王曉艷，韓延超*，吳偉杰，劉瑞玲，陳杭君，高 原，房祥軍，郜海燕

（1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310021 2 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310021）

毛豆（Glycine max（L.）Merr）又稱菜用大豆，豆莢呈嫩綠色，籽粒飽滿，富含蛋白質(zhì)、維生素等成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是一種重要的豆類(lèi)蔬菜[1-2]。毛豆采收期集中在高溫、高濕的8～10 月，因其含水量大，生理代謝旺盛，故采后極易出現(xiàn)失水、腐爛、黃化、褐變等現(xiàn)象，從而降低毛豆的食用品質(zhì)和商品價(jià)值[3]。色澤是消費(fèi)者衡量果蔬品質(zhì)變化的重要指標(biāo)，果蔬貯藏過(guò)程中色澤由綠到黃的變化主要是由葉綠素降解引起的[4]。葉綠素降解往往伴隨類(lèi)胡蘿卜素的生成，使果蔬表面的綠色減少，同時(shí)顯現(xiàn)出紅、橙、黃等顏色[5]。當(dāng)葉綠素降解時(shí)，葉綠素a（Chlorophyll a，Chl a）首先在葉綠素酶（Chlorophyllase，CLH）的催化作用下發(fā)生脫植基反應(yīng)，然后進(jìn)行脫鎂反應(yīng)生成脫鎂葉綠酸a，其在脫鎂葉綠酸a 加氧酶（Pheophorbide a oxygenase，PAO）和紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶（Red chlorophyll catabolite reductase，RCC）催化下轉(zhuǎn)化成初生熒光葉綠素代謝產(chǎn)物（Primary fluorescent chlorophyll catabolites，pFCC），pFCC 發(fā)生非酶學(xué)的異構(gòu)化形成非熒光葉綠素代謝產(chǎn)物（Nonfluorescent chlorophyll catabolites，NCC），從綠色降解成無(wú)色化合物，最終完成葉綠素降解[6-8]。王軍萍等[9]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制葉綠素降解相關(guān)酶活性，可以有效抑制西蘭花葉綠素降解和黃化。據(jù)研究，毛豆在貯藏期間豆莢的黃化現(xiàn)象可能是由葉綠素降解引起的[10-11]。因此，尋找一種合適的貯藏方式來(lái)抑制毛豆莢葉綠素降解、控制黃化現(xiàn)象具有重要意義。

氣調(diào)保鮮主要通過(guò)調(diào)節(jié)貯藏過(guò)程中CO2和O2比例以及溫、濕度，抑制果蔬呼吸作用、乙烯生成等生理代謝過(guò)程，從而延緩果蔬成熟、衰老和褐變，維持其貯藏品質(zhì)，保持較好的色澤[12-13]。由于氣調(diào)具備安全、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來(lái)被廣泛用于果蔬保鮮。王利斌等[14]研究發(fā)現(xiàn)：與冷藏相比氣調(diào)能夠保持四季豆較高的葉綠素含量，有利于貯藏期品質(zhì)的保持，延長(zhǎng)貨架期。類(lèi)似地，孫志文等[15]發(fā)現(xiàn)，在固定50% O2的前提下，40% CO2能夠有效延緩西蘭花葉綠素的降解；而CO2體積分?jǐn)?shù)過(guò)高易造成西蘭花無(wú)氧呼吸生成乙醇、乙醛等物質(zhì)，過(guò)低的CO2會(huì)加速葉綠素降解，均可導(dǎo)致西蘭花黃化。此外，馬陽(yáng)歷等[16]發(fā)現(xiàn)高O2處理能夠提高西蘭花葉綠素降解酶基因的表達(dá)，進(jìn)一步加快葉綠素降解，引起西蘭花黃化加速。值得注意的是：不同果蔬在氣調(diào)貯藏過(guò)程中所需的CO2和O2比例不同，即使相同的氣體環(huán)境也可能對(duì)果蔬品質(zhì)和色澤有不同影響。

氣調(diào)貯藏過(guò)程中最佳的氣體組合范圍是1%～5% O2與適當(dāng)CO2配比[17]。本研究固定5% O2，探究不同體積分?jǐn)?shù)CO2對(duì)毛豆貯藏過(guò)程中葉綠素降解的影響，確定一個(gè)較佳的氣調(diào)條件，旨在為毛豆貯藏過(guò)程中品質(zhì)及色澤控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛豆品種為“臺(tái)灣64 號(hào)”，購(gòu)于綠康配送農(nóng)產(chǎn)品有限公司。挑選新鮮、大小一致、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的毛豆。

