為廣泛。據(jù)報道，目前已從多種植物中分離鑒定出600 以上不同結(jié)構(gòu)的PAs 及其氮氧化物[1-3]。PAs 的分布與植物種屬有關(guān)，主要分布于遠緣相關(guān)的被子植物科，涉及紫草科（Boraginaceae）、豆科（Leguminosae）及菊科（Asteracea）等13 科植物。此外，在蘭科（Orchidaceae）、禾本科（Poaceae）、毛茛科（Ranunculaceae）等植物中也有存在[4-5]。PAs 的含量水平與植物種屬有很大關(guān)系，從痕量至最高約百分之十九（以干重計）[6]。目前，已分離得到的PAs 及PANOs 中約50%具有較強的肝毒性，肺動脈高壓、心臟肥大、腎臟退行性損傷等器官毒性，神經(jīng)和胚胎毒性，甚至致畸、致癌和致突變等[7]。PAs 在食品中也有不同程度地檢出，常見的PAs 暴露來源包括含PAs 的植物以中草藥、膳食補充劑、功能性食品等的原材料而被人體直接攝入，也可間接通過污染糧谷類作物或經(jīng)動物采食等隨食物鏈進入最終食品，而對人體健康造成潛在危害[8-10]。另外，最近還有研究提出了其他污染途徑，如PAs/PANOs 可被土壤吸收并進行水平轉(zhuǎn)移或生產(chǎn)者為了經(jīng)濟利益而有意摻假[11-13]。近年來，經(jīng)攝取含PAs 的食物而中毒的案例已有較多報道，歐洲食品和飼料安全警報（Food and Feed Safe Alerts，RASFF）門戶網(wǎng)站上報告的關(guān)于食品中PAs/PANOs 的高發(fā)生率的食品警報數(shù)量顯著增加[14]。鑒于PAs/PANOs廣泛存在于不同類型的食品中及其對人類健康的潛在風險，其污染問題已成為重要的食品安全問題，了解食品中PAs 的污染狀況，并針對性開展有效防控對確保食品安全具有重要意義。因此，本文對PAs/PANOs 的理化性質(zhì)、毒性、污染狀況、食品加工過程中的變化及相關(guān)分析檢測技術(shù)等方面的研究進展進行了全面論述，以期為食品中PAs/PANOs 的風險評估及防控策略的制定提供有利參考。

1 化學結(jié)構(gòu)及毒性

PAs 是一種復合分子，其化學結(jié)構(gòu)通常由千里光次堿（necine）與千里光次酸（necic acid）兩部分組成，其中千里光次堿的吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)是PAs 母核，主要是由一個四氫吡咯環(huán)和一個羥甲基取代的四氫吡咯環(huán)經(jīng)由氮原子和其鄰位碳原子稠合構(gòu)成的雙環(huán)結(jié)構(gòu)[15]（見圖1a）。母核中的N 可被氧化形成相應的氮氧化物（PANOs），與PAs 原型共同存在于植物中。根據(jù)母核1,2 位碳原子之間形成的鍵是否飽和，可將其分為飽和與不飽和PAs。當1,2 位處于飽和狀態(tài)時，PAs 表現(xiàn)為無毒或毒性較弱；而當1,2 位為雙鍵呈不飽和狀態(tài)時，其毒性和致病性成為關(guān)注的熱點[16]（見圖1b）。同樣，根據(jù)千里光次堿基結(jié)構(gòu)不同，可將不飽和PAs 分為倒千里光堿型（retronecine-type），天芥菜堿型（heliotridine-type），奧索千里光裂堿（otonecine-types）等5 種類型[17]（見圖1c）。千里光次酸一般為5～10 個碳原子的一元酸或二元酸，可同千里光次堿7 或9 位的羥基形成單酯、開鏈雙酯或大環(huán)內(nèi)酯[18]（見圖1d）。

圖1 PAs （a）、1,2 位飽和PAs、1,2 位不飽和PAs （b）的基本結(jié)構(gòu)及代表性飽和、不飽和 （c）、酯型、開鏈雙酯型與環(huán)酯型千里光次堿（d）的化學結(jié)構(gòu)[15-18]Fig.1 Basic structures of PAs (a), 1,2-saturated PAs and 1,2-unsaturated PAs (b) and chemical structures of representative pyrrolizidine alkaloids according to the necine base (c) and different types of esterification (d)[15-18]

