佟沫儒，李培培，張 偉,2,3,4，俞 浩，吳德玲,2,3,4,*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230012；2.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點實驗室，安徽合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制傳承基地，安徽合肥 230012；4.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽合肥 230012；5.亳州學(xué)院，安徽亳州 236800）

生姜為姜科姜屬植物姜（Zingiber officinaleRosc.）的根莖，作為一種藥食同源的作物，具有解表散寒、溫中止嘔、溫肺止咳、解毒的功效[1-2]，主要有揮發(fā)油、姜辣素、二苯基庚烷類成分，還含有生姜多糖、糖蛋白及一些微量元素[3-4]。有研究表明生姜具有提高消化酶活性、抑制血小板凝聚、降血脂、抗氧化、防腐抑菌等多方面生物活性[5-8]。生姜具有廣闊的市場前景，隨著其種植面積的增多和市場對高質(zhì)量生姜制品需求的增長，生姜的加工及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)已經(jīng)成為生姜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢[9-10]。然而新鮮生姜在加工過程（刮皮）中由于受到機械損傷，會產(chǎn)生褐變、失水及組織軟化等問題，使?fàn)I養(yǎng)價值及食用品質(zhì)降低，如姜辣素、黃酮、總酚含量大幅降低，尤其是褐變問題尤為突出，嚴(yán)重制約了生姜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[11-12]。

目前為防止新鮮果蔬發(fā)生褐變多采用亞硫酸鹽類化學(xué)護色劑、防腐劑[13]及檸檬酸[14]、抗壞血酸[15]、1-甲基環(huán)丙烯[16]等化學(xué)護色劑進行護色，但這些化學(xué)護色劑的使用條件和濃度要求高，還可能損害果蔬品質(zhì)，存在食品安全隱患[17]。出于經(jīng)濟成本、安全性、消費者接受度等方面的原因，目前可食性涂膜的應(yīng)用日益增多[18]?？墒承酝磕な且蕴烊豢墒承晕镔|(zhì)（如多糖、蛋白質(zhì)、脂類等）為原料，通過不同分子間相互作用，并以包裹、涂布、微膠囊等形式覆蓋于果蔬表面，以阻隔水氣、氧氣或各種溶質(zhì)的滲透，起保護作用的薄層，進而達(dá)到抑制果蔬褐變的效果[19-20]。殼聚糖作為果蔬護色劑已廣泛應(yīng)用于日常水果的護色，而且性能穩(wěn)定，安全無毒，得到了行業(yè)的高度認(rèn)可[21-22]。海藻酸鈉是從褐藻類海帶或馬尾藻中提取的天然多糖，是多羥基、多極性高分子化合物，可生物降解，生物相容性好[23-24]?？ɡz可作防腐劑載體，能顯著地降低食品中水分的損失，對氧氣有一定的阻隔作用，既可將食品與外界環(huán)境隔開，同時也保證了食品質(zhì)量[25]。但單一涂膜存在成膜性能不夠好、機械性能較弱[26]和果蔬失重率變化較大[27]等缺陷，復(fù)合涂膜劑則彌補了這些缺點，可通過各組分間的功能互補和特定的配比組合，提高護色效果[28]。馬利華等[29]發(fā)現(xiàn)殼聚糖、卡拉膠、海藻酸鈉組成復(fù)合涂膜可明顯降低山藥的褐變程度，防止貯藏后期酚類物質(zhì)的氧化，進而提高鮮切山藥的整體抗氧化能力，說明復(fù)合涂膜不僅有很好的護色效果，還可保持果蔬抗氧化能力。有研究表明生姜刮皮后暴露在空氣中與氧氣接觸是發(fā)生褐變的重要原因之一[12]，可通過可食性涂膜天然無毒、可隔絕氧氣等特點對生姜進行護色。而目前關(guān)于生姜的護色研究主要通過復(fù)合化學(xué)抑制劑[30]、化學(xué)護色劑結(jié)合可食性涂膜[31]、單一涂膜劑[32]等方式進行護色，未在復(fù)合可食性涂膜方面形成完整的護色工藝。