無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚（分析純級(jí)），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯、甲醇（色譜純級(jí)），上海麥克林生化科技有限公司；葉綠素a、b標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Cintra404 紫外分光光度計(jì)，澳大利亞GBC 公司；Waters e2695 分析型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；YS-XCAB/G401-03 型果蔬氣調(diào)實(shí)驗(yàn)設(shè)備，杭州屹石科技有限公司；CR410 手持色差儀，日本SEMSING 公司；XMTD-8222 水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Bifugo stratos 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司；H7650-TEM 電子顯微鏡，日立高新技術(shù)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 處理方法 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)固定5% O2，將新鮮毛豆分別置于1）5% O2+4% CO2；2）5% O2+8%CO2；3）5% O2+12% CO2的氣體環(huán)境中貯藏，以自然空氣處理作為對(duì)照組。調(diào)節(jié)氣調(diào)箱溫度（4 ±1）℃，濕度85%～90%。貯藏期間每4 d 取樣1 次，每組隨機(jī)取210 g 毛豆測(cè)定色澤等品質(zhì)指標(biāo)；同時(shí)分離毛豆莢和毛豆仁，液氮速凍后，凍存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.2.1 色澤 參考盧瑞雪等[18]的方法，使用手持色差儀測(cè)定毛豆莢a*、b*值，每個(gè)處理組取20 個(gè)毛豆，每個(gè)毛豆隨機(jī)測(cè)4 個(gè)點(diǎn)，取平均值。

1.3.2.2 葉綠素含量 參考嚴(yán)銳等[19]的方法，稱取研磨成粉的毛豆莢樣品0.5 g，加入5 mL 丙酮-乙醇（體積比2∶1）溶液，4 ℃避光浸提3 h，過(guò)濾取上清液分別于波長(zhǎng)663 nm 和645 nm 處測(cè)定吸光度，用體積分?jǐn)?shù)2∶1 的丙酮-乙醇溶液調(diào)零。

1.3.2.3 葉綠素酶（CLH）活性的測(cè)定 參考Keiji等[20]的方法提取酶液，并略作修改。稱取液氮研磨成粉的毛豆莢樣品2.0 g，加入10 mL -20 ℃預(yù)冷的丙酮，浸泡殘?jiān)敝翢o(wú)色，殘?jiān)? ℃放置過(guò)夜，加5 mL 50 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0，含50 mmol/L KCl 和2.4 g/L Triton X-100），4 ℃條件下浸 提1 h 后，4 ℃、12 000 r/min 條件下離心15 min，上清液即為粗酶提取液。

底物葉綠素a 丙酮溶液的制備方法如下：參考宋小青等[21]的方法。稱取20.0 g 菠菜，加入100 mL 的預(yù)冷丙酮，冰浴研磨勻漿，真空抽濾，向?yàn)V液加入1/7 體積的雜環(huán)己烷，邊振蕩邊緩慢加入1/6體積的蒸餾水。0.5 h 后，于4 ℃、10 000 r/min 條件下離心20 min，棄上清，向沉淀中加入30 mL 混合溶液（V丙酮∶V雜環(huán)己烷∶V蒸餾水=20∶3∶7）。靜置1 h 后，再次離心上清液，沉淀用丙酮溶解，于-30 ℃避光保存。

酶活性的測(cè)定方法如下：參考Aiamla-Or 等[22]的方法，略有修改。反應(yīng)體系包括：0.1 mL 0.1 μmol/mL 葉綠素a 丙酮溶液，0.5 mL 100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.5），0.5 mL 葉綠素酶提取液（蒸餾水作為空白），充分混勻，黑暗條件下50℃恒溫水浴1 h，不斷地?cái)嚢琛＜尤? mL 預(yù)冷丙酮結(jié)束反應(yīng)，再加入4 mL 正己烷，劇烈搖動(dòng)，靜置分層后取下層丙酮層測(cè)定波長(zhǎng)667 nm 處的吸光度值，以每克毛豆鮮樣每小時(shí)變化1 個(gè)吸光度值為U，結(jié)果以U/g 表示。

1.3.2.4 脫鎂螯合酶（MDCase）活性的測(cè)定 酶液提取方法同1.3.2.3 節(jié)葉綠素酶的提取方法。

底物葉綠酸a 溶液的制備方法如下：參考Balschun 等[23]的方法略有改動(dòng)。取4.5 mL 8.0 μg/mL 葉綠素a 丙酮溶液，加入1.12 mL 蒸餾水，再加入8.4 mL 石油醚劇烈搖動(dòng)。棄去下層水相，用4.2 mL 蒸餾水洗滌上層醚相3 次，然后加入50 μL 30% KOH（甲醇溶解），脫鎂葉綠酸a 開(kāi)始沉淀，離心后將沉淀溶于10 mL 蒸餾水中，并用1 mol/L Tris-HCl 調(diào)節(jié)pH 值至9.0，即得底物葉綠酸a 溶液。