目前關(guān)于PAs 的毒性機制還沒有明確的結(jié)論，但普遍觀點認為不飽和PAs 的原型化合物毒性很小，但易被細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）3A 單加氧酶氧化，經(jīng)肝臟代謝后形成高反應性脫氫吡咯生物堿（dehydropyrrolizidine alkaloids，DHPAs），化學結(jié)構(gòu)見圖2[16]。DHPAs 具有較強的親電子性，可迅速與細胞內(nèi)的各種親核性大分子發(fā)生結(jié)合，從而引起肝細胞代謝紊亂、脂肪變性和壞死性損傷等[19]。因CYP3A 在肝臟中含量豐富，主要存在于胞漿的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，因此PAs 作用的直接靶器官主要為肝臟，故PAs 又稱為肝毒吡咯里西啶生物堿（hepastotoxic pyrrolizidine alkaloids，HPAs）。有機陽離子轉(zhuǎn)運體特異性介導了肝臟對PAs 的攝取，并與CYP3A一起在PAs 誘導的肝毒性中發(fā)揮作用。此外，PAs還會引起腎、肺、神經(jīng)和胚胎毒性，甚至致畸、致突變和致癌[20]。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）也已將PAs歸類2B 類致癌物。此外，最新研究表明PANOs 也可產(chǎn)生毒性，PANOs 可以逆轉(zhuǎn)化為PAs 并被氧化成親電性DHPAs 而發(fā)揮毒性作用[21]。

圖2 脫氫吡咯的化學結(jié)構(gòu)[16]Fig.2 Chemical structure of DHPAs[16]

盡管所有的1,2-不飽和PAs 都具有共同的代謝途徑，但不同研究結(jié)果顯示PAs 的毒性大小與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。雙稠吡咯環(huán)1,2 位具有雙鍵同時7 位或9 位的羥基至少有一個被酯化是PAs 產(chǎn)生毒性的結(jié)構(gòu)基礎[15]。PAs 毒性因酯鍵的個數(shù)及是否成環(huán)、千里光次酸的結(jié)構(gòu)而呈現(xiàn)差異，通常環(huán)狀二酯的毒性最大，其次是開鏈二酯，最后是單酯[16]。

PAs 主要經(jīng)氧化和水解等途徑排出體外。當PAs 暴露量較少時，其主要解毒途徑是PAs 的脫氫代謝物（DHPAs）與還原型谷胱甘肽相結(jié)合從而避免前者與DNA 或蛋白質(zhì)結(jié)合。另外，N-氧化對PAs的毒性也要貢獻，因此，抗氧化物質(zhì)可一定程度減弱PAs 的毒性[20]。

2 食品中PAs 的污染水平及來源

近年來關(guān)于因PAs 引發(fā)的人類肝中毒案例的報道逐漸增多，PAs 的污染問題已引起全世界各國監(jiān)管部門及研究機構(gòu)的高度關(guān)注。表1 列舉了近年來不同國家不同食品中PAs/PANOs 的污染水平。由表可知，PAs/PANOs 廣泛存在于來自植物的相關(guān)衍生制品中，歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）已將茶葉、花草茶、蜂蜜和膳食補充劑等確定為易受PAs/PANOs 污染的高風險食品。

表1 不同食品中PAs/PANOs 的污染水平Table 1 Levels of PAs/PANOs in different items

2.1 茶葉及其他植物源衍生產(chǎn)品中的PAs

茶葉中PAs 的污染問題因其污染程度與范圍而不容小覷，歐美國家已開展針對市售花草茶中PAs污染水平的重點監(jiān)測。如Bodi 等[26]分析了德國市售的274 種茶葉樣品（包括紅茶、綠茶、薄荷茶、洋甘菊茶和博士茶等）中的PAs/PANOs 含量，檢出10 種PAs 及7 種PANOs 化合物，其中博士茶的污染最為嚴重，含量可高達5647.2 μg/kg。Schulz 等[22]分析了德國市售的169 種藥用茶葉，檢出14 種PAs和9 種PANOs。Kaltner 等[23]分析了德國市售的18 種花草茶中PAs/PANOs 的含量，發(fā)現(xiàn)18 個茶葉樣品中PAs 的含量為0.1～47.9 μg/kg。近年來，為了進一步細化針對食品中PAs 污染的防控措施，德國聯(lián)邦風險評估研究所（Bundesinstitut für Risikobewertung，BfR）模擬常見的幾種消費情景，對茶葉中的PAs 進行了風險評估，發(fā)現(xiàn)長時間飲用某一特定類型的茶浸提液會增加PAs 暴露風險[40]。此外，Griffin 等[24]分析愛爾蘭市售的18 種花草茶時，發(fā)現(xiàn)某些陽性檢出樣品中PAs 的含量可高達1733 μg/kg。而在最新一項針對歐洲六國食品中PAs 污染水平的調(diào)查中，Mulder 等[25]發(fā)現(xiàn)92%的茶中均有較高水平PAs 檢出，平均含量為460 μg/kg；花草茶、紅茶、綠茶等幾乎所有類型的茶葉均存在不同程度的PAs污染風險，盡管不同類型茶中PAs 組成和濃度不同。有研究表明，千里光寧堿型、天芥菜堿型、石松胺型、奧索千里光裂堿型及野百合堿型是污染茶葉的5 種主要PAs/PANOs 類型，其中千里光寧堿型是占比最高的PAs，約占PAs 總量的77%以上[7,13]。污染茶葉中約1/3 的PAs 由游離堿組成，2/3 由PANOs組成。如Mulder 等[25]的研究表明污染茶葉中千里光寧堿的氮氧化物的含量在60～200 μg/kg 之間，約占茶葉中總PAs 含量的一半。

