黃 瑩，黃 晶，楊 曉，陳 曦，胡武瑤

（中國健康促進(jìn)基金會抗衰老營養(yǎng)與健康研發(fā)中心，湖北武漢 430000）

大米肽是以大米蛋白為原料，經(jīng)過酶解得到一類含有肽混合物及少量的游離氨基酸、糖類、水分和無機(jī)鹽等的物質(zhì)。大米肽具有抑制酪氨酸酶活性[1]、調(diào)節(jié)免疫力[2]、抗氧化[3]和降血壓[4]等功能。大米肽的氨基酸構(gòu)成模式與人體需求模式基本一致[5]，可以為人體提供所需的各種必需氨基酸。氨基酸分析是研究各種肽類物質(zhì)構(gòu)造、特性和營養(yǎng)價值的重要手段[6]。并且，大米肽的活性與其氨基酸的組成和含量緊密相關(guān)[7]。因此，分析大米肽中氨基酸的含量，對大米肽的品質(zhì)評價和開發(fā)利用等均具有重要意義。

目前，測定氨基酸的檢測方法有直接測定法和間接測定法，直接測定法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和離子色譜-積分脈沖安培法[8]；間接測定法有柱前衍生法和柱后衍生法。其中，使用最為廣泛的就是柱后衍生法[9]，是采用氨基酸分析儀測定氨基酸的經(jīng)典方法，該方法前處理主要是采用酸水解法，但該處理方法時間較長（為22 h 左右），同時儀器設(shè)備較為昂貴，儀器的應(yīng)用主要集中在測定氨基酸的領(lǐng)域[10]；柱前衍生（高效液相色譜法）則無需專一設(shè)備，靈敏度高、分析時間短、儀器的適用性更廣[11]，被認(rèn)為是經(jīng)典氨基酸分析技術(shù)的一種替代技術(shù)[12]。柱前衍生常用試劑有鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）[13]、6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯（6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl Carbamate，AQC）[14]，2，4-二硝基氯苯（2,4-Dinitrochlorobenzene，DNCB）[15]和異硫氰酸苯酯（PITC）等[16]。這些衍生試劑中PITC 與氨基酸反應(yīng)迅速、產(chǎn)物單一穩(wěn)定、衍生后易除去多余試劑且不會影響檢測靈敏度[17]，已被廣泛應(yīng)用于膠原蛋白肽[18]、黃酒[19]、煙草[20]、水果[21]、藥物[22]等領(lǐng)域中。目前鮮有關(guān)于大米肽中氨基酸含量采用柱前衍生-高效液相色譜法檢測的報道，為了證明該方法同樣適用于大米肽中氨基酸的檢測，并能夠同時、快速、高效、穩(wěn)定的完成16 種氨基酸的檢測，因此本文擬建立一種柱前衍生化高效液相色譜法，以PITC 為柱前衍生劑，以期為大米肽的品質(zhì)評價和開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16 種氨基酸（天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys））標(biāo)準(zhǔn)混合液、苯酚（分析純）、異硫氰酸苯酯、三乙胺、三水乙酸鈉、乙腈、甲醇、正己烷 其余均為色譜純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；鹽酸、冰醋酸分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大米肽樣品市售。

MTN-2800D-12 氮吹儀 天津奧特塞恩斯儀器有限公司；Agilent1260 高效液相色譜（High performance liquid chromatography， HPLC） （ ultraviolet detector，VWD） 美國Agilent 公司；202-2AB 電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；MS3digitial 渦旋振蕩器 德國IKA 公司；PE20 型pH 計梅特勒-托利多儀器；AB204-A 分析天平 上海梅特勒-托利多儀器公司；ZORBAXSB-Aq（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱、AthenaAAA（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱 上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別精密量取16 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 μmol/mL，用0.1 mol/L 的鹽酸溶液稀釋成1.25、0.5、0.25、0.125 μmol/mL 4 個濃度，2～8 ℃冷藏保存。

1.2.2 樣品溶液制備 大米肽樣品：稱取大米肽樣品80.00 mg 放入水解管中，加入含0.1%苯酚6 mol/L鹽酸10 mL，將水解管中充入氮?dú)?～3 min 后擰緊螺絲蓋。將已封口的水解管放在165 ℃的恒溫箱中水解1 h，取出冷卻至室溫。打開水解管，將水解液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶內(nèi)，用少量水多次沖洗水解管，水解液移入同一100 mL 容量瓶內(nèi)，定容，過濾，除去初濾液后收集剩余濾液。準(zhǔn)確吸取1 mL 濾液移入試管中，在60 ℃氮吹條件下吹干，用1 mL 超純水完全溶解后轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，待衍生備用。

空白樣品：除了不加入大米肽樣品之外，空白樣品的制備和大米肽樣品的制備相同。

1.2.3 柱前衍生化 室溫條件下，取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液或樣液200 μL 置于1.5 mL 離心管中，加入0.2 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL、1 mol/L 三乙胺乙腈溶液100 μL，混勻，室溫下放置1 h 后加入400 μL正己烷，漩渦混合器振蕩5～10 s，靜置10 min。吸取下層溶液200 μL 和800 μL 超純水混合，過0.45 μm有機(jī)濾膜，得樣品溶液，待進(jìn)樣。

