岳子堯，董力源，李 戀,2，滿(mǎn)都拉，孫子羽，陳忠軍,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010107）

乳酸菌是日常生活中人們較為熟悉的菌種，不論是酸奶、泡菜還是各類(lèi)飲品都有其參與發(fā)酵，并且在自然界中分布廣泛。乳酸菌在幫助腸道蠕動(dòng)、促進(jìn)消化的同時(shí)，可以降低膽固醇吸收，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，使乳糖不耐受的癥狀得到緩解[1-3]。目前已被證實(shí)某些乳酸菌能夠產(chǎn)生抗菌肽，除抑制細(xì)菌、真菌外，還能對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生滅殺作用[4-5]。乳酸菌抗菌肽因其生物安全性及抑菌活性在食品加工保藏、飼料生產(chǎn)、及醫(yī)藥領(lǐng)域已有較成功應(yīng)用[6]。自乳鏈球菌素Nisin 和片球菌素Pediocins PA1 被批準(zhǔn)作為食品防腐劑以來(lái)[4]，新型乳酸菌抗菌肽已成為最主要研究熱點(diǎn)和重要資源。因此，新型乳酸菌抗菌肽資源的開(kāi)發(fā)挖掘勢(shì)在必行。

真菌污染是食品、飼料、醫(yī)療及環(huán)境領(lǐng)域最廣泛的污染類(lèi)別，不僅給生產(chǎn)帶來(lái)明顯經(jīng)濟(jì)損失，而且真菌毒素直接危害人類(lèi)健康[7]?，F(xiàn)有化學(xué)防霉劑的大量使用導(dǎo)致致腐霉菌和酵母耐藥性增加，采用天然生物防霉劑代替化學(xué)防腐劑勢(shì)在必行[8-9]。由于抗真菌肽提取成本過(guò)高，目前商業(yè)化乳酸菌防霉產(chǎn)品幾乎全部采用了活菌劑型或無(wú)細(xì)胞提取物。

乳酸菌抗菌肽的生物合成發(fā)生在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，一般分泌到細(xì)胞外，但在特殊條件下會(huì)留在細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致抑菌活性降低。有研究表明，乳酸菌的培養(yǎng)基內(nèi)主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)改變后，其產(chǎn)生抗菌肽抑菌活性就會(huì)發(fā)生改變[10-12]。影響乳酸菌抑菌活性的主要因素除了培養(yǎng)基外還有菌株生長(zhǎng)的環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)條件。封成玲等[13]采用單因素與正交試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)酶溶桿菌L-43 的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，使抗菌肽產(chǎn)量進(jìn)一步得到了提高。江晨等[14]采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)花生抗菌肽復(fù)合物的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)制備的花生抗菌肽復(fù)合物可以提高對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和米曲霉的抑菌效果。秦楠等[15]采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌HRH317 菌株產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵條件。Amiri 等[16]對(duì)嗜酸乳桿菌LA-5、乳酸芽孢桿菌BB-12 生物生產(chǎn)抗菌肽及其混合培養(yǎng)物的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，從而增強(qiáng)了對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制活性。目前雖對(duì)于乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵條件做了大量研究，但是大多針對(duì)具有抑制細(xì)菌作用的抗菌肽，而對(duì)于抑真菌肽研究很少。

本課題組前期從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出副干酪乳桿菌ALAC，發(fā)現(xiàn)其分泌的抗真菌肽對(duì)常見(jiàn)食品致腐霉菌和酵母具有強(qiáng)烈抑制活性，且安全無(wú)毒[17-18]。本研究將菌株ALAC 在前期優(yōu)化的乳清培養(yǎng)基中發(fā)酵，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面分析探究接種量、培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度對(duì)其產(chǎn)抗真菌肽的影響，并確定最佳發(fā)酵工藝，為后期制備無(wú)細(xì)胞提取物生產(chǎn)抗真菌肽粉奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副干酪乳桿菌ALAC 本實(shí)驗(yàn)室保存；指示菌白假絲酵母（Candida albicans） 編號(hào)為32819，來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；乳清粉 浙江一諾生物科技有限公司；牛肉膏、酵母膏、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取粉 廣東環(huán)凱維生物科技有限公司；氯化鈉、檸檬酸氫二胺、磷酸氫二鉀、硫酸錳、瓊脂粉、硫酸銨、TWEEN80、硫酸鎂、蔗糖、磷酸氫二鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙酸鈉、葡萄糖 天津市大茂化學(xué)試劑廠；酶水解酪蛋白 北京酷來(lái)博科技有限公司；所用試劑均為分析純。