事實上，茶葉本身并不含PAs，因茶園存在如一點紅、千里光等含PAs 的雜草，在采收階段會意外地被共同采收而造成茶葉PAs 污染。最近有研究還指出在茶葉種植階段PAs 可能通過土壤、水等發(fā)生自然轉(zhuǎn)移從而間接污染茶葉[17-18]。Selmar 等[11]用干燥的千里光葉（一種產(chǎn)生PAs 的植物）覆蓋薄荷和甘菊（不含PAs 的植物）初步證實了后者可通過土壤吸收PAs。為了進一步證實這種通過土壤的水平自然轉(zhuǎn)移也可能發(fā)生在附近生長的活植物中，Selmar 等[12]在將千里光與歐芹（一種不含PAs 的植物）共同種植于同一盆中，據(jù)觀察由千里光供體植物產(chǎn)生的PAs轉(zhuǎn)移到歐芹植物中。Izcara 等[41]在最近一項針對野生牛至的研究中也提出了PAs/PANOs 是通過土壤進行水平自然轉(zhuǎn)移。以上這些研究結(jié)果強化了通過土壤作為污染途徑的水平自然轉(zhuǎn)移理論，因此諸如茶葉、香料等植物源食品中PAs 污染物的出現(xiàn)不應僅被視為收獲期間意外共同采收含PAs 的外來植物而造成的交叉污染或人為摻假，還有可能是通過土壤的水平自然轉(zhuǎn)移造成的間接污染。

除了茶葉，近年來也有研究對其他植物源衍生產(chǎn)品如谷物和沙拉中PAs 的污染進行了評估，其污染程度相對較輕。實際上，自從谷物類糧食作物生產(chǎn)過程中引入了較為嚴格和規(guī)范的農(nóng)業(yè)控制措施后，已有效避免了谷物中出現(xiàn)雜草和外來種子，并大大降低了谷物類食品中PAs 的污染風險[19]。然而，有研究表明，從嚴重污染的谷物中完全去除含有PAs 的外來種子后，剩余“清潔”的谷物中仍可檢測到PAs[42]。同時也有許多研究報道了在小麥、面粉和其他谷物制品中檢測到低水平PAs[43-44]。關(guān)于沙拉，目前已知的用于制作沙拉的可食用植物均不會產(chǎn)生PAs。但是，一些產(chǎn)生PAs 的雜草因其葉子與可食蔬菜葉子的外觀極為相似而在某些不知情的情況下被誤作為沙拉進行市售，歐洲市面上銷售的芝麻菜中檢出有PAs 就屬于這種情況[7]。如Picron 等[13]分析的17個預包裝沙拉樣品中有70%樣品受到低于0.1 ng/g的PAs/PANOs 污染，其中有三個樣品的污染濃度高達2.59、5.20 和10.47 ng/g。2007 年德國聯(lián)邦風險評 估 研 究 所（Bundesinstitut für Risikobewertung，BfR）也報道了德國某超市出售的沙拉中意外發(fā)現(xiàn)普通雜草千里光葉子的典型案例。沙拉中PAs 的污染很可能是由于產(chǎn)PAs 的雜草與可食蔬菜共同收獲或交叉污染造成的[7]。近年來隨著人們消費習慣的改變，尤其是對純天然有機食品的推崇，使得含PAs 雜草在人類膳食中的暴露風險增加，從而誘發(fā)了嚴重的食品安全隱患。另外，由于飲食習慣等因素，一些含PAs 的植物仍會被用于制作醬汁等調(diào)味料，也常出現(xiàn)在烹飪香料中。早在2003 年Rasenack 等[45]就報道了香料中出現(xiàn)的PAs 可能造成了胎兒死于肝功能衰竭。最近這兩年，食品和飼料安全警報（Food and Feed Safety Alerts，RASFF）的門戶網(wǎng)站上針對香料和香草等的警報明顯增加，特別是在牛至樣品發(fā)現(xiàn)了大量PAs，其含量范圍在6660～133870 μg/kg[46]。

納他霉素也可在發(fā)酵過程中添加，抑制雜菌生長，促進優(yōu)勢菌群生長繁殖。韓德權(quán)[33]將納他霉素應用于酸菜發(fā)酵過程中，酵母菌、霉菌等雜菌的生長被抑制，而乳酸菌生長不受影響，使產(chǎn)品香氣明顯改善，酸菜的感官品質(zhì)明顯提高。