1.2.4 色譜條件和計算方法 色譜柱：Athena AAA 4.6×250 mm，5 μm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：5 μL；流動相A：甲醇:乙腈:水=20:60:20；流動相B：50 mmol/L 乙酸鈉溶液；洗脫程序為：0～38 min：5%流動相A 和95%流動相B、39 min：49%流動相A 和51%流動相B、40～50 min：100%流動相A、51～60 min：5%流動相A 和95%流動相B。

計算公式如下：

As 表示氨基酸s 的含量，%；Xs 表示氨基酸s 的峰面積帶入相應(yīng)曲線后計算出的氨基酸s 的濃度，μmol/mL；Ms 表示氨基酸s 的分子量，g/mol；0.001 表示單位換算系數(shù)；m 表示樣品的質(zhì)量，g；V 表示定容體積，L；N 表示濃縮倍數(shù)。

1.2.5 方法學(xué)考察 從線性關(guān)系、專屬性實(shí)驗、精密度實(shí)驗、重復(fù)實(shí)驗性、穩(wěn)定性實(shí)驗和加標(biāo)回收實(shí)驗對該方法進(jìn)行方法學(xué)考察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并利用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），每組實(shí)驗進(jìn)行3 次平行，實(shí)驗結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

ZORBAXSB-Aq 色譜柱最適用于增加難以分離的酸性，堿性和極性化合物的保留值，其保留作用比許多傳統(tǒng)的C18 HPLC 柱要強(qiáng)，該柱子具有親水性的表面，及時采用100%的水溶液流動相，也可以有效的防止固定相的塌陷，因此該柱子作為一種實(shí)驗室常用的HPLC 分離柱。Athena AAA 色譜柱是一種應(yīng)用于生物發(fā)酵液、飼料、氨基酸注射液、食品、飲料中的氨基酸檢測的專用柱，具有分離性能優(yōu)，重現(xiàn)性好，適應(yīng)性強(qiáng)，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。

本實(shí)驗先采用ZORBAXSB-Aq 色譜柱進(jìn)行氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品中氨基酸的分離，發(fā)現(xiàn)分離效果較差，為了將各個氨基酸完全分離出來，而后采用了Athena AAA 色譜柱進(jìn)行分離，實(shí)驗對比結(jié)果由圖1可以看出，采用Athena AAA 色譜柱的分離效果優(yōu)于ZORBAXSB-Aq 色譜柱的分離效果：a.分離度高。Athena AAA 色譜柱能將16 種氨基酸完全分離出來，ZORBAXSB-Aq 色譜柱并沒有將第13 號和第14 號氨基酸分離出來；b.分離時間快。Athena AAA 色譜柱分離16 種氨基酸在39 min 分鐘全部完成，ZORBAXSB-Aq 色譜柱則需要41 min；c.精密度高。兩款柱子在分離同一濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品時，Athena AAA 色譜柱分離得到各個氨基酸的峰高均高于ZORBAXSB-Aq 色譜柱分離得到的各氨基酸的峰高。因此后續(xù)實(shí)驗采用Athena AAA 色譜柱對大米肽中氨基酸進(jìn)行分離。

圖1 ZORBAXSB-Aq 色譜柱（a）和Athena AAA 色譜柱（b）分離的色譜圖Fig.1 Chromatogram of separation between ZORBAXSB-Aq column (a) and Athena AAA column (b)

2.2 線性關(guān)系考察

以混合標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，其衍生物峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)信噪比（S/N=3）和（S/N=10）分別確定出檢出限（LODs）以及定量限（LOQs）。結(jié)果見表1，16 種氨基酸在0.125～2.5 μmol/mL 的范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，其中14 種氨基酸的決定系數(shù)R2均≥0.9999，另外2 種氨基酸的決定系數(shù)R2分別為0.9998 和0.9994，檢出限為0.003%～0.018 %，定量限為0.010%～0.059 %，表明儀器靈敏度高，較低質(zhì)量濃度的氨基酸即可被進(jìn)行檢測。傅博強(qiáng)等[23]采用6-氨基喹啉基-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯柱前衍生-超高效液相色譜測定轉(zhuǎn)基因大米中氨基酸的含量，發(fā)現(xiàn)17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸決定系數(shù)均大于0.999，這與本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)大米肽中各氨基酸的線性關(guān)系良好相一致，說明采用柱前衍生-高效液相色譜法適合測定大米肽中的氨基酸含量。

表1 16 種氨基酸的線性方程Table 1 Linear equations of 16 amino acids

2.3 專屬性實(shí)驗

取大米肽樣品、16 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品和空白樣品進(jìn)樣測定。結(jié)果空白樣品中未出現(xiàn)干擾主峰測定的色譜峰，供試樣品與對照樣品溶液色譜中，氨基酸峰保留時間一致，各氨基酸間分離度大于1.5。其色譜峰見圖2。