HZQ-F100 型全溫震蕩培養(yǎng)箱 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；H3018DR 型高速冷凍離心機(jī) 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；DHG-9053A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱、HZQ-311C 型落地振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JM-A6002 型電子天平 諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD 型雙人單面垂直凈化工作臺(tái) 哈爾濱市東聯(lián)公司；XH-C 型漩渦混勻器 常州未來(lái)儀器制造有限公司；IKARV10digital型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；P0-1000 型單道移液器 梅特勒-托利多儀器有限公司；LDZX-75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；SYNERGY H1 型酶標(biāo)儀雷康恒泰商貿(mào)有限公司；MCCWS 乳成分分析儀Milkotronic 有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 MRS 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、Tween 80 1 mL/L、酵母提取粉5 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、硫酸錳0.25 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、無(wú)水乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二氨2 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、牛肉浸膏10 g /L、細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L，調(diào)節(jié)pH 至6.5，121 °C 滅菌20 min。

YEPD 液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、大豆蛋白胨20 g/L、酵母提取粉10 g/L，調(diào)節(jié)pH 至6.0，121 ℃滅菌20 min。

YEPD 固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、大豆蛋白胨20 g/L、酵母提取粉10 g/L，瓊脂粉15 g/L，調(diào)節(jié)pH 至6.0，121 ℃滅菌20 min。

水瓊脂固體培養(yǎng)基：瓊脂粉15 g/L，121 °C 滅菌20 min。

乳清培養(yǎng)基：乳清液100 g/L、酶水解酪素5 g/L、葡萄糖1 g/L、酵母提取粉2 g/L。

1.2.2 乳桿菌ALAC 的活化 將斜面保存的乳桿菌ALAC 按4%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，180 r/min，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，活化至三代后備用。

1.2.3 指示菌（白假絲酵母）的活化 將斜面保存的白假絲酵母菌按4%接種量接種于YEPD 液體培養(yǎng)基中，180 r/min，30 ℃條件下48 h，活化至三代后備用。

1.2.4 指示菌菌懸液制備 將活化三代的白假絲酵母稀釋?zhuān)瑢?.1 mL 菌液吸入0.9 mL 生理鹽水的無(wú)菌EP 管中，混合均勻，重復(fù)操作，稀釋至10-6倍備用。

1.2.5 乳清培養(yǎng)基中乳清液的制備 將100 g 乳清粉加入1 L、90 ℃蒸餾水中（先加熱水，再加乳清粉以防糊狀）。用0.1 mol/L 鹽酸溶液把以上溶液pH調(diào)成4.5，90 ℃恒溫水浴30 min，使酪蛋白凝結(jié)沉淀成塊。用脫脂棉、紗布過(guò)濾，然后用1 mol/L 氫氧化鈉溶液將濾后乳清液的pH 調(diào)成6.5，煮沸后進(jìn)行抽濾，115 ℃滅菌20 min 后4 ℃冷藏備用。

1.2.6 乳桿菌抗真菌肽發(fā)酵液的處理 將活化至三代的乳酸菌ALAC 按4%接種量分別接種到乳清培養(yǎng)基中，在180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液離心分離去除菌體及沉淀（8000 r/min，20 min，4 ℃），取上清液在50 ℃、0.075 MPa 條件下濃縮至10%。