2.2 蜂蜜及其衍生產(chǎn)品中的PAs

蜂蜜及其衍生產(chǎn)品是研究最為廣泛且相對較早的食品基質(zhì)，其PAs/PANOs 的污染水平較高，究其原因是花粉中PAs 被意外或人為引入花蜜從而污染蜂蜜及其相關(guān)產(chǎn)品[7,42,47]。自然界中含PAs 的藍薊屬（Echiumspp.）、千里光屬（Seneciospp.）等植物常意外或人為的成為蜜蜂采食對象[21,48]。Kempf 等[49]對德國市場上的200 余種蜂蜜進行了PAs 污染調(diào)查分析，研究發(fā)現(xiàn)有19 個樣品檢出PAs，含量范圍在19～120 μg/kg。Martinello 等[28]對意大利當?shù)爻辛闶鄣姆涿圻M行了PAs 含量分析，結(jié)果表明陽性樣品中PAs 的含量范圍在1～169 mg/kg。2016 年，歐洲藥品監(jiān)管局（European Medicine Agency, EMA）規(guī)定了PAs 的監(jiān)測清單，并對其進行相關(guān)風險評估，建議成人每日攝入量不超過0.35 μg[50]。我國目前對蜂蜜中殘留的PAs 也開展了一些調(diào)查研究，但尚缺乏系統(tǒng)性風險排查以及風險評估研究，最大殘留限量等安全評價指標也處于缺失狀態(tài)。昝珂等[51]對國內(nèi)市場采購的30 批蜂蜜樣品進行28 種PAs/PANOs 化合物的分析測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有10 批樣品檢出PAs，陽性樣品中總含量為4.85～78.34 μg/kg。He 等[52]對國內(nèi)市售蜂蜜中的PAs 污染進行了全面調(diào)查，從我國17 個地區(qū)采購的255 份蜂蜜樣品中檢出的陽性樣品占比為58%，總PAs 含量范圍在0.2～281.1 mg/kg之間；此外，還發(fā)現(xiàn)蜂蜜中的PAs 種類及污染水平存在地理環(huán)境差異，我國國內(nèi)市售蜂蜜樣品中檢出了野百合堿型PAs（來自豬屎豆屬），該類型PAs 化合物與藍薊定（來自車前草）和石松胺型（來自千里光屬）是我國蜂蜜中污染最主要的三類PAs 化合物。其他國家蜂蜜中PAs 污染水平及種類同樣受地理來源的影響，如Picron 等[35]2020 年在比利時進行的一項市場調(diào)查中，評估了來自于比利時本土，其他歐洲國家及拉丁美洲等不同國家地區(qū)的蜂蜜樣品中PAs 的污染情況，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)比利時本土的蜂蜜受PAs 污染的程度相對較低，陽性樣品占比為67%，而其他國家的蜂蜜中PAs 陽性樣品占比高達90%，且污染樣品主要來自于西班牙等地中海國家；另外，比利時原產(chǎn)蜂蜜主要受天芥菜型PAs 的污染，地中海蜂蜜的PAs 污染物主要包括印美定、藍薊定、石松胺型與天芥菜堿型4 種類型，其中石松胺與天芥菜堿是最主要的類型，而在產(chǎn)自希臘的蜂蜜中首次檢出有歐天芥菜堿型PAs 化合物，這種污染差異可能與比利時及地中海當?shù)夭煌闹参锓N群分布密切相關(guān)。

除蜂蜜外，花粉、蜂膠和蜂王漿等膳食補充劑以及零食、糖果等蜂蜜類制品也均被發(fā)現(xiàn)會受到PAs的污染。如Mulder 等[25]在對歐洲蜂產(chǎn)品PAs 污染的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，花粉相關(guān)產(chǎn)品中PAs 陽性檢出率約為91.6%，平均濃度為576.0 μg/kg，而蜂膠和蜂王漿產(chǎn)品中PAs 的平均濃度分別為0.6 和15.5 μg/kg，由此可見，花粉類膳食補充劑更易受PAs 污染。Picron 等[35]發(fā)現(xiàn)PAs 呈陽性的花粉樣品中，其檢出濃度可高達1672 μg/kg?；ǚ蹣悠分邪l(fā)現(xiàn)的主要生物堿有石松胺、藍薊定、印美定等化合物及其相應的氮氧化物，其次有少量的千里光寧堿型PAs。另外，相較于蜂蜜類膳食補充劑，零食、糖果等含蜂蜜類的衍生產(chǎn)品受PAs 污染的水平較低。如Kempf 等[53]2010年對含一定蜂蜜成分的60 余種產(chǎn)品進行分析，發(fā)現(xiàn)8 種產(chǎn)品有PAs 檢出，濃度范圍在10～484 μg/kg。2011 年Kempf 等[47]又對10 種糖果、7 種能量棒和麥片、5 種軟飲料、3 種嬰兒食品和3 種嬰兒果凍及其他含蜂蜜食品進行了分析，僅在2 種糖果中檢出有PAs，濃度分別為10 和40 ng/g。2020 年P(guān)icron等[35]對早餐麥片等39 種含蜂蜜類零食進行PAs 污染評估，發(fā)現(xiàn)1/3 的零食和54%的糖果受到PAs 污染，最大污染水平分別為0.36 和7.61 ng/g。以上這些研究均證實了含PAs 的蜂蜜在食物鏈下游的污染。

