王 磊，劉小草，董 雨，王雪婷，柴徵微，李 吉，丁愛(ài)軍，張維明，曾韋錕

（昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650214）

腸熱癥由傷寒沙門(mén)氏菌、副傷寒沙門(mén)氏菌（甲、乙、丙）所引起，主要通過(guò)污染的水源和食物而爆發(fā)流行，不良的衛(wèi)生條件和生活習(xí)慣是疾病發(fā)生的主要原因，但是隨著人員交際的增加，全球腸熱癥病發(fā)率逐漸成為大部分國(guó)家突出的衛(wèi)生問(wèn)題[1-3]。近年來(lái)，傷寒沙門(mén)氏菌感染占比呈下降趨勢(shì)，而甲型副傷寒沙門(mén)氏菌（后簡(jiǎn)稱副甲菌）在某些地區(qū)感染占比則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[4-5]。據(jù)調(diào)查，近年來(lái)云南、廣西、湖南、貴州、福建和廣東6 個(gè)省份傷寒、副傷寒的發(fā)病率均顯著高于全國(guó)平均水平[6]。雖然云南省的傷寒、副傷寒的發(fā)病率總體呈逐年下降趨勢(shì)，但患病率在全國(guó)仍處于較高的水平且多年位居第一[7-8]。副甲菌感染引起的疾病在臨床上以持續(xù)高熱，相對(duì)緩脈，肌肉酸痛，特征性中毒癥，脾腫大，玫瑰疹與白細(xì)胞減少等為特征，主要并發(fā)癥則包括腸出血、腸穿孔等[9-12]。因此探究副甲菌逃脫宿主免疫殺傷的機(jī)制十分必要。

多種生物體利用NO 來(lái)抵抗微生物感染，NO 通過(guò)促進(jìn)亞硝化應(yīng)激[13-15]和抑制有氧呼吸鏈中的血紅蛋白來(lái)對(duì)微生物產(chǎn)生細(xì)胞毒性[16-17]。HmpA 蛋白是細(xì)菌體內(nèi)hmpA基因產(chǎn)生的NO 雙加氧酶[18]，其在宿主一氧化氮合酶產(chǎn)生ROS 和NO 時(shí)在細(xì)菌體內(nèi)表現(xiàn)出較高活性[19-21]，功能主要是通過(guò)將宿主產(chǎn)生的殺傷性NO 以一定方式降解為對(duì)菌體無(wú)害的硝酸鹽，如在大腸桿菌中催化的主要反應(yīng)是通過(guò)雙加氧酶機(jī)制轉(zhuǎn)化O2和NO 形成硝酸根離子。但有研究顯示該蛋白降解NO 的效率在低氧或缺氧環(huán)境中可能受到限制[22]，即在缺氧或低氧條件下，HmpA 蛋白的活性會(huì)顯著降低[23]。但總的來(lái)說(shuō)，在細(xì)菌于宿主體內(nèi)的免疫逃避過(guò)程該蛋白發(fā)揮至關(guān)重要的作用。目前關(guān)于甲型副傷寒沙門(mén)氏菌體內(nèi)HmpA 蛋白的功能、結(jié)構(gòu)及基本理化性質(zhì)尚無(wú)清晰報(bào)道。為了進(jìn)一步研究副甲菌中HmpA 蛋白的基本生物學(xué)信息，本研究以甲型副傷寒沙門(mén)氏菌CMCC 50973 菌株為模板，克隆hmpA基因并構(gòu)建了原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化了HmpA 蛋白[24-25]；并通過(guò)生物信息方法對(duì)該蛋白相關(guān)的多個(gè)重要理化性質(zhì)進(jìn)行分析[26-27]。這為后續(xù)探究甲型副傷寒沙門(mén)氏菌體內(nèi)HmpA 蛋白的免疫學(xué)特性與降解宿主細(xì)胞產(chǎn)生的殺傷性NO 機(jī)理方面的影響提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲型副傷寒沙門(mén)氏菌CMCC 50973、pNdeI 質(zhì)粒（本實(shí)驗(yàn)室從pET-28a（+）質(zhì)粒改造而來(lái)）、大腸桿菌BL21（DE3） 本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19T Vector、T4 DNA 連接酶、DNA 聚合酶、dNTPs、核酸分子質(zhì)量Marker 寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、微量瓊脂糖DNA 回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；PAGE 凝膠快速制備試劑盒（10%）、雙色預(yù)染蛋白Marker 上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；ULtraSignal 超敏ECL 化學(xué)發(fā)光底物、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ及XhoⅠ 賽默飛世爾科技公司；小鼠抗His 標(biāo)簽單克隆抗體 德悅（北京）生物科技有限責(zé)任公司；HRP-羊抗鼠IgG、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；PAGE 蛋白上樣緩沖液、BeyoBlue?考馬斯亮藍(lán)超快染色液 上海碧云天生物科技有限公司；酵母提取物、胰化蛋白胨 英國(guó)Oxoid 公司；氨芐青霉素、卡那霉素 BBI 公司；瓊脂糖 基因生物技術(shù)國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；Tris/甘氨酸/SDS 電泳緩沖液（10×）、10×電泳轉(zhuǎn)移緩沖液（轉(zhuǎn)膜液）（粉劑）、10×TBST 緩沖液（粉劑）、10×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（粉劑）、1×PBS 緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；PCR 擴(kuò)增引物 昆明擎科生物科技有限公司；0.22 μm 無(wú)菌濾膜、0.45 μm 無(wú)菌濾膜 Minipore 公司；Histrap 1 mL 預(yù)裝柱 美國(guó)GE 公司。