1.2.7 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 菌株接種量對(duì)乳酸菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響 將乳桿菌ALAC 分別按1%、2%、3%、4%、5%的接種量接入乳清培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液離心分離濃縮后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.7.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響

將乳桿菌ALAC 按4%的接種量接入培養(yǎng)基，37 ℃下分別培養(yǎng)18、24、30、32、36、42 h，同上處理后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.7.3 發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響

將乳桿菌ALAC 按4%接種量接入乳清培養(yǎng)基，分別在27、32、37、42、47 ℃下培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液同上處理后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.7.4 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)乳酸菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響 將乳桿菌ALAC 按4%接種量接入乳清培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)pH 到6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，37 ℃下培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液同上處理后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.8 響應(yīng)面試驗(yàn) 由單因素實(shí)驗(yàn)得出最佳發(fā)酵條件后，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)抑菌圈影響較大的3 個(gè)因素，培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度，利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。以各因最優(yōu)取值為中心，上下區(qū)域各取1 個(gè)水平值作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平見(jiàn)表1。通過(guò)發(fā)酵濃縮液的抑菌圈大小作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)，其中零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次，采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.2.9 牛津杯法檢測(cè)抑菌性 配制水瓊脂及YEPD培養(yǎng)基，滅菌備用。將水瓊脂加熱融化，取15 mL 倒入培養(yǎng)皿中，凝固后在固體瓊脂上放置三只牛津杯（呈正三角形形狀）。將稀釋后的白假絲酵母按4%比例接入35 ℃左右25 ml YEPD 培養(yǎng)基中，將其倒入已凝固的瓊脂培養(yǎng)基待凝固。凝固后培養(yǎng)皿呈明顯兩層狀態(tài)，遂取出牛津杯，在孔洞中加入200 μL 發(fā)酵濃縮液，37 ℃培養(yǎng)24 h 觀察結(jié)果。每組試驗(yàn)進(jìn)行三次，計(jì)算平均值?？梢酝ㄟ^(guò)比較抑菌圈大小（包含牛津杯的直徑7 mm）來(lái)反應(yīng)其抑菌性強(qiáng)弱。

1.2.10 抗菌肽粗提粉的品質(zhì)分析 抗菌肽發(fā)酵液粗提粉制備，將濃縮至10%的發(fā)酵粗提液進(jìn)行冷凍干燥，36 h 后取出研磨成均勻粉末4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

理化指標(biāo)測(cè)定：將抗菌肽粗提粉添加10 倍的蒸餾水溶解均勻，通過(guò)乳成分分析儀進(jìn)行蛋白質(zhì)、乳糖、脂肪理化指標(biāo)測(cè)定。水分含量測(cè)定根據(jù)GB 5009.3-2016 中的直接干燥法測(cè)定。抗菌肽粗提粉微生物指標(biāo)檢測(cè)，菌落總數(shù)測(cè)定方法參考GB 4789.2-2016。大腸菌群數(shù)測(cè)定方法參考GB 4789.3-2016。致病菌（志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌）測(cè)定方法參考GB 4789.10-2016。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，采用SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)，采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，采用Originpro 2019，excle 2016 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌ALAC 發(fā)酵條件單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 接種量對(duì)菌株產(chǎn)抗菌肽的影響 通過(guò)前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)菌株對(duì)大多數(shù)霉菌和酵母具有抑菌性，尤其對(duì)白假絲酵母具有極強(qiáng)抑菌性，且白假絲酵母為食品中常見(jiàn)的致病致腐酵母，故將其作為指示菌來(lái)測(cè)定乳桿菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的抑菌效果。通過(guò)研究不同接種量對(duì)乳桿菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響（圖1），發(fā)現(xiàn)接種量對(duì)菌株抑菌效果有顯著影響（P＜0.05），隨著接種量的增加，抑菌圈直徑迅速增大，在接種量為4%條件下發(fā)酵液的抑菌圈直徑達(dá)到峰值16.47 mm，再繼續(xù)增大接種量抑菌圈直徑減小。據(jù)研究表明，細(xì)菌素合成在對(duì)數(shù)期，一定程度加大接種量會(huì)加速菌種生長(zhǎng)，快速到達(dá)對(duì)數(shù)期，從而加速合成細(xì)菌素，使抑菌活性增強(qiáng)[19]。從圖1 中可以看出當(dāng)接種量高于4%時(shí)抑菌圈直徑有明顯的下降趨勢(shì)，可能是由于乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中，一定的空間內(nèi)微生物數(shù)量增加會(huì)引起生存空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的爭(zhēng)奪，因而造成菌株生長(zhǎng)情況下降，抗菌物質(zhì)合成受阻，抑菌圈直徑變小。也可能是接種量過(guò)大，縮短合成時(shí)間，產(chǎn)量有很大程度的下降，抗菌肽的活性也會(huì)降低，這可能也與細(xì)菌素吸附到產(chǎn)生菌菌體表面有關(guān)[20]。

