廖劍洪，楊 娟，曾曉房，白衛(wèi)東，梁景龍*

（1 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 輕工食品學院 廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室 廣州510225 2 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 輕工食品學院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室 廣州 510225）

近年來，有研究稱γ-谷氨酰肽屬于厚味肽[1]。這種小肽既能增加食品的風味特征，也能增加化合物的溶解性、穩(wěn)定性，在食品、醫(yī)藥領域有重要的應用價值。在食物中添加少量的厚味肽能增強或改善風味特征，如在食品體系中添加可增強基本味感的協(xié)調(diào)性、連續(xù)性和呈味強度[2]。此外，有報道稱氨基酸經(jīng)γ-谷氨?；?，水溶性優(yōu)于原氨基酸，并且γ-谷氨酰肽比一般的短肽穩(wěn)定性好[3]。

γ-谷氨酰轉肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase，GGT）廣泛存在于各種生物體內(nèi)，能特異性地催化γ-谷氨?；衔镏械摩?谷氨酰鍵斷裂，并將γ-谷氨?；鶊F轉移到氨基酸、短肽或水分子中[4]。GGT 催化反應具有特異性強，不消耗能量等優(yōu)點，已有廣泛的應用研究，如改善食品體系的口感（茶氨酸、γ-谷氨酰-苯丙氨酸等）或作為藥物或藥物前體（γ-D-谷氨酰-L-色氨酸、γ-谷氨酰-牛磺酸等）。

GGT 在合成多種食品和醫(yī)藥用γ-谷氨?；衔锓矫嬗袕V泛的應用前景。然而，在使用該酶的酶促合成應用方面受多種因素制約：有限的酶促反應速率、供體底物的水解和自身轉肽化的副反應、酶的抗逆性以及穩(wěn)定性等。細菌中有豐富的GGT 資源，本文綜述其結構與功能的關系，蛋白質工程在改造GGT 性質方面的應用以及產(chǎn)物特點，旨在挖掘細菌GGT 的潛力，為未來研究提供參考。

1 GGT 的來源與同源性分析

目前，人們已經(jīng)從許多微生物中分離得到GGT，包括大腸桿菌GGT（Escherichia coli GGT，EcGGT）、肺炎鏈球菌GGT（Streptococcus pneumoniae GGT，SpGGT）、枯草芽孢桿菌GGT（Bacillus subtilis GGT，BsGGT）、地衣芽孢桿菌GGT（Bacillus licheniformis，BlGGT）、解淀粉芽孢桿菌GGT（Bacillus amyloliquefaciens，BaGGT）、奇異變形桿菌GGT（Proteus mirabilis，PmGGT）、幽門螺桿菌GGT（Helicobacter pylori，HpGGT）等。對多種不同生物體產(chǎn)生的GGT 結構研究表明，它是結構不對稱的一種由小亞基和大亞基組成的異二聚體酶。迄今已確定的GGT 酶在一級結構上表現(xiàn)出一定程度的同源性。幾種芽孢桿菌的GGT 的小亞基氨基酸序列同源性超過80%[5]；解淀粉芽孢桿菌的小亞基與枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、幽門螺桿菌、銅綠假單胞菌的同源性為33%～78%之間，與相應的非微生物酶亞基（如牛、人和小鼠GGT）的同源性在25%～31%之間[6]。將幾種微生物的GGT一級結構序列進行比對，可以看出有較高的相似性（圖1）。

圖1 幾種微生物的GGT 序列對比Fig.1 Sequence alignment of several microbial GGTs

目前，已有許多研究通過蛋白質分子結晶技術深入理解了GGT 的空間結構。在空間構象上，微生物產(chǎn)生的GGT 通常由2 個大小不相等的亞基組成，大亞基的分子質量一般約為40 ku，小亞基一般約為20 ku。GGT 是一種酰胺鍵水解酶，小亞基的一側被大亞基環(huán)繞。正確的空間折疊結構是GGT 具有酶活性的關鍵[7-8]。