Nano-200 核酸蛋白測(cè)定儀 杭州奧盛儀器有限公司；GZX-DH 電熱恒溫干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司； Bio-base BSC-1500 II A2-X 生物安全柜 濟(jì)南鑫貝西生物安全柜；GI-1 發(fā)光成像系統(tǒng)上海天能有限公司；Neo 13R 高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；D3024 臺(tái)式高速微量離心機(jī)、D1008 掌上離心機(jī) 美國(guó)賽洛捷克科技有限公司；GI-1 紫外凝膠成像分析系統(tǒng) 通寶達(dá)成有限公司；HQ45Z 恒溫?fù)u床儀 武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；EPS 200 電泳儀雙板垂直蛋白電泳系統(tǒng)上海天能科技有限公司；JY92-IIN 超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因的克隆 以CMCC 50973 基因組為模板設(shè)計(jì)引物hmpA-F、hmpA-R（表1），為了將片段定向克隆至pNdeI 載體上的NdeI 和XhoI 之間并與XhoI 位點(diǎn)后的6 His 標(biāo)簽融合，分別在上下游引物的5’端引入NdeI 或XhoI 酶切位點(diǎn)，PCR 擴(kuò)增hmpA基因片段，PCR 程序?yàn)椋?4 ℃（5 min）；94 ℃（30 s），57 ℃（30 s），72 ℃（70 s）共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃（5 min）。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并掃描。

表1 PCR 引物Table 1 PCR primers

1.2.2 亞克隆pMD19T-hmpA的構(gòu)建及鑒定 將1.2.1 獲得的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，將hmpA基因片段利用微量瓊脂糖DNA 回收試劑盒進(jìn)行回收，后與pMD19T Vector 載體16 ℃連接18 h。-80 ℃取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞在冰水浴中完全融化后加入連接產(chǎn)物，冰水浴靜置5 min；42 ℃熱激90 s；迅速冰水浴靜置2 min；而后加入液體LB 500 μL，37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)30 min；將培養(yǎng)液10000 r/min 離心1 min，吸棄培養(yǎng)基剩余約60 μL重懸菌體后，均勻涂于氨芐抗性平板上37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)18 h。挑取單克隆菌落至帶有氨芐抗性（30 μg/mL）的3 mL LB 培養(yǎng)基中37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)18 h 后利用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行37 ℃，30 min 的NdeⅠ、XhoⅠ酶切鑒定，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并觀察酶切結(jié)果。鑒定為正確的質(zhì)粒，送昆明擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的載體命名為pMD19T-hmpA。