2.3 動物源相關(guān)衍生制品中PAs

目前，在動物源性產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)PAs 污染的情況并不常見。但是，鑒于動物采食的牧場或田地中可能存在產(chǎn)PAs 的植物或飼料，因此在肉、蛋、奶等動物性產(chǎn)品中可檢測到少量PAs[7,25,54]。如Diaz 等[55]報道雞蛋中發(fā)現(xiàn)的PAs 污染物主要是其游離堿類型，其氮氧化物PANOs 對污染的貢獻較小。Edgar等[56]報道產(chǎn)蛋雞因谷物飼料成分中含有天芥菜和車前草從而造成雞蛋中PAs 污染，濃度范圍在5～168 mg/kg 之間。Mulder 等[25]對歐洲市場進行的一項最新調(diào)查分析中顯示，6%的牛奶樣本和1%的雞蛋樣本檢出PAs 陽性，其中有一或兩種牛奶樣品其PAs 含量高于檢出限，雞蛋中PAs 的污染濃度為0.1～0.12 μg/kg。

3 PAs 的限量標準與安全風險管理

由于PAs 在自然界中的廣泛存在，含PAs 食品的安全性已成為國內(nèi)外相關(guān)監(jiān)管機構(gòu)和部門共同關(guān)注的熱點。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)13 種可誘發(fā)大鼠肝臟腫瘤的PAs/PANOs，其中倒千里光堿、毛果天芥菜堿、野百合堿等被列為2B 類致癌物[16]。由于PAs對人體健康造成的潛在危害，許多國家和機構(gòu)對PAs 的安全攝入量作出明確規(guī)定，如1989 年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）頒布了《IPCS 健康與安全指南第26 號》，建議PAs 的日攝入限量為15 μg/kg[3]；2005 年荷蘭國家公共衛(wèi)生和環(huán)境研究所建議的每日安全攝入量為0.00043 μg/kg[17]；2008 年英國毒性委員會規(guī)定PAs 每日攝入量不高于0.007 μg/kg；2013 年德國聯(lián)邦風險評估研究所（Bundesinstitut für Risikobewertung， BfR）的建議值同樣是不超過0.007 μg/kg[57]；歐洲藥物管理局則規(guī)定成人的每日攝入量不超過0.35 μg/kg，兒童為0.007 μg/kg[58]；美國食品藥品管理局禁止含PAs 的紫草科植物用于食品加工業(yè)[18]；同樣，比利時禁止將產(chǎn)PAs 的植物琉璃苣作為食品食用，而其種子壓榨的油也只能在用適當?shù)臋z測方法分析不含PAs 后才能用于膳食補充劑。最近，歐盟委員會（EU）于2020年新修訂的1881/2006 號法規(guī)對一些食品中PAs 的最大允許限量進行了規(guī)定[59]。如表2 所示，不同食品中PAs/PANOs 的最大允許濃度水平范圍在1.0～1000 μg/kg 之間。此外，歐盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）還推薦了在食品中必須監(jiān)測的21 種PAs/PANOs 清單[13]。然而，我國目前尚未對PAs 的攝入量及食品中PAs 的最大允許限量作出明確規(guī)定與建議。

表2 不同食品中PAs（含其氮氧化物）的最大允許濃度Table 2 Maximum concentration levels for pyrrolizidine alkaloids (including N-oxides) in different food products

4 食品中PAs/PANOs 的分析檢測方法

4.1 提取

根據(jù)PAs 的結(jié)構(gòu)特征可知，PAs 是含有特征性堿性氮的還原性生物堿，極易被氧化為相應的氮氧化物PANOs。PAs 與PANOs 均屬于極性較強的有機化合物，提取溶劑常用甲醇、乙醇等極性較強的有機溶劑或與水的混合溶液[60]。PAs 在pH 較低時以離子形式存在，因此往提取溶劑中加入一定量的酸（0.05～1.00 mol/L）可提高萃取效率[16]。目前，應用于植物中PAs/PANOs 的提取方式主要有沸水提取、超聲波輔助提取、微波萃取及超臨界流體萃取等[23,61-63]。

4.2 凈化

食品基質(zhì)成分復雜，需對其進行凈化以減少雜質(zhì)對目標物的干擾。近年來關(guān)于PAs 從食品基質(zhì)中凈化的方式有傳統(tǒng)液液萃?。↙iquid-liquid extraction， LLE）、固相萃?。⊿olid phase extraction，SPE）、QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe）法以及分散液-液微萃?。―ispersive liquidliquid microextraction，DLLME）等新型前處理方法[34,41,64-69]。

固相萃?。⊿PE）是基于液相色譜的選擇性吸附與洗脫原理，去除雜質(zhì)的同時對目標物進行富集，具有易于操作、快速、高效等優(yōu)點，是迄今為止應用最為廣泛的純化PAs 的方法。前期常應用的SPE 小柱有C8柱、C18柱及強陽離子交換柱（SCX）等，近年來SCX-SPE 柱常用于PAs 凈化，其優(yōu)點是在有效去除極性雜質(zhì)的同時可將PAs 及PANOs 以高產(chǎn)率準確洗脫[71]。如許秀麗等[72]以甲醇甲酸水溶液提取茶葉樣品中的PAs，經(jīng)超聲提取后，采用SCX-SPE 柱凈化，15 種PAs 的回收率均達到70%以上。Wang等[33]采用SCX-SPE 柱對蜂蜜樣品中12 種PAs 進行凈化，回收率為79%～104%。此外，有研究表明混合型陽離子交換固相萃取柱（PCX-SPE）可同時提供離子交互與反相保留的兩種保留模式，顯著提高了凈化能力[23,73]。值得強調(diào)的是，固相萃取凈化前通常需要將待測樣品提取液的pH 范圍調(diào)節(jié)至6.0～7.0 的中和狀態(tài)或9.0～11.0 的堿性范圍之間，尤其是在使用諸如C8及C18等反相吸附材料時，上樣液處于中性或堿性范圍時可促進目標分析物與吸附劑之間的相互作用。

