雷思佳，謝瑜杰，余麗波，卜丹丹，霍思宇，陳 輝，陳冬東，彭 濤,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.中檢科（北京）測試認證有限公司，北京 100176；3.檢科院（北京）科學技術(shù)有限公司，北京 100176）

目前，世界上常用的農(nóng)藥高達1800 多種[1]。由于農(nóng)藥的具體使用過程多數(shù)未知，再加上交叉污染，不同種類的農(nóng)藥可能在農(nóng)產(chǎn)品中同時出現(xiàn)，這就要求方法除了足夠靈敏外還需檢測盡可能多的農(nóng)藥，才能對產(chǎn)品質(zhì)量進行有效監(jiān)管?，F(xiàn)階段，常用的農(nóng)殘檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[2]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[3]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[5-6]以及飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（Q-TOF）[7-8]等。其中GC 和GC-MS檢出限偏高，定性能力不足；GC-MS/MS 和LC-MS/MS 的靶向性強，靈敏度高，但分辨力低，只適合已知化合物的檢測，對大范圍非靶向化合物的篩查能力有限，在多種農(nóng)藥篩查時需建立多個檢測方法，配制大量標準溶液，耗時費力[9]。Q-TOF 技術(shù)基于精確質(zhì)量數(shù)和內(nèi)源碎裂離子等條件對農(nóng)藥進行定性測定，具有高通量、非靶向的優(yōu)點，在無標準品的前提下，可準確、高效地同時對復雜樣品中大量化合物篩查[10-11]，為我國農(nóng)產(chǎn)品中多農(nóng)殘風險評估和風險監(jiān)測提供了一種快速有效的方法。相關(guān)檢測實驗室提高其高通量非靶向檢測能力迫在眉睫。

能力驗證作為實驗室認可的重要評判標準，被越來越多的認可機構(gòu)和管理部門重視。當前對食用農(nóng)產(chǎn)品中多農(nóng)殘檢測主要還是停留在常規(guī)實驗室檢測層面，為了增加檢測實驗室間的結(jié)果可比性，能力驗證的開展顯得非常必要，可以及時發(fā)現(xiàn)實驗室存在的問題并動態(tài)監(jiān)測。能力驗證在實施時根據(jù)組織項目的不同通常分為定量、定性和半定量結(jié)果項目，農(nóng)藥殘留項目基本上采用的是定量分析，重點研究各類項目的特點及指定值的確定方法，以及如何選取適宜的統(tǒng)計方法進行結(jié)果評定。隨著高通量非靶向檢測技術(shù)的發(fā)展，單純的定量分析并不能全面客觀的反映檢測實驗室應用多殘留方法的整體水平，在確定合格和不合格實驗室時可能會造成一些混淆。目前國際上已出現(xiàn)通過主成分分析[12]、分層聚類分析[13]、z 值平方和[14]和3A 法[15-16]等方式對多分析物結(jié)果的總體實驗室性能評價。本文通過能力驗證的組織實施，提出并評估了一種新的評價方法，將定性分析和定量分析結(jié)合起來進行評價，目的是將其應用于未來的能力驗證中，從而獲得更具信息性、可靠性的實驗室評價，提高風險發(fā)現(xiàn)能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

農(nóng)藥標準品 純度≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、乙酸銨 色譜純，美國Fisher 公司；乙酸、氯化鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水為Milli-Q 超純水；有機蘋果 購自北京某超市。