1.2.3 表達(dá)載體pNdeI-hmpA的構(gòu)建及鑒定 將DH5α轉(zhuǎn)化提取的pNdeI 質(zhì)粒及測(cè)序正確的pMD19ThmpA質(zhì)粒分別進(jìn)行37 ℃，40 min 的NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，微量瓊脂糖DNA 回收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物用T4 DNA 連接酶16 ℃連接18 h后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化步驟同1.2.2。挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落至帶有卡那抗性（30 μg/mL）的3 mL LB 培養(yǎng)基中37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)18 h，提取質(zhì)粒，進(jìn)行37 ℃，30 min 的NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并觀察酶切結(jié)果。構(gòu)建正確的載體命名為pNdeI-hmpA。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞獲得重組表達(dá)菌pNdeI-hmpA/BL21（DE3）同1.2.2。

1.2.4 HmpA 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將pNdeIhmpA/BL21（DE3）原核表達(dá)菌株及空載體菌劃線獲得單克隆，挑取單克隆接種于5 mL 含有50 μg/mL卡那霉素的 LB 培養(yǎng)液中，37 ℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。第2 d 將過(guò)夜培養(yǎng)的兩種表達(dá)菌株按1%（100 μL）的比例轉(zhuǎn)種于10 mL（50 μg/mL）K+LB 培養(yǎng)液中；37 ℃搖床培養(yǎng)待OD600≈0.7 左右時(shí)，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜。取1 mL 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)菌，12000 r/min 離心60 s 棄上清，加入600 μL PBS 重懸菌體再次以12000 r/min 的速度離心60 s棄上清。按1:1 體積比加PBS，冰水浴條件超聲破碎（312 W，工作5 s，間隔10 s，共工作60 min）。破碎完成后，低溫高速離心機(jī)4 ℃、2000 r/min，離心10 min；轉(zhuǎn)移上清至新的EP 管后，4 ℃、10000 r/min離心15 min，沉淀則用100 μL PBS 重懸。分別取上清與沉淀重懸液與上樣緩沖液混合，煮樣15 min 后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。

在純化目的蛋白前先用5 倍柱體積的無(wú)菌水沖洗Ni 柱，然后用平衡緩沖液5 mL 平衡柱子（上清平衡緩沖液：20 mmol/L PB、150 mmol/L NaCl、pH=7.40，沉淀平衡緩沖液：20 mmol/L PB、150 mmol/L NaCl、8 mol/L 尿素、pH7.40），并用0.45 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾上清與沉淀重懸液（兩者分別單獨(dú)純化）。平衡后將過(guò)濾后的上清與沉淀重懸液分批緩慢注入Ni 柱中，隨后用含有咪唑的緩沖液洗柱子，上清洗柱子與洗脫緩沖液為20 mmol/L PB、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L 及1 mol/L 咪唑、pH7.40，沉淀重懸液的洗柱子與洗脫緩沖液為20 mmol/L PB、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L 及1 mol/L 咪唑、8 mol/L 尿素、pH7.40，收集純化洗脫的樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。

1.2.5 純化后蛋白的Western blot 分析 重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE[28]后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，用10%脫脂奶粉輕搖室溫封閉2 h，TBST 漂洗4 次，每次10 min，加入按1:2000 比例用TPBS 稀釋好的小鼠抗His 標(biāo)簽單克隆抗體，于4 ℃條件下輕搖過(guò)夜后，TBST 漂洗PVDF 膜后并浸洗三次，每次漂洗10 min，再加入按1:10000 比例用TPBS 稀釋好的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 室溫輕搖1 h 后，用TBST 漂洗PVDF 膜后并浸洗三次，每次漂洗5 min，取ULtraSignal 超敏ECL 化學(xué)發(fā)光底物（2 種試劑）各0.5 mL 至無(wú)菌EP管中（按1:1）混勻，滴加適量稀釋后的發(fā)光底物于膜上，成像儀拍照保存。