綜上所述，為抑制生姜在加工過程中發(fā)生褐變并且不損害生姜品質(zhì)，本研究以刮皮生姜為原料，運用響應(yīng)面法優(yōu)化抑制刮皮生姜褐變的復(fù)合涂膜護色工藝參數(shù)，篩選出最佳護色方法，形成穩(wěn)定可靠的刮皮生姜防褐變的復(fù)合可食性涂膜護色技術(shù)，為抑制生姜在加工過程中發(fā)生褐變、提高生姜產(chǎn)品的商業(yè)價值提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生姜 購自菜市場，選取大小一致、表皮完整，無機械損傷及病害的新鮮生姜，儲藏存放地點：安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥與天然藥物系；殼聚糖、海藻酸鈉、卡拉膠、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、硝酸鋁、亞硝酸鈉 均購自上海麥克林生化科技有限公司；福林酚購自西亞化學(xué)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%） 購自北京百靈威科技有限公司；香草醛標(biāo)準(zhǔn)品（99.5%）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉 購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；DPPH 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純；水為去離子水。

JY2003 型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；UV-8000 型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；H1750R 型冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋常州國宇儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 涂膜劑的制備 殼聚糖涂膜劑的配制：準(zhǔn)確稱量一定量的殼聚糖，加入60 ℃蒸餾水中，配成濃度為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%殼聚糖溶液。

海藻酸鈉涂膜劑的配制：準(zhǔn)確稱量一定量的海藻酸鈉，加入60 ℃蒸餾水中，配成濃度為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%海藻酸鈉溶液。

卡拉膠涂膜劑的配制：準(zhǔn)確稱量一定量的卡拉膠，加入40 ℃蒸餾水中，配成濃度為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%卡拉膠溶液。

1.2.2 護色工藝的優(yōu)化

1.2.2.1 涂膜劑處理刮皮生姜的單因素實驗 選取刮皮生姜作為試驗材料，將其清洗，刮皮，并進行分組，分別整塊浸泡于配制好的上述單一護色涂膜溶液中10 min，以浸泡蒸餾水10 min 的刮皮生姜為空白對照組；取出自然晾干，4 ℃貯藏15 d（對照組已經(jīng)開始腐爛），每5 d 測定各組刮皮生姜的失重率、褐變度及總酚含量。

1.2.2.2 Box-Beheken 優(yōu)化試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以卡拉膠濃度、殼聚糖濃度、海藻酸鈉濃度為研究因素，根據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計原理設(shè)計三因素三水平實驗，以刮皮生姜以刮皮生姜護色最主要的褐變度為衡量指標(biāo)，以期得到最佳護色效果，其響應(yīng)面試驗設(shè)計見表1。

表1 Box-Beheken 試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Beheken test

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 失重率測定 采用稱重法[33-34]，先用電子天平稱新鮮刮皮生姜，4 ℃儲藏每隔5 d 測定一次生姜重量，重復(fù)三次。計算方法如下：

式中：m0表示刮皮生姜初始重量，mg；m 表示刮皮生姜定期測量的重量，mg。

1.2.3.2 褐變度測定 采用吸光值法[30,34]。將生姜樣品洗凈，刮皮切片，稱取5.0 g 生姜加入50 mL 蒸餾水，于低溫4 ℃下勻漿2 min，4000 r/min 條件下離心5 min，在波長420 nm 處測定上清液的吸光值，褐變度結(jié)果以A420表示，每隔5 d 測定一次。數(shù)值越小，褐變度越低。

1.2.3.3 總酚含量測定 采用林倩等[35]的方法進行測定。取0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.50 mL 濃度為0.1 mg/mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25 mL 容量瓶中，分別加入4.5 mL 福林酚試劑，混勻，靜置30 s，再分別加入9 mL 10% Na2CO3定容至25 mL，避光放置2 h，以0 樣為空白，在760 nm 波長下測吸光度。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為：y=0.1573x-0.0013，R2=0.9994。

再取5 g 刮皮生姜，冰浴研磨，用60%乙醇溶解，50 mL 容量瓶定容，提取2 h，過濾，取濾液10 mL，定容至25 mL 備用。取1 mL 處理液至25 mL 容量瓶中，其它步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線建立。