Agilent 1290 Infinity II LC-6545 Q-TOF/MS 液質(zhì)聯(lián)用儀、Agilent 7890B-7250 Q-TOF/MS 氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Agilent 公司；AH-30 全自動均質(zhì)儀、Fotector Plus 高通量全自動固相萃取儀、MPE 高通量真空平行濃縮儀 ?？萍瘓F股份有限公司；BSA224S電子天平 德國Sartorius 公司；T50 digital ULTRATURRAX 均質(zhì)儀 德國IKA 公司；LS-80A 全自動灌裝機 武漢優(yōu)凱盛機械設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 能力驗證樣品制備 參照NY/T 789-2004[17]和JJF 1343-2022[18]。取有機蘋果（去蒂、去芯）可食部分約25 kg，經(jīng)組織攪碎機粉碎，混勻，用四分法分成兩批：一批均質(zhì)后直接灌裝，作為空白樣品；一批加入配制好的目標農(nóng)藥標準溶液，預計添加濃度30～180 μg/kg（目標濃度水平在各化合物定量限和最大殘留限量之間），充分攪拌，均質(zhì)后灌裝，作為添加樣品。用經(jīng)充分洗滌、烘干的100 mL 棕色玻璃瓶分裝，空白樣品和添加樣品的重量保持一致，約為50 g，封口膜密封并加貼樣品編號后-20 ℃條件下保存。

1.2.2 高通量非靶向檢測

1.2.2.1 樣品前處理 參照文獻[19]方法對1.2.1中制備的樣品進行提取與凈化。濃縮液氮吹后加入2 mL 乙腈:甲苯（3:1，v/v）超聲混勻，各取1 mL 吹干，一份加入1 mL 乙腈:水（3:2，v/v）定容液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供LC-Q-TOF/MS 測定；另一份加入1 mL 乙酸乙酯定容液經(jīng)0.2 μm 濾膜過濾后供GCQ-TOF/MS 測定。

1.2.2.2 LC-Q-TOF/MS 儀器條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱溫：40 ℃；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL；梯度洗脫程序：0 min，1% B；3 min，30% B；6～9 min，40% B；15 min，60% B；19～23 min，90% B；23.01～27.01 min，1% B。離子源：Dual AJS ESI 源；霧化氣體：氮氣；鞘氣溫度：375 ℃；鞘氣流速：11.0 L/min；正離子全掃描范圍：m/z 50～1000。

1.2.2.3 GC-Q-TOF/MS 儀器條件 色譜柱：HP-5 MS UI（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱溫：40 ℃保持1 min，以30 ℃/min 升溫至130 ℃，再以5 ℃/min 升溫至250 ℃，最后以10 ℃/min 升溫至300 ℃，保持7 min；進樣口溫度：270 ℃；進樣量：1.0 μL；載氣：氦氣；流速：1.2 mL/min；不分流進樣。四極桿溫度：180 ℃；EI 離子源溫度：280 ℃；溶劑延遲：3 min；全掃描范圍：m/z 45～550。

1.2.2.4 定性和定量方法 使用Agilent MassHunter Qualitative workflows 軟件，設置加合離子保留時間偏差、質(zhì)量偏差、信噪比、共流出得分、二級碎片離子選擇個數(shù)和峰高等參數(shù)，和個人化合物數(shù)據(jù)庫與譜庫（PCDL）中的信息進行匹配后得到定性結(jié)果。

在Agilent MassHunter 定量軟件中建立定量方法，用外標法對根據(jù)定性結(jié)果確證的化合物進行準確定量。

1.2.3 均穩(wěn)性檢驗

1.2.3.1 均勻性檢驗 隨機抽取分裝好的添加樣品，按照1.2.1 的方法進行前處理及檢測，采用單因子方差分析法（F檢驗）進行均勻性評估。結(jié)果回收后，通過不均勻性偏差法（SS≤0.3σ 準則）[20]對樣品均勻性進行核驗。

1.2.3.2 穩(wěn)定性檢驗 運輸穩(wěn)定性檢驗：根據(jù)參加者情況，選擇地理位置最南邊和最北邊的地址寄送，到達目的地后立即召回。收到寄回樣品后立即進行檢測，采用平均值一致性檢驗法（t檢驗）[20]評估樣品的運輸穩(wěn)定性。

儲存穩(wěn)定性檢驗：分別于樣品發(fā)放前、檢測過程中和結(jié)果回收后隨機抽樣，按照與均勻性檢驗相同的測試條件進行檢測，采用|x -y|≤0.3σ 準則[20]評估樣品的儲存穩(wěn)定性。