1.2.6 HmpA 蛋白的生物信息學(xué)功能分析 用ExPASy 的ProtParam 軟件分析HmpA 蛋白的基本理化性質(zhì)；Protscale 在線分析HmpA 蛋白的親水性，TMHMM Server v.2.0 軟件對(duì)HmpA 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了氨基酸序列分析；利用SignaIP 5.0 Server軟件對(duì)HmpA 蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析；通過(guò)NPS@SOPMA 在線分析軟件對(duì)目的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行氨基酸序列分析；采用ExPASy 的SWISSMODEL 蛋白質(zhì)庫(kù)，建立了HmpA 蛋白的三維結(jié)構(gòu)同源模型；采用NCBI 中的CDD（Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)目的蛋白的氨基酸序列分析其結(jié)構(gòu)域；在NetPhos 3.1 Sever 在線工具中利用目的蛋白的氨基酸序列來(lái)分析其磷酸化位點(diǎn)；采用ATRING 1.0 蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)分析與HmpA 相關(guān)蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞克隆載體pMD19T-hmpA 的重組構(gòu)建及鑒定

以副甲菌CMCC 50973 基因組為模板，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)約1197 bp 的hmpA基因，見(jiàn)圖1A。亞克隆載體pMD19T-hmpA經(jīng)NdeI 和XhoI 限制性內(nèi)切酶雙酶切后，行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)切出的目的片段（圖1B）。測(cè)序結(jié)果部分峰圖見(jiàn)圖1C，堿基序列與預(yù)期相符。表達(dá)載體pNdeI-hmpA經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ的雙酶切鑒定后，電泳結(jié)果如圖1D 所示，可切出目的片段，表明該載體構(gòu)建成功。

2.2 HmpA 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組pNdeI-hmpA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）后IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白電泳條帶結(jié)果如圖2A所示。誘導(dǎo)前泳道和誘導(dǎo)后泳道的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后在40～50 kDa 間可見(jiàn)明顯蛋白條帶，說(shuō)明目的蛋白誘導(dǎo)成功。在16 ℃條件下誘導(dǎo)過(guò)夜后，誘導(dǎo)后的pNdeI-hmpA/BL21（DE3）菌株超聲破碎后，分別將離心上清及沉淀進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖2B 所示，表明表達(dá)載體可同時(shí)表達(dá)可溶性與包涵體兩種形式的目的蛋白，泳道4 是全菌超聲破碎后的離心沉淀，泳道5 是超聲破碎后的離心上清，兩者比較發(fā)現(xiàn)沉淀中的目的蛋白條帶比上清中的目的蛋白條帶粗，以此推測(cè)低溫誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，目的蛋白仍然主要以包涵體形式存在。

圖2 重組菌的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)及HmpA 蛋白表達(dá)形式鑒定Fig.2 Protein expression of recombinated bacteria after IPTG induced and indentification of expression pattern of protein HmpA

2.3 HmpA 蛋白的純化與Western blotting 鑒定

純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)，結(jié)果如圖3A 所示，純化出的蛋白大小約為44 kDa。經(jīng)Gel-Pro Analzer 軟件分析，可溶性表達(dá)形式純化后的目的蛋白純度約97.3%，包涵體表達(dá)形式純化后的目的蛋白純度約71.7%。為了識(shí)別HmpA 重組蛋白條帶，克隆設(shè)計(jì)時(shí)在hmpA基因下游添加了6 個(gè)組氨酸密碼子，因此表達(dá)的HmpA 蛋白C 端帶有6 個(gè)組氨酸標(biāo)簽（Histidine-tag，His-tag），如圖3B 所示，純化后的目的蛋白均可被抗His 抗體檢測(cè)到。

圖3 SDS-PAGE 檢測(cè)純化后的HmpA 蛋白及Western blot 鑒定Fig.3 SDS-PAGE detection of purified HmpA protein and identification with Western blot