1.2.3.4 總黃酮含量測定 參照賈茹羽[12]的方法進行測定。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，以1:25 的料液比加入80%乙醇溶液，在超聲功率300 W 條件下超聲溶解1 h，再轉(zhuǎn)移到50 mL 容量瓶中，并定容后得質(zhì)量濃度0.4 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 于25 mL 容量瓶中，分別加入1 mL 5%的NaNO2溶液，1 mL 10%的Al（NO3）3溶液和10 mL 4% NaOH溶液，加溶液之前搖勻振蕩6 min，最后加入80%乙醇溶液定容，靜置20 min 后測定吸光值。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為：y=6.3542x+0.0292，R2=0.9991。

再準(zhǔn)確稱取1 g 樣品，以1:25 的料液比加入80%乙醇溶液，在超聲功率300 W 頻率條件下超聲提取1 h，定容至50 mL。吸取1 mL 80%的乙醇，1 mL 上述提取液于25 mL 棕色容量瓶中分別加入1 mL 5%的NaNO2溶液，1 mL 10%的Al（NO3）3溶液，10 mL 4%的NaOH 溶液，加溶液之前搖勻振蕩6 min，最后加入80%乙醇溶液定容，靜置20 min 后定吸光值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算生姜黃酮的含量。

1.2.3.5 姜辣素含量測定 參照賈茹羽[12]的方法測定。在0.0500 g 香草醛標(biāo)準(zhǔn)品中，加入適量95%乙醇溶液并定容至25 mL，吸取上述溶液1 mL 再加入適量95%乙醇溶液定容至100 mL，得到20.00 μg/mL濃度的香草醛標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加入適量95%乙醇溶液來定容，得到2、4、6、8、10、12 μg/mL 濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)液，以95%乙醇作為空白對照，于280 nm 下測定吸光值。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為：y=0.0608x+0.0223，R2=0.9993。

再準(zhǔn)確稱取1 g 樣品于100 mL 圓底燒瓶中，加入70 mL 95%的乙醇，在65 ℃水浴提取120 min，靜置冷卻，定容，過濾，得到姜辣素樣品。吸取1 mL樣品于50 mL 容量瓶中，加入適量95%乙醇溶液定容，混勻。以95%乙醇為空白對照，于280 nm 處測定吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算姜辣素的含量。

1.2.3.6 DPPH 自由基清除率實驗 采用DPPH 自由基清除能力檢測試劑盒，按照試劑盒說明書方法測定樣品的DPPH 自由基清除能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實驗數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0 對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及作圖測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示；響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)用Design-Expert 11.0 軟件進行響應(yīng)面試驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一涂膜劑護色效果

2.1.1 不同濃度殼聚糖對失重率、褐變度及總酚含量的影響 生姜的失重率是評價護色劑保鮮效果最直觀的指標(biāo)[35]；褐變度反映果蔬顏色的變化，是食品的重要品質(zhì)指標(biāo)[12]；總酚為酚類物質(zhì)，是果蔬組織褐變發(fā)生的基礎(chǔ)物質(zhì)，并且其含量可以反映果蔬的抗氧化活性[36]。由圖1 可以分析得出，隨著貯藏時間的延長，不同濃度殼聚糖處理的生姜失重率、褐變度整體均呈上升趨勢，而總酚的含量呈下降趨勢。且處理組與對照組有顯著性差異（P＜0.05）。由圖1a～圖1b可以看出，濃度為1.6%和2.0%殼聚糖處理下的刮皮生姜的失重率、褐變度較低（P＜0.05）。圖1c 中可以看出，刮皮生姜中總酚的含量降低得愈加緩慢，且當(dāng)濃度為1.6%和2.0%時，總酚含量降低得最慢。綜合分析效果最佳的殼聚糖濃度為1.6%、2.0%，故最終選用濃度為1.2%～2.0%殼聚糖進行響應(yīng)面試驗。

圖1 不同濃度殼聚糖對失重率、褐變度及總酚含量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of chitosan on weight loss, browning and total phenolic content