圖1 接種量對(duì)抑菌效果的影響Fig.1 Effect of inoculum on antibacterial efficacy

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)抗菌肽的影響 由圖2 所示，發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌效果有顯著影響（P＜0.05），抑菌圈直徑隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先迅速增高，在24 h 達(dá)到峰值16.78 mm，后隨著發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)發(fā)酵液抑菌活性呈逐漸下降趨勢(shì)。通常來(lái)說(shuō)，抗菌肽在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期開(kāi)始合成，在指數(shù)生長(zhǎng)末期或穩(wěn)定前期達(dá)到最大量[21]。副干酪乳桿菌ALAC 的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為18～30 h[22]，生長(zhǎng)24 h 時(shí)乳桿菌正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)活性最強(qiáng)，菌株抑菌活性與生長(zhǎng)曲線(xiàn)變化基本一致，這與王瑤等[23]研究發(fā)現(xiàn)相符，即植物乳桿菌LPL-1 菌株的細(xì)菌素產(chǎn)量與生長(zhǎng)曲線(xiàn)有一致性。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)但抑菌活性逐漸降低，這可能是菌體進(jìn)入衰亡期，合成抗菌肽能力減弱導(dǎo)致抗菌活性下降。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響Fig.2 Effect of fermentation time on antibacterial efficacy

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)菌株產(chǎn)抗菌肽的影響 研究不同的發(fā)酵溫度對(duì)菌株合成抗菌肽的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3）隨著發(fā)酵溫度的增長(zhǎng)，抑菌圈直徑呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在37 ℃達(dá)到峰值16.93 mm，超過(guò)37 ℃后抑菌圈直徑大幅降低。Ogunbanwo 等[24]研究發(fā)現(xiàn)30 ℃時(shí)最有利于植物乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素，這與本研究結(jié)果不同，說(shuō)明不同菌株產(chǎn)抗菌肽的最適發(fā)酵溫度不同，這與抗菌肽的合成機(jī)制有關(guān)[25]，也有可能該菌株抗菌物質(zhì)代謝途徑受到阻礙導(dǎo)致抑菌活性下降。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)抑菌效果的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on antibacterial efficacy

2.1.4 初始pH 對(duì)菌株產(chǎn)抗菌肽的影響 培養(yǎng)基初始pH 在5.5～7.0 范圍內(nèi)時(shí)（圖4），抑菌圈直徑不斷增加，在pH 為7 時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到峰值17.1 mm，隨后抑菌圈直徑下降。研究表明乳酸菌的最適生長(zhǎng)pH 與細(xì)菌素合成的最適pH 可能不相同[26]。乳桿菌最適生長(zhǎng)pH 在5.5～6.0 左右，但在酸性條件下抗菌肽的轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程受阻，導(dǎo)致抑菌活性低；也可能是菌體細(xì)胞在不同pH 條件下對(duì)抗菌肽的吸附能力不同[27]，不利于代謝生成抑菌物質(zhì)。在培養(yǎng)基初始pH為7.0 時(shí)盡管菌體生長(zhǎng)未處于最佳狀態(tài)，但此時(shí)生成的抑菌物質(zhì)活性最強(qiáng)。