QuEChERS 法常用于復雜樣品基質(zhì)中多種目標物的提取凈化，近年來也漸漸被應用于測定多種食品基質(zhì)中的PAs，但該方法必須用鋅粉還原PANOs[16]。Izcara 等[41]采用QuEChERS 法，在僅使用少量樣品（0.2 g）、有機溶劑（1 mL）、凈化吸附劑（175 mg）及分配鹽（0.65 g）的情況下，即實現(xiàn)了對牛至樣品中21 種PAs/PANOs 的凈化處理，符合綠色分析化學原則并表現(xiàn)出良好的方法性能，回收率在77%～96%范圍內(nèi)。

近年來也有諸如分散液液萃?。―LLME）等新型技術(shù)嘗試應用于植物等復雜基質(zhì)中PAs 的前處理過程。鑒于其省時、消耗溶劑少、萃取效率高等優(yōu)勢而具有應用潛力。Celano 等[34]在最近的另一項研究工作中使用最小體積的有機溶劑（500 μL 的氯仿）和分散劑（500 μL 的異丙醇），建立了基于DLLME 的超高效液相色譜-質(zhì)譜方法，從蜂蜜樣品中微萃取出9 種PAs/PANOs 化合物并對其進行測定，回收率在63%～103%之間，自述實際樣品的分析結(jié)果與SPE相當。QuEChERS 法與DLLME 法均秉持簡化前處理操作的原則，且具有綠色環(huán)保的優(yōu)點，被逐漸應用到茶葉等復雜食品基質(zhì)中多種PAs 的痕量分析中。隨著前處理技術(shù)的不斷發(fā)展，目前一些新型前處理技術(shù)如固相微萃取、分子印跡法等不斷應用于PAs 等生物堿的檢測分析中[57,74]。新型前處理技術(shù)具有萃取效率高、綠色、環(huán)保等優(yōu)勢，有望成為未來實現(xiàn)對多種PAs 痕量分析的主要趨勢。

4.3 分析技術(shù)

食品基質(zhì)中PAs 的分析檢測方法有分光光度法、毛細管電泳法、免疫學方法、核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）法、色譜學方法以及近年來發(fā)展起來的基于LC-MS、GC-MS 等色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的高精度分析方法[7]。

分光光度法和薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）的檢測原理均是基于顯色反應，如PAs 的吡咯衍生物可與Ehrilich 試劑發(fā)生顯色反應，產(chǎn)生具有特征吸收波長的絡合物，實驗操作簡便，但存在靈敏度低、檢出限高等問題[75-77]。酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）針對性的對某個特定PAs 進行分析和快速篩查，不能準確獲得含量信息，主要用于PAs 的毒理學研究[78]。NMR 法具有強大的定性分析能力，可實現(xiàn)無損檢測，主要應用于PAs 的結(jié)構(gòu)鑒定，較低的靈敏度是制約其應用的主要瓶頸[79]。

GC 和GC-MS 法可用于大多數(shù)PAs（除奧索千里光裂堿）的分析；由于PAs 難揮發(fā)的特點，需對其進行衍生化處理后再用GC 或GC-MS 分析[7,80-82]。GC 和GC-MS 的局限性還在于其不能對PANOs 進行分析，需將其轉(zhuǎn)化后為相應的游離PAs 后再進行分析，該策略又稱為“求和參數(shù)法”。該策略最早由Kempf 等[47,81]提出，其建立了分析蜂蜜中1,2-不飽和PAs 的GC-MS 方法，具體操作是經(jīng)溶劑提取后，先采用Zn2+粉將PANOs 還原為相應的游離PAs，然后經(jīng)凈化處理后用LiAlH4 將所有不飽和PAs 轉(zhuǎn)化為同一種類型的化合物（具有共同的千里光次堿骨架結(jié)構(gòu)），再用衍生試劑（N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺）進行對所有PAs 進行衍生化處理，最后上機分析衍生物。該方法的定量限為0.01 mg/L，后來也應用于其他基質(zhì)的報道[83-85]。GC-MS 法雖在一定程度上提高了方法靈敏度，但是衍生化操作耗時繁瑣，PAs穩(wěn)定性差易分解，目前PAs/PANOs 法分析中已較少使用。