1.2.4 能力驗證項目實施 每套樣品包含農(nóng)藥添加樣和同一來源的空白樣各一份。樣品編碼由隨機數(shù)字組成，相互之間沒有可比性，每個參加者賦予一個唯一性代碼，凡說明檢測結(jié)果和能力評價時均以代碼表示[21]。實驗室在收到樣品后應用高通量非靶向技術(shù)篩查蘋果樣品中的農(nóng)藥種類，并對添加樣品中篩查出的農(nóng)藥準確定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

能力驗證評價依據(jù)ISO 13528:2015[22]和GB/T 28043-2019[23]要求，參加者上報數(shù)據(jù)為扣除空白后的結(jié)果，從定性和定量兩個維度出發(fā)：以實驗室對樣品中指定農(nóng)藥檢出率評價定性篩查能力；以直方圖示法評價計劃的有效性，采用穩(wěn)健統(tǒng)計方式確定穩(wěn)健平均值和穩(wěn)健標準差，以z 值評價實驗室對樣品中添加農(nóng)藥的定量檢測能力，|z|≤2.0 代表定量結(jié)果滿意，2＜|z|＜3 代表定量結(jié)果可疑，|z|≥3 代表定量結(jié)果不滿意。采用Microsoft Excel 2019 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加農(nóng)藥的選擇與確認

根據(jù)國際上農(nóng)殘監(jiān)測動向，結(jié)合我國食用農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥的施用情況，依據(jù)以下原則選擇農(nóng)藥種類：a.已公布的禁限用農(nóng)藥；b.毒性較大、不易降解的常用農(nóng)藥；c.國內(nèi)外標準均列入監(jiān)控范圍的農(nóng)藥。擬在樣品中添加17 種農(nóng)藥：唑嘧菌胺、苯霜靈、毒死蜱、噻蟲胺、二嗪磷、三唑磷、多殺霉素、甲基嘧啶磷、嘧菌胺、稻瘟靈、氟唑菌酰胺、咪唑菌酮、氯蟲苯甲酰胺、敵敵畏、氟苯脲、五氯硝基苯和殺螟硫磷。

為了找到合適的空白基質(zhì)，實驗開始前對市場上的食用農(nóng)產(chǎn)品品種進行了篩選。原料采集后粉碎勻漿，利用實驗室之前建立的方法[24-25]進行農(nóng)藥多殘留高通量非靶向篩查，最終選擇某品牌有機蘋果作為原料，并經(jīng)專家實驗室聯(lián)合確認，蘋果空白樣品本底中含有啶蟲脒和多菌靈兩種農(nóng)藥，確定不含有本次實驗涉及的目標農(nóng)藥，所選原料合適。隨后按預設濃度加入農(nóng)殘混標進行樣品制備并精準定量，將樣品保存于-20 ℃的冰箱中以待進行均穩(wěn)性檢驗及樣品發(fā)放。結(jié)果回收后，對參加者反饋的其他假陽性結(jié)果以及未檢測到的假陰性結(jié)果進一步復核，確定考核樣品中只存在2 種本底含有的農(nóng)藥以及17 種制備時添加的農(nóng)藥，能力驗證樣品滿足要求。

2.2 能力驗證樣品均穩(wěn)性分析

2.2.1 樣品均勻性檢驗分析 樣品發(fā)放前，根據(jù)GB/T 10111-2008[26]中隨機抽樣原則，選出10 個樣品，確定其樣品編號，隨后按照ISO GUIDE 35:2017[27]和CNAS-GL003:2018[20]的要求進行組間及組內(nèi)均勻性檢驗。采用1.2.2 中的方法由相同人員在重復性條件下平行測定兩次，對得到的數(shù)據(jù)進行方差分析，以組間及組內(nèi)方差判斷樣品中添加農(nóng)藥的含量是否有顯著性差異，從而檢驗其均勻性。結(jié)果回收后，以參加者結(jié)果統(tǒng)計分析所得的能力評定標準差作為σ，再用SS≤0.3σ 準則核驗均檢測試結(jié)果。樣品均勻性檢驗結(jié)果見表1。