2 GGT 的催化反應特性

2.1 GGT 的催化反應類型

γ-谷氨酰轉肽酶催化分為2 步反應：第：1 步稱為?；?，Thr-391 的活性氧原子攻擊γ-谷氨?；衔锏聂驶荚樱呀猞?谷氨?；衔锶绻入赘孰暮凸劝滨０分写嬖诘摩?谷氨酰鍵，隨后供體底物的γ-谷氨酰基部分與酶結合，形成γ-谷氨?；?酶復合物；第2 步反應是脫酰胺化，受體底物接受中間體的γ-谷氨酰基部分，形成最終產(chǎn)物。Okada 等[9]對EcGGT 的晶體觀察，表明第2 步反應可能是限制酶促反應速率的關鍵環(huán)節(jié)。

根據(jù)受體分子的不同可以將GGT 的催化反應分為3 種類型（圖2）：1）當受體分子是水時，γ-谷氨?；衔锼?；2）當受體分子是氨基酸或者短肽時，形成新的γ-谷氨?；衔?；3）當受體分子與供體分子為同一物質時，稱為自轉肽反應。水解反應和轉肽反應的最適pH 值不同，因此能通過調(diào)整反應體系的pH 值調(diào)控反應進行方向。目前已報道的GGT，酸性條件具有較高的水解反應活性，在堿性條件下（pH 8.0～11.0）催化轉肽反應活力迅速攀升，同時水解反應被一定程度抑制。

圖2 GGT 的催化反應類型（以谷氨酰胺為例）Fig.2 Catalytic reaction type of GGT（Taking glutamine as an example）

圖3 GGT 三維結構Fig.3 Three-dimensional structure of GGT

2.2 GGT 的底物選擇性

GGT 催化γ-谷氨酰鍵斷裂，特異性強，可以根據(jù)不同底物條件合成特定的目的產(chǎn)物。自然界中的蛋白質肽鍵通常是在α-羧基和α-氨基之間形成的，而γ-谷氨酰肽的肽鍵是在γ-羧基上形成，這被認為是其具有厚味活性的關鍵，因為同樣序列的α-谷氨酰肽沒有呈現(xiàn)出厚味性質[10]。供體和受體底物選擇性方面，L 型或D 型的γ-谷氨?；衔锒寄茏鳛楣w分子參與酶促反應，而多數(shù)GGT 僅接受L-氨基酸作為供體底物，而不能以D-谷氨酸作為受體底物，目前僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)的GGT同時能催化L 型和D 型氨基酸作為受體分子反應[11]。相比酸性氨基酸，堿性氨基酸是更適合的受體氨基酸，氨基酸的側鏈長短似乎也是影響酶活性的因素[12-13]。

2.3 GGT 轉肽反應條件的調(diào)控

由于GGT 催化反應的特點，反應體系的水解、轉肽、自轉肽反應并存不利于底物轉化率和產(chǎn)物分離純化。調(diào)控GGT 催化反應的方向，對其實際應用有重要意義。

在一般的酶促反應中，酶和底物量的是催化反應不可缺少的一員，影響著轉化率，而GGT 的反應特點決定了其反應特性與此迥異。由于GGT同時具有底物水解和合成2 種反應，水解產(chǎn)物、轉肽產(chǎn)物以及自轉肽產(chǎn)物共存是GGT 催化反應的共同特征，并且與所使用的受體的性質無關?；贕GT 催化反應的特點，對EcGGT 的反應特點研究中表明，低濃度的酶不影響底物的轉化率，而過高濃度的酶可能造成底物轉化率的降低。另外，目前關于GGT 催化反應的報道[14]中，轉肽反應和自轉肽反應的產(chǎn)物主要在前期階段生成，轉肽產(chǎn)物濃度隨時間延長而保持相對穩(wěn)定，自轉肽產(chǎn)物導致了復雜的產(chǎn)物體系，降低了底物的轉化率。轉肽產(chǎn)物的轉化率被證實取決于供體與受體底物的濃度比例，而在反應過程中增加供體底物的濃度會促進自轉肽反應的進行，而不是轉肽反應。如表1 所示，GGT 催化不同反應其最佳的反應條件有著明顯的差異。

表1 GGT 的催化的最佳條件Table 1 The optimal conditions for the catalysis of GGT

為了促進GGT 的轉肽反應，利用大多數(shù)GGT對底物的選擇性，使用D-谷氨酰化合物能夠顯著提高產(chǎn)物合成產(chǎn)量并降低γ-谷氨酰副產(chǎn)物。除此之外，基因工程手段被認為是一種控制GGT 催化反應的重要方式，對某些保守氨基酸的突變，可以使GGT 的轉肽反應和水解反應的比值提高，是良好的控制產(chǎn)物合成的方式[6，15]。另外，根據(jù)GGT 的結構與功能特點，在BsGGT 中插入“蓋-環(huán)”結構，水解反應被明顯抑制[16]。