圖2 供試樣品（A）、混合標(biāo)準(zhǔn)品（B）、空白樣品（C）色譜圖Fig.2 Chromatogram of test sample （A）, mixed standard （B） and blank sample （C）

2.4 精密度試驗

精密吸取2.5 μmol/mL 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，衍生后連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定各種氨基酸的峰面積并計算其RSD，結(jié)果如表2 所示，16 種氨基酸的RSD均＜5%，表明該儀器精密度良好。

表2 16 種氨基酸的加標(biāo)回收率Table 2 Recovery rates of 16 amino acids

2.5 重復(fù)性試驗

取6 份同一大米肽樣品80.00 mg 分別放入6 個水解管中，按1.2.2 和1.2.3 進(jìn)行樣品水解和衍生，制備6 份衍生樣品進(jìn)樣，測定各種氨基酸的峰面積并計算其RSD，結(jié)果如表2 所示，16 種氨基酸的RSD 均＜5%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一大米肽樣品80.00 mg，按1.2.2 和1.2.3進(jìn)行樣品水解和衍生，制備1 份衍生樣品，在衍生后0、2、4、8、12、24 h 后進(jìn)樣，測定各種氨基酸的峰面積并計算其RSD，結(jié)果如表2 所示，16 種氨基酸的RSD 均＜5%，表明衍生樣品在衍生后24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加標(biāo)回收試驗

稱取同一大米肽樣品80.00 mg（已知氨基酸含量）6 份，分別進(jìn)行水解，其中2 份樣品用于樣品濃度測定，3 份用于加標(biāo)回收實(shí)驗濃度測定。加入2.5、1.25、0.5 μmol/mL 的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液，每個濃度分別進(jìn)行3 次衍生平行。計算平均加標(biāo)回收率和RSD，結(jié)果如表2 所示，結(jié)果表明各組分的平均加標(biāo)回收率為82.21%～103.59%，RSD 均＜5%，說明該方法精密度良好，準(zhǔn)確度高。

2.8 樣品測定

精密稱取5 份不同廠家的大米肽樣品，編號為樣品1～樣品5，采用上述優(yōu)化方法進(jìn)行進(jìn)樣測定，16 種氨基酸的含量見表3。從表3 的結(jié)果可以看出，5 份大米肽均含有較高含量的Glu 和Asp，其次是Arg 和Leu，這與周侃等[24]的研究結(jié)果相似，均為這幾種氨基酸含量較高。Glu 是生物機(jī)體內(nèi)氮代謝的基本氨基酸之一[25]，可促進(jìn)氮基丁酸的合成，從而降低血氮，促進(jìn)腦細(xì)胞呼吸[26]。Asp 具有防止和恢復(fù)疲勞的作用[27]。Arg 是維持嬰幼兒生長發(fā)育必不可少的氨基酸[28]。Leu 具有抗氧化的作用[29]，這也進(jìn)一步說明大米肽具有抗疲勞、抗氧化等生物活性離不開這些氨基酸的作用。同時王申等[30]采用柱后衍生高效液相色譜法測定大米中氨基酸的組成，發(fā)現(xiàn)大米肽中氨基酸含量最高的也是Glu，其含量為16.1%；其次含量高的也是Asp，為8.44%，與本實(shí)驗采用柱前衍生-高效液相色譜法測定五種大米肽中最高氨基酸的含量相一致，說明柱前衍生-高效液相色譜法適合測定大米肽中的氨基酸含量。

表3 不同廠家大米肽的氨基酸組成和含量Table 3 Amino acid composition and content of rice peptides from different manufacturers

精密稱取某個廠家的大米肽樣品2 份，編號為樣品6，分別采用傳統(tǒng)的國標(biāo)方法氨基酸分析儀和PITC 柱前衍生-高效液相色譜法測定氨基酸含量，其檢測結(jié)果如表4 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16 種氨基酸中，同一種氨基酸分別采用兩種方法測定的含量之間無顯著性差異，氨基酸分析儀測定的氨基酸總量為80.58%±1.32%，PITC 柱前衍生-高效液相色譜法測定的氨基酸總量為81.62%±1.15%，也無顯著性差異，說明柱前衍生-高效液相色譜法適用于測定大米肽中氨基酸的含量，且準(zhǔn)確度較高。

表4 不同方法測定大米肽的氨基酸組成和含量Table 4 Determination of amino acid composition and content of rice peptides by different methods

3 結(jié)論

本實(shí)驗構(gòu)建了PITC 柱前衍生高效液相色譜法測定大米肽中的16 種氨基酸含量的方法，該方法能有效分離16 種氨基酸，各氨基酸組分的線性范圍較寬，均在0.125～2.5 μmol/mL 范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系，14 種氨基酸線性關(guān)系的決定系數(shù)R2≥0.9999，另外2 種氨基酸的決定系數(shù)R2分別為0.9998 和0.9994，檢出限為0.003%～0.018%，定量限為0.010%～0.059%，加標(biāo)回收率在82.21%～103.59%，RSD 均小于5%。說明方法精密度好，準(zhǔn)確度高，適用于大米肽的氨基酸含量分析，為后續(xù)大米肽的氨基酸含量測定提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。