表1 均勻性檢驗結(jié)果Table 1 Uniformity test results

樣品間自由度為9，樣品內(nèi)自由度為10，查F檢驗臨界值表可知F0.05（9,10）=3.02，由表1 可知，統(tǒng)計量F 值均小于F0.05（9,10），說明在0.05 顯著水平時能力驗證樣品的均勻性良好，可以進行樣品發(fā)送。本次能力驗證樣品均檢核驗結(jié)果都符合Ss≤0.3σ 準則，表明樣品之間的差異對隨后的統(tǒng)計評價沒有顯著影響。

2.2.2 樣品穩(wěn)定性檢驗分析 穩(wěn)定性檢驗主要考察運輸和時間對樣品中農(nóng)藥含量的影響，在均勻性檢驗合格后模擬運輸條件（采用與能力驗證樣品發(fā)放使用的快遞公司，將樣品郵寄到?？诤秃诤雍笤俜謩e寄回進行檢測）進行運輸穩(wěn)定性檢驗。在項目實施周期內(nèi)前中后三個時間段抽取樣品進行儲存穩(wěn)定性檢驗，每次均按照隨機數(shù)表從剩余樣品中各抽取6 個樣品，測試過程中所依據(jù)的標準、所用試劑、測試條件等與均勻性測試時相同。

2.2.2.1 運輸穩(wěn)定性檢驗分析 樣品的運輸穩(wěn)定性檢驗結(jié)果如表2 所示。

表2 運輸穩(wěn)定性檢驗結(jié)果Table 2 Transport stability test results

運輸穩(wěn)定性測試結(jié)果以t檢驗法進行統(tǒng)計，取6 個樣品寄往海口，6 個樣品寄往黑河，查臨界值表可知t0.05（24）=2.06。由表2 中數(shù)據(jù)可知，t 值均小于t0.05（24），說明在0.05 顯著水平時，運輸過程對樣品穩(wěn)定性無影響。

2.2.2.2 儲存穩(wěn)定性檢驗分析 樣品的儲存穩(wěn)定性檢驗結(jié)果如表3 所示。

表3 儲存穩(wěn)定性檢驗結(jié)果Table 3 Storage stability test results

參加者反饋數(shù)據(jù)回收之后，依據(jù)|x -y|≤0.3σ 準則進行穩(wěn)定性核驗。由表3 中數(shù)據(jù)可知，三次穩(wěn)定性檢驗分別得到的均值與均勻性檢驗均值的差值除以參加者檢測數(shù)據(jù)匯總統(tǒng)計得出的標準偏差σ，比值均小于0.3，表明在整個測試期間，樣品中的被測物質(zhì)是穩(wěn)定的，達到了能力驗證樣品要求。

2.3 能力驗證數(shù)據(jù)統(tǒng)計及結(jié)果分析

2.3.1 定性篩查能力評價 本次能力驗證計劃共有20 家實驗室參加，全部按要求返回結(jié)果，以各實驗室對空白樣品本底中確定含有的農(nóng)藥數(shù)量和添加樣品中指定農(nóng)藥的檢出數(shù)量來評估其定性篩查能力，見表4。

表4 實驗室定性篩查能力Table 4 Laboratory qualitative screening capability

2.3.2 定量檢測能力評價

2.3.2.1 實驗室定量檢測結(jié)果分布情況 匯總各實驗室返回的定量結(jié)果后繪制頻率分布直方圖，發(fā)現(xiàn)考核樣品中添加農(nóng)藥的檢測結(jié)果滿足單峰、近似正態(tài)分布條件[28]，因此后續(xù)可采用穩(wěn)健統(tǒng)計方法對檢測項目進行定量分析評價，見圖1。

圖1 定量檢測結(jié)果頻率分布直方圖Fig.1 Histogram of frequency distribution of quantitative detection results