3 GGT 結構的功能特性

酶的空間構象是決定酶催化性質的關鍵。通過比對不同物種的GGT 的關鍵氨基酸和空間結構可以發(fā)現(xiàn)，不同來源的GGT 在活性中心區(qū)域的空間構象存在差異，進而對底物的結合和酶促反應產(chǎn)生重要的影響。

3.1 “蓋-環(huán)”結構

EcGGT、HpGGT 等會攜帶一個由12～16 個殘基組成的短序列，被稱為“蓋-環(huán)” 結構（“Lid-Loop”）[9]，而在BsGGT、BlGGT 和BaGGT 的空間結構上是不具有這種結構。這兩類GGT 在催化性質方面呈現(xiàn)不同的特點。

“蓋-環(huán)”結構有控制底物、產(chǎn)物進出活性中心的作用。哺乳動物和大腸桿菌等具有“蓋環(huán)”結構的GGT 對底物分子有篩選作用，表現(xiàn)為限制分子質量較大的γ-谷氨?；衔镞M入酶活性中心[25-26]。如：EcGGT 的“蓋-環(huán)”結構（Pro438-Gly449）中的的芳香族殘基酪氨酸（Try444）與保守殘基Asn411形成氫鍵，限制水分子分子進入活性中心，并且具有調(diào)節(jié)底物進入活性中心的功能[9]。HpGGT 蓋環(huán)的Tyr433 與Asn400 之間同樣存在類似的氫鍵[27]。因此，“蓋-環(huán)”結構被認為能抑制水分子參與的水解反應。相反，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等GGT 能夠結合長鏈的谷氨酰胺化合物[28]，尤其是利于聚合谷氨酰胺化合物的水解。Calvio 等[29]、Massone 等[16]的研究進一步佐證上述觀點，將EcGGT 上對應的“蓋-環(huán)”的基因序列通過基因工程技術插入到BsGGT 上，突變體GGT 獲得 “蓋環(huán)”結構后，優(yōu)先催化小分子質量的底物分子，同時提升GGT 酶轉肽活性。

此外，在“蓋-環(huán)”中心位置的有一個重要的保守芳香殘基保護酶結構，這種芳香族氨基酸在EcGGT-中是酪氨酸（Tyr444），而在哺乳動物中相對應的芳香族殘基則是苯丙氨酸[9，27，30]，這種差異也被認為決定GGT 的活性大小[31]。

3.2 自催化加工結構

GGT 是N 末端親核水解酶家族的一員，這種酶家族的特點是轉錄翻譯產(chǎn)生的前體蛋白不具有酶活性，需要激活N 端的Ser 或者是Thr 進行自催化裂解后才能具有酶活性。這種機制被稱為自催化成熟機制[32]。成熟的GGT 的大小亞基都是經(jīng)過前體蛋白自催化處理后產(chǎn)生的二聚體。GGT 自催化加工涉及一個保守殘基-蘇氨酸，自催化處理后，新產(chǎn)生的C-末端和N-末端分別形成大的和小的亞基；這個保守的蘇氨酸作為小的亞基中的第一個氨基酸殘基，同時這個保守的殘基還是酶促反應的關鍵活性位點[6]。成熟的GGT 和前體蛋白的整體結構相比，雖沒有顯著的變化，但是在活性位點附近有顯著的變化，從而解除了對限制底物結合空間位阻，而賦予了GGT 酶活性。多個報道證明GGT 分子的自催化加工需要多個氨基酸殘基共同參與，小亞基的上的保守殘基蘇氨酸對GGT 的自催化加工是重要的，但不是必須的[33-36]。

3.3 GGT 的底物結合位點

酶分子在一級結構的基礎上經(jīng)過盤繞折疊成特定的空間結構才能具有特定的催化功能，而酶的空間構象對底物結合的親和能力影響著酶催化能力。在GGT 的催化反應中，底物分子根據(jù)提供的基團不同，GGT 底物結合區(qū)域可以劃分為2 種：供體結合部位和受體結合部位。