2.1.2 不同濃度海藻酸鈉對失重率、褐變度及總酚含量的影響 由圖2 可以分析得出，隨著貯藏時間的延長，不同濃度海藻酸鈉處理的生姜失重率、褐變度整體均呈上升趨勢，而總酚的含量呈下降趨勢，且處理組與對照組有顯著性差異（P＜0.05）。由圖2a～圖2b可以看出，濃度為2.0%海藻酸鈉處理下的刮皮生姜的失重率、褐變度最低（P＜0.05）。圖2c 中可以看出，刮皮生姜中總酚的含量降低得愈加緩慢，且當(dāng)濃度為2.0%時，總酚含量降低得最慢。綜合分析效果最佳的海藻酸鈉濃度為2.0%，故最終選用濃度為1.6%～2.0%海藻酸鈉進行響應(yīng)面試驗。

圖2 不同濃度海藻酸鈉對失重率、褐變度及總酚含量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of sodium alginate on weight loss, browning and total phenolic content

2.1.3 不同濃度卡拉膠對失重率、褐變度及總酚含量的影響 由圖3 可以分析得出，隨著貯藏時間的延長，不同濃度卡拉膠處理的生姜失重率、褐變度整體均呈上升趨勢，而總酚的含量呈下降趨勢，且處理組與對照組有顯著性差異（P＜0.05）。由圖3a～圖3b可以看出，濃度為1.2%、1.6%、2.0%卡拉膠處理下的刮皮生姜的失重率、褐變度較低（P＜0.05）。圖3c中可以看出，刮皮生姜中總酚的含量降低得愈加緩慢，且當(dāng)濃度為2.0%時，總酚含量降低得較慢。綜合分析效果最佳的卡拉膠濃度為1.2%、1.6%、2.0%，故最終選用濃度為1.2%～2.0%海藻酸鈉進行響應(yīng)面試驗。

圖3 不同濃度卡拉膠對失重率、褐變度及總酚含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of carrageenan on weight loss, browning and total phenolic content

2.2 復(fù)合涂膜劑對生姜的護色效果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以殼聚糖濃度、海藻酸鈉濃度、卡拉膠濃度作為自變量，褐變度為響應(yīng)值，利用 Design-Expert 11.0 軟件設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面的試驗設(shè)計和結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

2.2.2 模型與方差分析結(jié)果 用Design-Expert 11.0軟件對試驗數(shù)據(jù)方差分析，結(jié)果如表3 所示。

表3 模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance table

根據(jù)表3 中的數(shù)據(jù)對試驗結(jié)果回歸擬合，得到回歸模型方程為：Y=0.2776+0.0706A+0.0537B+0.0431C-0.0560AB+0.0168AC-0.865BC+0.0886A2+0.1328B2+0.0566C2。模型的P值為0.0001，說明建立的回歸模型顯著；所建立回歸模型的決定系數(shù)R2為0.9711，說明生姜褐變度的實測值與預(yù)測值擬合較好，可用此模型來預(yù)測不同濃度的殼聚糖、海藻酸鈉、卡拉膠對新鮮生姜褐變度的影響；失擬項P=0.7998＞0.05，失擬項不顯著，無失擬因素存在。各因素對響應(yīng)值的影響可通過方差分析中的F值評價，F(xiàn)值越大，說明對響應(yīng)值的影響越顯著，所以各涂膜對鮮生姜褐變度的影響順序為：殼聚糖＞海藻酸鈉＞卡拉膠。

2.2.3 各因素交互作用分析 采用Design-Expert 11.0 軟件對試驗結(jié)果進行多元回歸分析，得到護色劑殼聚糖濃度（A）、海藻酸鈉濃度（B）、卡拉膠濃度（C）對刮皮生姜褐變度交互影響的響應(yīng)曲面，如圖4所示。

圖4 各因素交互對生姜褐變影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface graph of the interaction of various factors on ginger browning