2.3.2.2 實驗室定量檢測結(jié)果統(tǒng)計 實驗室在定量過程提交的數(shù)據(jù)為扣除基質(zhì)本底后的結(jié)果，采用穩(wěn)健統(tǒng)計技術(shù)分析項目的穩(wěn)健平均值、穩(wěn)健標準差和結(jié)果不確定度。以穩(wěn)健平均值作為指定值，穩(wěn)健標準差作為能力評定標準差[29]。因樣品中添加的17 種農(nóng)藥的指定值的標準不確定度均小于能力評定標準差的1/3，故本次能力驗證中的不確定度可忽略不計，檢測結(jié)果的主要統(tǒng)計量匯總情況見表5。

表5 定量檢測結(jié)果統(tǒng)計量Table 5 Statistics of quantitative detection results

2.3.2.3 實驗室定量評價的z 值分布情況 對于本次能力驗證參加者的定量結(jié)果，采用z 比分數(shù)進行評價：

式中：x 為參加者結(jié)果；X 為指定值；σ為能力評定標準差。

為了清晰表示參加者的結(jié)果，以實驗室代碼為橫坐標，參加者經(jīng)統(tǒng)計計算的z 值為縱坐標，并按由小到大的順序排列作柱狀圖，見圖2。

圖2 定量評價z 比分數(shù)分布Fig.2 Quantitative evaluation of Z-score distribution

通過z 比分數(shù)柱狀圖，可以看出發(fā)生正偏離和負偏離的參加者數(shù)量接近，未見明顯的正偏離或負偏離的傾向，同時絕大多數(shù)參加者的z 值落于|z|≤2 的滿意區(qū)間內(nèi)，符合統(tǒng)計規(guī)律。實驗室可通過該圖將其定量能力與其他參加實驗室進行比較，了解其結(jié)果在本次計劃中所處的水平[30]。

2.4 高通量非靶向檢測能力評定

對于實驗室的定性、定量能力評定尚沒有可參照執(zhí)行的標準，本文建立二維（XY）評價，維度X 用于評估參加者應用的多殘留分析方法對添加農(nóng)藥的定性檢出能力，維度Y 用于評估參加者對確定檢出農(nóng)藥中定量分析滿意情況，并引入c 值的概念，探討一種評價實驗室高通量非靶向檢測能力的新方法，見表6。

表6 實驗室高通量非靶向檢測能力Table 6 Laboratory high-throughput non-targeted detection capabilities

式中：a 為定性滿意率；b 為定量滿意率；c 為綜合滿意率。

以扣除空白后添加樣品定性定量結(jié)果對本次能力驗證進行考核。在20 家參加實驗室中，有14 家實驗室定性滿意率為100%，占參加人數(shù)的70%；有9 家實驗室定量滿意率為100%，占參加人數(shù)的45%，有8 家實驗室定性滿意率a 值和定量滿意率b 值均為100%，同時綜合滿意率c 值為0，占參加人數(shù)的40%，可見c 值評價嚴格于單一的定性評價或者定量評價，更能反映出實驗室的綜合檢測能力。在分析完c 值后，需要進一步對實驗室的假陽性率和假陰性率進行分析。由表6 可知，已檢測并量化測試項目中全部的農(nóng)藥且報告無假陽性的實驗室有9 家；報告假陽性的實驗室有7 家，其中2 家未能檢測出測試項目中全部的農(nóng)藥；未能檢測出測試項目中全部的農(nóng)藥，報告假陰性的實驗室有6 家。為了更直觀的展現(xiàn)出實驗室高通量非靶向檢測能力情況，本文以定性滿意率和定量滿意率繪制能力分布圖，見圖3。