供體結合位點和供體分子中的γ-谷氨酰氨基部分結合，而不同的受體分子的結合位點仍未完全表征清楚。Okada 等[9]利用蛋白質結晶技術捕獲了EcGGT 與谷胱甘肽結合的酶中間體結構以及和谷氨酸結合的復合物結構，揭示了谷胱甘肽的γ-谷氨?；糠值摩?羧基和α-氨基位于酶催化口袋的底部，通過氫鍵和鹽橋保持在關鍵的空間位置。GGT 中參與供體分子的結合氨基酸主要分布在小亞基中，大亞基中僅有一個保守的Arg參與。研究表明[6]BlGGT、EcGGT 和BsGGT 中參與供體結合的氨基酸組成僅有1～2 個氨基酸的區(qū)別，例如BlGGT 的Glu423、Glu442 和EcGGT 的N411、Q430[7-8]。對大亞基上的參與底物結合的保守殘基Arg，在BlGGT 中，帶正電荷的殘基賴氨酸取代參與底物結合的Arg109 提高了轉肽活性，而在同樣的替換EcGGT 和BsGGT 中導致了酶活力的下降[37-39]。Gly-Gly 是多數(shù)GGT 良好的受體底物，PnGGT 的結構研究指出其結構口袋的芳香族氨基酸可能限制了Gly-Gly 作為γ-谷氨酰受體的活性[40]。Takao[40]證實了Trp385、Phe417 和Trp525的芳香族側鏈參與了受體底物的識別，根據(jù)這些殘基的生化特性，設計水解活性降低，轉肽酶活性顯著升高的突變酶。GGT 和底物結合催化機制的具體影響仍然需要進一步的研究闡明，以便篩選不同種類的酶和改造出更優(yōu)質的酶。

4 GGT 的穩(wěn)定性研究

大多數(shù)酶在催化反應中需要溫和的條件反應以進行正常的催化活性。酶蛋白在催化反應中抵抗各種因素的影響（高酸、高溫、高鹽等）是保證其生物活力的關鍵。研究GGT 酶的穩(wěn)定性對其基礎理論研究有重要意義，對提高其反應和貯存穩(wěn)定性，擴大酶的使用范圍對實際應用是必不可少的。目前報道的微生物產(chǎn)生的GGT 最適合pH 值多為堿性范圍（8.0～10.0），通常在pH＜5.0 的幾乎檢測不到酶活性，最適溫度范圍約為37～60 ℃，且對pH 值的穩(wěn)定性高于對溫度的穩(wěn)定性。當溫度超過60 ℃時，即使是短時間孵育（10 min），GGT 也會喪失90%的活性[5，13，41]。對于GGT 穩(wěn)定性不足，突變改造是有效的提升方式。如彭清等[42]將不同的氨基酸取代BsGGT 的280 位Tyr，改善了pH 值耐受性問題。Hu 等[43]將BlGGT 結構和一種淀粉酶融合，雖提高了GGT 的熱穩(wěn)定性，但活性有所降低。耐鹽性是GGT 的另一個突出特性，這使得其在醬油等加工行業(yè)中有重要的應用前景。目前已發(fā)現(xiàn)的多種GGT 在高濃度NaCl 存在和無NaCl 存在時都有活性，表明GGT 是耐鹽的但不嗜鹽，并在1～5 mol/L NaCl 溶液中表現(xiàn)出極高的穩(wěn)定性[5，37，44-45]。

5 改造GGT 的研究

天然酶穩(wěn)定性差、易失活、酶活力差等是限制酶應用的主要原因。隨著酶工程技術的發(fā)展，進行定向進化、定點突變或者其它穩(wěn)定化技術處理，脆弱的天然酶能成為符合工業(yè)生產(chǎn)要求的、更加穩(wěn)定的變異酶，使得生物催化技術極大地拓寬了應用價值。目前對GGT 的酶學性質提升研究主要有克隆表達、定點突變、和固定化酶幾方面。