圖4 所示的響應(yīng)面圖的陡峭程度可以反映出兩個因素的交互作用對響應(yīng)值影響的顯著性，響應(yīng)面圖越陡峭則表明兩個因素的交互作用越顯著[37]。由圖4a 可知，A 軸與B 軸的曲線坡度的變化程度大，說明殼聚糖和海藻酸鈉的交互作用顯著。由圖4b可知A 軸的曲線坡度與C 軸的曲線坡度的變化程度較小，說明殼聚糖和卡拉膠交互作用不顯著。由圖4c 可知，B 軸的曲線坡度與C 軸的曲線坡度的變化程度大，海藻酸鈉和卡拉膠交互作用顯著。上述結(jié)果與方差分析結(jié)果一致：三因素對響應(yīng)值影響大小順序為：殼聚糖濃度＞海藻酸鈉濃度＞卡拉膠濃度，海藻酸鈉與卡拉膠的交互作用最為顯著。

2.2.4 復(fù)合涂膜劑配方的確定及驗證試驗 據(jù)試驗得到的響應(yīng)面數(shù)據(jù)，對上述多元回歸擬合方程用Design-Expert 11.0 軟件進行復(fù)合涂膜的最優(yōu)值預(yù)測，得出三種護色劑最佳配方為殼聚糖為1.399%，海藻酸鈉為1.783%，卡拉膠為1.311%，在此條件下預(yù)測褐變度為0.230。對該優(yōu)化條件進行驗證實驗，平行3 次，該條件下新鮮刮皮生姜的褐變度為0.232，接近理論值，證明該模型可行。結(jié)果表明復(fù)合涂膜護色劑可有效抑制生姜刮皮后發(fā)生褐變，保持生姜有良好的色澤，且采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠有較強的實用價值。

2.3 護色工藝對刮皮生姜品質(zhì)的影響

將護色處理后的刮皮生姜進行各項品質(zhì)指標(biāo)測定，探究該護色工藝對生姜的外觀品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)的影響。由表4 可知，護色處理組的褐變度及失重率與對照組呈顯著差異（P＜0.05），褐變度變化值較低。與王兆升等[32]、賈茹羽[12]、丁君等[31]的研究結(jié)果相比，本研究的復(fù)合涂膜通過阻隔水氣、氧氣或各種溶質(zhì)的滲透，起保護作用的薄層，使處理后生姜褐變度及失重率變化值低，進而達(dá)到抑制刮皮生姜褐變的效果，顯著地降低其水分的損失，同時總酚含量、姜辣素含量及總黃酮含量均顯著高于未進行護色處理的生姜（P＜0.05），可在一定程度抑制品質(zhì)成分含量的損失，并且護色處理組DPPH 自由基清除能力高于對照組（P＜0.05），說明復(fù)合涂膜可有效保留生姜的抗氧化能力。與白琳等[37]、張璇等[38]、賈茹羽[12]結(jié)果相比，由于涂膜劑各組分間的功能互補和特定的配比組合有效防止貯藏后期酚類物質(zhì)的氧化，進而提高刮皮生姜的整體抗氧化能力。

表4 護色處理后儲藏15d 生姜的品質(zhì)指標(biāo)Table 4 Quality indicators of ginger stored for 15 d after color protection treatment

3 結(jié)論

本文以刮皮生姜為原料，在單因素實驗基礎(chǔ)上，對殼聚糖-海藻酸鈉-卡拉膠復(fù)合護色工藝進行了響應(yīng)面優(yōu)化，得到最佳復(fù)合涂膜護色配方為1.399%殼聚糖、1.783%海藻酸鈉、1.311%卡拉膠。在該護色條件下刮皮生姜儲藏15 d 的褐變度為0.232，相比對照組降低了53%，說明該護色工藝可有效抑制生姜褐變，保護生姜色澤；測得姜辣素含量為1.62%，總黃酮含量1.83%，總酚含量53.88 μg/g，失重率0.89%，DPPH 自由基清除能力為442.21 μg Trolox/g，均與對照組有顯著性差異（P＜0.05），說明該護色工藝可在一定程度上保留刮皮生姜在儲藏期間的外觀品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)。并且工藝簡單、生產(chǎn)成本低、綠色安全無污染、所得產(chǎn)品實用方便。可為刮皮生姜的復(fù)合涂膜劑提供數(shù)據(jù)可供參考，對促進生姜的工業(yè)化生產(chǎn)具有理論和現(xiàn)實意義。