圖4 初始pH 對(duì)抑菌效果的影響Fig.4 Effect of initial pH on antibacterial efficacy

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取A 接種量、B 發(fā)酵時(shí)間、C 初始pH 3 個(gè)因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)對(duì)乳桿菌ALAC 培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化。利用Design-Expert8.0.6 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理及模型的建立。試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

將得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Design-Expert10.0.7 軟件對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到抑菌圈直徑與各因素變量的二次回歸方程如下：Y=17.10-0.31A-0.075B-0.44C+0.22AB-0.25AC+0.075BC-1.80A2-1.88B2-1.85C2，此方程試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表3。

表3 Box-Behnken 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for Box-Behnken regression model

由表3 可知，模型決定系數(shù)R2為0.9688，說(shuō)明抑菌圈直徑的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擬合較好，96.88%的抑菌圈直徑大小變化可用此回歸方程模型來(lái)解釋?zhuān)梢暂^好的反映出抑菌圈直徑與接種量、發(fā)酵時(shí)間和初始pH 之間的關(guān)系。調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.9287，說(shuō)明92.87%實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用該方程解釋且抑菌圈大小由92.87%受實(shí)驗(yàn)因素影響。該模型的P值＜0.01，具有顯著性，失擬項(xiàng)P值0.9674＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，模型擬合度好，能較好的反映響應(yīng)面的變化，描述本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。綜上所述，以抑菌圈直徑為響應(yīng)值建立的乳酸菌最佳發(fā)酵工藝模型，可對(duì)不同發(fā)酵條件下乳酸菌抑菌能力進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)可知，A2、B2、C2抑菌圈直徑大小的影響極顯著（P＜0.01），C 對(duì)抑菌圈直徑大小的影響顯著（P＜0.05）。根據(jù)表中F值可知，各因素對(duì)抑菌圈大小影響程度為C＞A＞B，即：初始pH＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面交互效應(yīng)分析 圖5 是接種量和發(fā)酵時(shí)間影響抑菌活性的響應(yīng)面圖。從圖中可以看出當(dāng)初始pH 不變，發(fā)酵時(shí)間處于最值時(shí)，隨著接種量的增加，抑菌圈直徑呈先增加后下降趨勢(shì)；接種量處于最值時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間增加，抑菌圈大小呈現(xiàn)出相同趨勢(shì)。發(fā)酵時(shí)間與接種量的曲面較陡，對(duì)抑菌活性影響顯著。

圖5 接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of the effect of inoculation amount and fermentation time on antibacterial activity

從圖6 可以看出，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間不變，接種量處于最值時(shí)，隨著初始pH 的增加，抑菌圈直徑呈先增加后下降趨勢(shì)；初始pH 處于最值，隨著接種量的增加，抑菌圈大小呈相同趨勢(shì)。接種量與初始pH 的曲面較陡，對(duì)抑菌活性影響顯著。

圖6 接種量和初始pH 對(duì)抑菌活性影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of the effect of inoculation amount and initial pH on antibacterial activity

圖7 是發(fā)酵時(shí)間和初始pH 影響抑菌活性的響應(yīng)面圖。當(dāng)接種量固定，發(fā)酵時(shí)間處于最值時(shí)，隨著初始pH 的增加，抑菌圈直徑呈先增加后下降趨勢(shì)；初始pH 處于最值時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間增加，抑菌圈大小呈相同趨勢(shì)。代表初始pH 的響應(yīng)曲面坡度較陡，說(shuō)明初始pH 的變化對(duì)抑菌活性的影響比發(fā)酵時(shí)間對(duì)其影響大。

圖7 發(fā)酵時(shí)間和初始pH 對(duì)抑菌活性影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of the effect of fermentation time and initial pH on antibacterial activity