HPLC 法無需衍生處理，但由于PAs 的最大紫外吸收較弱，檢測靈敏度低，難以滿足痕量分析的要求。因此，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）是目前分析食品樣品中PAs/PANOs 的最主要的檢測手段[1,9,52,86]。PAs/PANOs 屬極性化合物，色譜柱固定相選擇反相色譜柱；流動相選用甲醇/水或乙腈/水，并在水相中添加適量酸或堿以提高分離度[7]。電噴霧（Electron Spray Ionization，ESI）與大氣壓化學電離（atmospheric pressure chemical ion source，APCI）是LC-MS/MS 常采用的離子源，其中ESI 的應用更廣。已有文獻報道了部分PAs 的[M+H]+離子的MS/MS 的碎裂途徑[9]（見圖3）。Yoon 等[39]利用LC-MS/MS 結(jié)合冷凍脂質(zhì)沉淀和固相萃取凈化分析測定了高脂食品中的9 種PAs 化合物，檢出限為0.06～0.60 ng/mL。Dzuman 等[87]基于UPLC-MS/MS建立了一種更靈敏的方法用于分析牛至等食品中的PAs/PANOs，定量限為0.5～10 μg/kg。LC-MS/MS具有高選擇性、高靈敏度等諸多優(yōu)點，但有些PAs/PANOs 尚缺乏商業(yè)化的標準物質(zhì)，這在一定程度上限制了LC-MS/MS 在高通量分析。

圖3 部分PAs 的特征質(zhì)量碎裂途徑[9]Fig.3 Mass fragmentation pathways of partial PAs[9]

基于高分辨質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)測定優(yōu)勢，結(jié)合液相色譜開發(fā)的聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，LC-HRMS），無需對每個化合物的質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，可實現(xiàn)對樣品中未知PAs/PANOs 的結(jié)構(gòu)及其同分異構(gòu)體的篩選鑒定和痕量分析。超高效液相色譜-四級桿/軌道阱質(zhì)譜（ultra high-performance liquid chromatography-qua drupole/Exactive Orbitrap mass spectrometry，UPLCQ Exactive-MS）與超高效液相色譜-四級桿/飛行時間質(zhì)譜（ultra high-performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）是目前用于復雜樣品中的生物堿進行結(jié)構(gòu)解析和確證分析的主要技術(shù)[88-91]。Jeong等[90]建立了可快速準確分析植物樣本中PAs 的UPLC-ESI-Q-TOF-MS 方法，檢出限為0.4～2.0 ng/mL，定量限為0.6～6.0 ng/mL。Martinello 等[88]發(fā)現(xiàn)，與Q-TOF-MS 相比UPLC-Q Exactive-MS 可實現(xiàn)更高的的分辨率。

5 食品加工和烹飪制作對PAs/PANOs 的影響

5.1 熱處理對PAs/PANOs 的影響

近年來，PAs/PANOs 在蜂蜜[52]、茶葉[83]、谷物[44]、肉類[92]、雞蛋[55]及牛奶[93]等多種農(nóng)產(chǎn)品中均能檢出。為了更加真實評估人類對PAs 的膳食暴露，針對這種生物堿污染的原材料開展加工工藝或烹飪制作對其PAs/PANOs 含量水平影響的研究則很有必要。食品加工或烹飪制作中最普遍的工藝是熱處理，因此有關(guān)PAs/PANOs 在加熱過程中的穩(wěn)定性、含量種類變化及相關(guān)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檢測等方面的研究也很重要。實際上，早在20 世紀初就報道了多起因食用被PAs/PANOs 污染的谷物制作的面包而引發(fā)的嚴重生物堿中毒案例，這也反映了PAs/PANOs在烘烤的加熱工藝下，具有一定的熱穩(wěn)定性[94]。70 年代進行的另一項研究同樣表明加熱并不會破壞污染肉中的PAs[95]。Rosemann 等[96]還專門開展了針對倒千里光堿（1,2-不飽和PAs）在食品加工過程中的熱穩(wěn)定性研究，該實驗用被已知濃度倒千里光堿污染的玉米粉來制備玉米粥，沸水浴加熱處理3 h 后分別對原材料玉米粉和最終產(chǎn)品玉米粥中的倒千里光堿進行分析以便進行比較。研究結(jié)果表明玉米粥中的倒千里光堿的含量僅有少量減少，但差異不顯著，分析含量減少的真正原因很可能是加熱過程中乳劑的形成導致了提取效率降低，不是蒸煮過程中倒千里光堿自身的熱不穩(wěn)定性引起的降解。為了進一步驗證，該實驗又對涼茶樣品進行了類似的加熱處理，結(jié)果同樣顯示未煮過的涼茶原材料與煮過的涼茶樣品中倒千里光堿的含量沒有顯著差異。因此，該研究得出的結(jié)論是在正常的加熱烹飪過程中倒千里光堿具有熱穩(wěn)定性，其濃度含量不受高溫影響。但是，也有研究得出相反結(jié)論，即加熱工藝可以影響樣品中PAs 與其氮氧化物PANOs 的比例關(guān)系以及PAs 的總含量。如Boppré等[97]采用加熱的方式干燥被PAs污染的花粉，結(jié)果表明PANOs 降解轉(zhuǎn)化為相應的游離PAs，導致其數(shù)量大大減少，但是PAs 的總量保持不變。而Kaltner 等[98]的研究則發(fā)現(xiàn)被PAs 污染的蜂蜜在20 ℃下長期儲藏時，PANOs 的含量水平隨著貯藏時間的延長而不斷下降，但并沒有降解轉(zhuǎn)化為相應的PAs，意味著PAs 的總量減少了。以上兩項研究工作得出的結(jié)論有不一致的地方，但基本可以得出加熱條件會造成PANOs 含量的降低。此外，針對茶葉、草藥等樣品的特殊加熱處理方式主要是浸提工序，這會在很大程度上影響最終產(chǎn)品中PAs 含量。然而，目前僅有少數(shù)研究對此影響進行了評估。Picron 等[13]采用沸水沖泡的方式對不同品種的干茶進行浸提以研究此過程中PAs 的轉(zhuǎn)移效率，結(jié)果表明經(jīng)沸水沖泡后干茶葉中僅有16%～28%的PAs/PANOs 轉(zhuǎn)移至浸提液中（野百合堿除外，為45%）。值得注意的是，茶葉、草藥等的浸提工藝會涉及許多參數(shù)，如浸提時間、溫度、葉子的顆粒大小等，這些都可能對PAs/PANOs 的轉(zhuǎn)移效率產(chǎn)生影響。如Chen等[99]評估了茶葉顆粒大小對PAs/PANOs 的浸提效果的影響，結(jié)果表明用粉碎茶葉末沖泡得到浸提液中的PAs 含量比用完整茶葉葉片沖泡得到的浸提液中PAs 的含量高1.1～4.1 倍。