近年來，諸多學者通過對基因工程技術，將GGT 的基因進行異源表達，以期獲得高酶活性、穩(wěn)定性的GGT。Lee 等[13]將解淀粉芽孢桿菌SMB469中的GGT 酶分別在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中表達，得到的重組GGT 酶活力分別提高了2 倍和22.5 倍。Yang 等[46]將短小芽孢桿菌ML413 的GGT重組到枯草芽孢桿菌168 中，提高了GGT 的產(chǎn)量和活性。Cho 等[44]把解淀粉芽孢桿菌S0904 的GGT 序列導入大腸桿菌中并表達，重組酶產(chǎn)量提高了56.6 倍。

定點突變是通過對蛋白質中的氨基酸定點突變改變密碼子偏性以提高表達水平，改變蛋白質活性、穩(wěn)定性，改變酶的特異性等。Lin 等[6]把地衣芽孢桿菌GGTAsn450 替換為Ala 和Asp，均提高了轉肽活性，最高可達3.6 倍。Bindal 等[37]將地衣芽孢桿菌GGT 的109 位氨基酸Arg 突變?yōu)長ys，發(fā)現(xiàn)Lys 的取代后GGT 具有更高的轉肽活性和催化效率。Li 等[47]將解淀粉芽孢桿菌GGT 結合口袋中Ser437 替換為Gly，改造后的酶茶氨酸產(chǎn)率從58%上升到83%。

固定化酶既能穩(wěn)定酶結構，保持酶的活力；還便于酶和產(chǎn)物的分離。周治等[48]以鎳螯合環(huán)氧載體作為載體將GGT 進行共價固定化，固定化的酶對溫度和pH 值的穩(wěn)定性有明顯提高。韋敏等[49]針對GGT 的pH 值耐受性差問題，以硅烷化改性的介孔氧化鈦晶須為載體對重組枯草芽胞桿菌GGT進行固定化，提高了酶的pH 值耐受性和熱穩(wěn)定性。Lin 等[50]把地衣芽孢桿菌的GGT 固定在氧化石墨烯納米片上，固定化后可重復使用9 次，生物催化合成γ-L-谷氨酰苯丙氨酸和γ-L-谷氨酰亮氨酸的產(chǎn)率均在31%以上。Bruni 等[51]利用辛基乙氧基-瓊脂糖固定了γ-谷氨酰轉肽酶，開發(fā)一種用于合成γ-谷氨酰氨基酸的強效生物催化劑，在γ-谷氨酰甲硫氨酸合成反應中，反應6 d 后仍保持95%以上的活性，而反應6 個循環(huán)（18 d）后仍保持85%的活性。

6 總結與展望

γ-谷氨酰轉肽酶是原核生物和真核生物中普遍存在的一種酶，具有很高的序列相似性和進化保守性，這有利于通過合成生物學手段實現(xiàn)物種間的基因交換與蛋白質工程設計。GGT 獨特的水解和轉肽的催化反應，根據(jù)其最適的pH 值不同，通過調(diào)節(jié)反應液的pH 值，可以選擇性的利用這兩種催化反應中的一種，因此在食品工業(yè)中引起廣泛的重視，例如利用轉肽活性合成γ-谷氨酰肽或利用水解活性在醬油發(fā)酵中產(chǎn)生谷氨酸。對于GGT 結構與功能的研究已得到深入的了解，結合酶工程等手段改造GGT 分子是提高其應用價值的是重要的手段。

雖然近年來GGT 的研究取得了顯著的進展，但是與其它能夠規(guī)?；a(chǎn)的酶相比進展緩慢。GGT 生產(chǎn)成本相對較高、活性、穩(wěn)定性等是阻礙其工業(yè)化應用的主要缺點之一。深入探索生物多樣性，以鑒定高產(chǎn)菌株是未來最有希望的替代方案之一?；蛑亟M技術和定點突變已被證明是蛋白質工程中不可估量的工具，應把更多的重點放在探索酶的生產(chǎn)技術上，提高GGT 的性能，以適應不同的工業(yè)需求。GGT 的結構分析，包括活性必須基團的鑒定和相互作用的闡明，將有助于建立不同來源的γ-谷氨酰轉肽酶的結構與功能關系，尤其是GGT 涉及受體的結合殘基仍然未完全明確。總的來說，現(xiàn)有研究水平尚停留在實驗室研究階段，為此需要通過篩選高酶活性、穩(wěn)定性的酶來源，以及結合酶工程改造等策略，提高GGT 的γ-谷氨酰肽合成能力。