2.4 生物信息學(xué)功能分析結(jié)果

通過(guò)ExPASy 的ProtParam 軟件對(duì)HmpA 蛋白進(jìn)行了分子式預(yù)測(cè)，其分子式為C1976H3018N540O580S12，相對(duì)分子質(zhì)量為44003.69，理論等電點(diǎn)（pI）為5.56，原子總量為6126；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的半衰期約為30 h，在酵母中＞20 h，大腸埃希菌中＞10 h。不穩(wěn)定因子約為28.32，說(shuō)明其穩(wěn)定性較高（不穩(wěn)定因子在40 以下提示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較好而大于40 提示蛋白質(zhì)可能不穩(wěn)定）[29]；總親水指數(shù)為-0.268，推測(cè)是親水性蛋白；脂肪族指數(shù)為80.38（熱穩(wěn)定性較高）。結(jié)果還顯示該蛋白含有396 個(gè)氨基酸，其中有4.3%的Ile（I）；8.3%的Leu（L）；1.5%的Trp（W），以及帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys，含堿性R 基的氨基酸）的數(shù)量為33 個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu，含酸性R 基的氨基酸）的數(shù)量為48 個(gè)。詳細(xì)情況見(jiàn)表2。

表2 HmpA 蛋白氨基酸占比Table 2 Percentage of protein amino acid of HmpA

利用Protscale 分析HmpA 蛋白親水性，選用Kyte & Doolittle 模式計(jì)算方法，將親水性與疏水性峰值分析圖譜間隔設(shè)置為21，所得結(jié)果見(jiàn)圖4。圖中縱坐標(biāo)分值大于0 表示疏水性強(qiáng)弱，縱坐標(biāo)分值小于0 表示親水性強(qiáng)弱。結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白的第45 位氨基酸親水性最強(qiáng)（分值為-1.948），第272 位氨基酸疏水性最強(qiáng)（分值為1.186），同時(shí)肽鏈的親水區(qū)占比多于疏水區(qū)占比，提示目標(biāo)蛋白為親水性蛋白的可能性較大，這和ProtParam 預(yù)測(cè)的結(jié)果相同。

圖4 HmpA 蛋白的親水性分析Fig.4 Hydrophilic analysis of HmpA protein

通過(guò)TMHMM Server v.2.0 軟件對(duì)HmpA 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了氨基酸序列分析，其中跨膜螺旋值趨于0，所以推測(cè)該蛋白沒(méi)有跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)（圖5）。利用SignaIP 5.0 Server 軟件對(duì)HmpA 蛋白是否存在信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析（信號(hào)肽是引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)行膜轉(zhuǎn)移的小分子氨基酸，根據(jù)信號(hào)肽的存在與否，可預(yù)測(cè)蛋白是否為分泌型），結(jié)果顯示HmpA 蛋白為Sec/SPI 信號(hào)肽的概率為1.22%，TAT/SPI 信號(hào)肽的概率為0.16%，Sec/SPII 信號(hào)肽的概率為0.1%，其他類型的概率為98.52%，綜合上述結(jié)果，表明目標(biāo)蛋白是分泌型蛋白的可能性很低（表3）。采用NCBI中的CDD（Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)目的蛋白的氨基酸序列分析其結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示HmpA 蛋白含一個(gè)結(jié)構(gòu)域，屬于PRK13289 超級(jí)家族（圖6）。

圖5 HmpA 蛋白跨膜域預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of transmembrane domain of HmpA

圖6 HmpA 蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of structural domain of HmpA

表3 HmpA 蛋白的信號(hào)肽類型預(yù)測(cè)Table 3 Signaling peptide type prediction for HmpA proteins

通過(guò)在線軟件NPS@SOPMA 對(duì)HmpA 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖7），其中α-螺旋占42.17%，延伸鏈占16.67%，β-轉(zhuǎn)角占4.8%，無(wú)規(guī)則卷曲占36.36%。HmpA 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)ExPASy 的SWISS-MODEL 蛋白質(zhì)庫(kù)預(yù)測(cè)，模板序列為1gvh.1.A，序列相似度為91.16%，結(jié)果如圖8 所示。

圖7 HmpA 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of secondary structure of HmpA