圖3 實驗室高通量非靶向檢測能力分布圖Fig.3 Distribution of high-throughput non-targeted detection capabilities in the laboratory

c 值越小則越接近雙百分率，表明實驗室的高通量非靶向檢測能力越強。由圖3 可以直觀地看出代碼為1，4，5，9，11，14，19，20 的實驗室c 值為雙百分率，表明這8 家實驗室的高通量非靶向檢測能力強。代碼為7 的實驗室c 值最大，表明其高通量非靶向檢測能力偏弱，但定性滿意率和定量滿意率一致，均為41.2%，在定性篩查出的農(nóng)藥定量檢測后均獲得滿意結(jié)果，后續(xù)需要進一步提升其高通量非靶向農(nóng)藥定性篩查能力。代碼為13 的實驗室添加農(nóng)藥全部檢出，定性滿意率為100%，但只有5 個檢測項目|z|小于2，定量滿意率僅為29.4%，實驗室需加強其高通量非靶向農(nóng)藥定量檢測能力。特別注意到代碼為14 的實驗室，雖然其c 值為0，但其假陽性率為5.6%，仍不能說明其檢測能力達到滿意水平。故在高通量非靶向能力評定時，可將c 值作為一級評價指標，假陽性率和假陰性率作為二級評價指標，綜合進行評價。在高通量非靶向檢測中，定性篩查是基礎，定量檢測是關(guān)鍵，二者缺一不可，故將定性分析和定量分析法聯(lián)合應用于高通量非靶向農(nóng)藥殘留篩查能力驗證結(jié)果評價，評價結(jié)果更加合理，對其他能力驗證結(jié)果評價具有重要的參考意義。本機構(gòu)將在后續(xù)的能力驗證活動中繼續(xù)推行該種評價方法以驗證評價方式的可行性，并在獲得足夠的樣本量后，進一步將c 值量化，區(qū)分出結(jié)果滿意、可疑和不滿意的臨界值標準。

3 結(jié)論

能力驗證一般采用z 比分數(shù)評價各實驗室對單一特定參數(shù)的檢測能力，但對于多特性值的實驗室間比對結(jié)果缺乏綜合評價的有效手段。XY 二維分析根據(jù)對各特性值的篩查和準確定量情況進行評價，既避免了報告假陽性被評判為“滿意”，又避免了篩查不全出現(xiàn)假陰性被評判為“滿意”，為評價實驗室的綜合檢測能力提供了一種值得嘗試的相對科學、有效的方法。本文以實驗室對蘋果基質(zhì)樣品中17 種農(nóng)藥的檢出情況評估其定性篩查能力，以穩(wěn)健統(tǒng)計獲得的z 比分數(shù)落于|z|≤2 滿意區(qū)間的情況評估其定量準確能力，結(jié)合假陽性和假陰性情況，探討了定性定量分析在評價實驗室綜合檢測能力的應用。

本方法仍有不足之處：a.需提高數(shù)據(jù)庫準確度。在定性分析時，出現(xiàn)假陰性的實驗室通常使用的是低分辨質(zhì)譜，可能未完全覆蓋農(nóng)藥目標清單中的所有分析物，由于農(nóng)藥多數(shù)存在同分異構(gòu)體，實驗室在建立數(shù)據(jù)庫時，要使用更多品種的標準物質(zhì)以提高數(shù)據(jù)信息的可靠性。b.需考慮參加者的數(shù)量。由于從少量參加者測量結(jié)果獲得的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可能不夠可靠，因而可能會依據(jù)不適當?shù)膶φ战M對參加者進行評估。c.需考慮指定值的離散性。在定量分析時，若實驗室的檢測水平差別較大，來自參加者結(jié)果得到的能力評定標準差往往偏大，也有可能被評判為“滿意”，此時需考慮確定指定值和適當?shù)碾x散性度量方法。d.需建立綜合評價指標量化值。在后續(xù)能力驗證活動中將繼續(xù)推行該種評價方法以驗證評價方式的可行性，并區(qū)分出結(jié)果滿意、可疑和不滿意的臨界值標準。以上是多特性值結(jié)果綜合評價面臨的局限，有待進一步研究、發(fā)展更加客觀公正、科學可行的高通量非靶向檢測能力評價方法。