5.2 發(fā)酵工藝對PAs/PANOs 的影響

除熱處理外，發(fā)酵工藝也是食品加工中常用到的工藝之一。Kempf 等[53]通過分析含蜂蜜成分的糖果和蜂蜜酒中的PAs/PANOs 的污染狀況得出蜂蜜原材料在經(jīng)過加熱和/或發(fā)酵處理后仍可將PAs/PANOs 污染延續(xù)到最終產(chǎn)品中。Picron 等[35]同樣證實了被PAs/PANOs 污染蜂蜜的下游食品中，如糖果和零食中仍可檢測到PAs/PANOs，只是陽性產(chǎn)品檢出率為1/3 且污染水平相對較低。Cao 等[64]以已知PAs/PANOs 濃度污染的蜂蜜為原料制備蜂蜜酒，評估發(fā)酵過程如何影響PAs/PANOs 的含量，研究結(jié)果表明在制備的蜂蜜酒樣品中檢出的PAs 含量約為原蜂蜜中含量的30%和70%，但是仍不確定這種顯著減少是由于發(fā)酵過程本身還是制備過程中的稀釋作用。

綜上所述，目前所開展的這些研究工作僅僅評估了常見的熱處理、發(fā)酵等加工工藝對PAs/PANOs的含量的影響，研究結(jié)論存在不一致的地方且影響機制尚不明確，而關(guān)于其他加工技術(shù)如烘烤、油炸、煮沸、微波處理等對PAs/PANOs 含量是如何影響的仍處于空白。鑒于此，有必要在這一領(lǐng)域進行更加細致和深入的研究，這將有助于可靠地評估PAs/PANOs 的真實攝入量和膳食暴露水平以便對其制定更有效和安全的監(jiān)管措施。

6 結(jié)論與展望

PAs 是一種天然代謝產(chǎn)物，其不飽和型PAs 及大部分PANOs 具有毒性。近年來，PAs 污染問題在蜂蜜、茶葉等食品中均有不同程度發(fā)現(xiàn)。長時間接觸含PAs/PANOs 的食品，即使是含量較少也很容易導致其在體內(nèi)的累積，最終引起毒性事件的發(fā)生。鑒于食品中PAs 對人體健康造成的潛在危害，目前已有多個國家和機構(gòu)針對個別食品制定了PAs 最大允許含量的相關(guān)標準或措施。但是，由于PAs 種類繁多，食品基質(zhì)復雜，有關(guān)PAs/PANOs 的加工穩(wěn)定性方面的研究數(shù)據(jù)有限且不確定等原因，對PAs/PANOs 的實際攝入量做出可靠和準確評估并對其制定合理的限量標準及風險管理措施仍是未來面臨的一項具有挑戰(zhàn)性工作。為此，這一領(lǐng)域仍有大量工作亟需開展：覆蓋更為全面的食品基質(zhì)并對其進行廣泛的PAs 污染狀況調(diào)查與研究，盡可能多地了解并掌握所有可能被PAs 污染的食品種類及其污染程度；對更多PAs 同系物及其可能的代謝產(chǎn)物進行毒理學研究以評估可能存在化學結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系，進一步補充PAs 污染物監(jiān)測清單；對潛在被污染的原材料，進行不同食品加工技術(shù)或烹飪制備對PAs/PANOs 穩(wěn)定性影響的研究以評估更為真實的膳食暴露；根據(jù)PAs/PANOs 在不同食品基質(zhì)中的污染狀況，開發(fā)更為靈敏、高效、且綠色環(huán)保的分析檢測技術(shù)，以形成系統(tǒng)化的控制方法與標準，有效確保食品質(zhì)量安全。