2.2.3 工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)抑菌圈直徑大小模型的二次回歸方程，利用 Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)乳酸菌發(fā)酵條件工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)參數(shù)為接種量3.907%、發(fā)酵時(shí)間23.706 h、初始pH 為6.946，在此條件下抑菌圈直徑為17.143 mm。為驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化的可行性，在此最佳條件下進(jìn)行乳酸菌最優(yōu)發(fā)酵條件的驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)考慮實(shí)際操作可行性，調(diào)整參數(shù)為接種量4%、發(fā)酵時(shí)間24 h、初始pH 為7.0，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，得到抑菌圈直徑平均值為17.33±0.17 mm，與理論值較為接近。說(shuō)明采用響應(yīng)面法對(duì)乳酸菌發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化得出的結(jié)果可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 抗菌肽粗提粉的品質(zhì)分析

采用本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最佳發(fā)酵工藝制得發(fā)酵粗提液，經(jīng)過(guò)濃縮蒸發(fā)，冷凍干燥制得抗菌肽粗提粉?？咕拇痔岱塾休^好的組織狀態(tài)，滋味氣味正常，色澤均一。組織狀態(tài)整體均勻、松散，粉質(zhì)干燥且無(wú)結(jié)塊，具有良好的流動(dòng)性；滋氣味有較濃的乳香味及乳酸菌發(fā)酵后特有的淡香味；色澤呈均勻一致的乳黃色、有光澤。

抗菌肽粗提粉的理化指標(biāo)如表4 所示，由表4可知，抗菌粗提粉的脂肪含量為0.53 g/100 g，蛋白質(zhì)含量為34 g/100 g，含水量為3.4%（w/w），乳糖含量77 g/100 g，溶水后溶液pH 為4.5。

表4 抗菌肽粗提粉理化指標(biāo)Table 4 Physical and chemical indexes of crude powder of antimicrobial peptides

抗菌肽粗提粉的根據(jù)微生物檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5，抗菌肽粗提粉中菌落總數(shù)＜3000 cfu/g，大腸菌群數(shù)＜90 MPN/100 g。沙門(mén)氏菌、志賀氏菌及金黃色葡萄球菌這三種食品中常見(jiàn)致病菌沒(méi)有被檢測(cè)出?？紤]后期可以安全應(yīng)用于食品中延長(zhǎng)食品保質(zhì)期。

表5 抗菌肽粗提粉微生物指標(biāo)Table 5 Test results of microbial indexes of crude powder of antimicrobial peptides

3 結(jié)論

安全高效的天然抑菌產(chǎn)品有望代替化學(xué)防腐劑用于食品、飼料等行業(yè)[28-29]。當(dāng)下發(fā)酵乳酸菌抗菌肽的培養(yǎng)基以MRS、M17 培養(yǎng)基居多，采用農(nóng)業(yè)、工業(yè)副產(chǎn)物為培養(yǎng)基主要成分發(fā)酵乳酸菌抗菌肽成為研究熱點(diǎn)[30]。本研究選用乳清發(fā)酵培養(yǎng)基，以自主分離的具有抑真菌特性的副干酪乳桿菌ALAC 生產(chǎn)抗菌肽粉。采用響應(yīng)面分析對(duì)副干酪乳桿菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳發(fā)酵工藝條件為培養(yǎng)基初始pH 為7.0、接種量4%、發(fā)酵時(shí)間24 h，此條件下乳桿菌產(chǎn)抗菌肽的抑菌圈達(dá)到17.33±0.17 mm。最佳發(fā)酵條件制得的抗菌肽粗提粉感官狀態(tài)良好，理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)符合要求。研究結(jié)果表明副干酪乳桿菌ALAC 發(fā)酵生產(chǎn)的抗菌肽具有較強(qiáng)的抑菌特性，為后期進(jìn)一步優(yōu)化后處理工藝，從而生產(chǎn)抗菌肽粉奠定了基礎(chǔ)。