圖8 HmpA 蛋白的三維模型Fig.8 3D model of HmpA

在NetPhos 3.1 Sever 在線工具中，利用目的蛋白的氨基酸序列來(lái)分析其磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果顯示HmpA 蛋白具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中磷酸化能力超閾值有12 個(gè)絲氨酸（Serine），15 個(gè)蘇氨酸（Threonine），5 個(gè)酪氨酸（Tyrosine），所以HmpA 蛋白共有32 個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖9）。采用ATRING11.0 蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與HmpA 蛋白相關(guān)蛋白，圖中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)互作蛋白，若兩個(gè)蛋白質(zhì)之間存在相互作用，則以連線連接，連線的顏色反映了互作類型，包括試驗(yàn)驗(yàn)證或預(yù)測(cè)得到的，也包含直接物理作用、共表達(dá)、基因融合等關(guān)系[30]。結(jié)果顯示，HmpA 在鼠傷寒沙門(mén)氏菌中的同源蛋白為hmp（hmp 蛋白在鼠傷寒沙門(mén)氏菌體內(nèi)有氧過(guò)程中參與NO 解毒，從而被稱為一氧化氮雙加氧酶），與hmp 蛋白有較緊密聯(lián)系的蛋白質(zhì)有HTH 型轉(zhuǎn)錄抑制因子NsrR（參與細(xì)胞亞硝化應(yīng)激基因激活的一氧化氮敏感抑制因子）、鐵硫簇修復(fù)蛋白YtfE（參與修復(fù)被氧化和亞硝酸鹽應(yīng)激條件破壞的鐵硫簇的含二鐵蛋白）、細(xì)胞色素C 亞硝酸鹽還原酶nrfA（催化亞硝酸鹽還原為氨），其他還有同源蛋白DD95_08350 及在其他文章中一起被提及的thiD、thiG、hemE、hcp 等與細(xì)菌NO 解毒途徑有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和酶[31-33]，據(jù)此推測(cè)HmpA 蛋白的功能與副甲菌降解宿主產(chǎn)生的殺傷性NO 機(jī)制通路密切相關(guān)（圖10）。

圖9 HmpA 蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.9 Prediction of phosphorylation site of HmpA

圖10 HmpA 蛋白的互作蛋白預(yù)測(cè)Fig.10 Prediction of interacting protein of HmpA

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了pNdeI-hmpA原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入BL21（DE3）后經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)、親和層析法純化可得到重組蛋白。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示HmpA蛋白為親水性蛋白，無(wú)信號(hào)肽、跨膜區(qū)域；屬PRK13289超級(jí)家族蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)較松散，主要由α螺旋與不規(guī)則卷曲構(gòu)成；含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，與副甲菌體內(nèi)降解NO 的多種酶、多肽及轉(zhuǎn)錄因子等關(guān)聯(lián)，初步驗(yàn)證了HmpA 蛋白與副甲菌NO 解毒途徑有關(guān)，但關(guān)于該重組蛋白的體外NO 降解活性、在副甲菌體內(nèi)產(chǎn)生的機(jī)理途徑，以及同宿主細(xì)胞的抗原抗體反應(yīng)分子機(jī)制在研究中均未涉及。后續(xù)研究將對(duì)HmpA 蛋白的體外活性及其對(duì)宿主免疫細(xì)胞功能的影響做進(jìn)一步探究，以分析該蛋白在副甲菌感染過(guò)程中所起到的作用，為副傷寒疾病的治療及副甲菌的防治提供幫助。

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示HmpA 蛋白為親水性蛋白，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示誘導(dǎo)的目的蛋白既有包涵體形式又有可溶性形式，這提示我們?cè)诘湫偷拇竽c桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中，蛋白的兩親性跟目的蛋白的表達(dá)形式可能不是互相對(duì)應(yīng)的。本實(shí)驗(yàn)所用到的載體是基于T7 RNA 聚合酶及其強(qiáng)啟動(dòng)子之間的特異性和轉(zhuǎn)錄高效性建立，該系列載體誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，同時(shí)將大量菌體內(nèi)資源用于高效率的蛋白表達(dá)，且蛋白產(chǎn)量極高。因此在誘導(dǎo)時(shí)由于細(xì)胞內(nèi)肽鏈合成過(guò)快卻來(lái)不及正確折疊進(jìn)而不能形成天然構(gòu)象蛋白。同時(shí)影響外源基因在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)的因素還包括目的蛋白的分子質(zhì)量、培養(yǎng)條件的控制（溫度的選擇和誘導(dǎo)及培養(yǎng)的時(shí)間）、密碼子的選用等。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將從表達(dá)載體的選取、誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化等方面改善以提高HmpA 蛋白的表達(dá)效率。