酶活性測(cè)定參考Kaewsuksaeng 等[24]的方法。反應(yīng)體系包含：1.6 mL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0，含0.1% Triton X-100），200 μL 葉綠酸a 溶液和400 μL 酶液，混合均勻，在25 ℃避光條件下反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng)687 nm 處測(cè)定溶液吸光度值，以每克毛豆鮮樣每小時(shí)變化1 個(gè)吸光度值為U，結(jié)果以U/g 表示。

1.3.2.5 脫鎂葉綠素酶（PPH）活性的測(cè)定 酶液提取參考范林林等[25]的方法。稱取液氮研磨成粉的毛豆莢2.0 g，加入10 mL -20 ℃預(yù)冷丙酮，浸泡殘?jiān)敝翢o(wú)色，殘?jiān)? ℃放置過(guò)夜，加入10 mL 50 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 8.0），4 ℃條件下浸提1 h，于4 ℃、12 000 r/min 條件下離心15 min，上清液即為酶提取液。

底物制備方法如下：取10 mL 89.29 μg/mL 葉綠素a 丙酮溶液加入0.1 mol/L HCl 溶液，反應(yīng)2 min 后加入0.1 mol/L NaOH 溶液中和多余的酸，以此作為脫鎂葉綠素酶的底物溶液。

酶活測(cè)定參考Schelbert 等[26]方法略作修改。反應(yīng)體系包含：0.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 μL 脫鎂葉綠素a 丙酮溶液和500 μL 酶液?；旌衔镉?5 ℃培養(yǎng)40 min，加入2 mL 丙酮終止反應(yīng)。在波長(zhǎng)667 nm 處測(cè)定吸光值，以每克毛豆鮮樣每小時(shí)變化1 個(gè)吸光度值為U，結(jié)果以U/g表示。

1.3.2.6 葉綠素衍生物含量HPLC 分析 脫鎂葉綠素a/b 溶液制備：在3 mL 500 μg/mL 葉綠素a/b丙酮溶液中分別加入30 μL 1 mol/L 鹽酸；脫植基葉綠素a 溶液制備參考Chen 等[27]的方法，20 g 橙皮研磨后丙酮浸提脫色，殘?jiān)屑尤霚y(cè)定CLH 酶的提取液，離心后上清液加無(wú)水硫酸銨析出酶蛋白，將蛋白溶于100 mmol/L pH 7.0 磷酸緩沖液中，加入1 mL 150 μg/mL 葉綠素a 丙酮溶液，和5 mL 100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0），37 ℃恒溫振蕩1 h；脫鎂葉綠酸a 溶液制備：500 μL 脫植基葉綠素a 加入30 μL 濃鹽酸振蕩混勻。以上制備液均用乙醚萃取后純凈水洗滌4 次，氮吹干后溶于1 mL -20 ℃預(yù)冷丙酮，0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾后，HPLC 分析測(cè)定。

葉綠素衍生物含量測(cè)定參考朱玲玲[28]的方法，稱取4 g 毛豆莢，用20 mL 預(yù)冷丙酮于4 ℃超聲提取20 min，靜置30 min 至組織無(wú)色，過(guò)濾。將上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入10 mL 10% NaCl和20 mL 無(wú)水乙醚，劇烈振蕩后靜置3 min 分層，棄下層，乙醚相中加超純水洗滌（重復(fù)3 次），加無(wú)水硫酸鈉后氮吹干，溶于1 mL 丙酮溶液，0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，HPLC 分析測(cè)定。

液相色譜條件參考張麗華[29]的方法，流動(dòng)相A：V甲醇（色譜級(jí)）∶V超純水=3∶1 混合溶液，流動(dòng)相B：色譜級(jí)乙酸乙酯，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)430 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2.7 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察 參考Cheng 等[30]的方法，將對(duì)照組和8% CO2處理組貯藏0 d 和24 d 的毛豆莢切成1 mm×2 mm 的小塊，在4 ℃下用2.5%戊二醛固定過(guò)夜，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液洗滌（pH 7.0）用0.1 mol/L 四氧化鋨（OsO4）固定3 h，乙醇（50%，70%，80%，90%，95%，100%）梯度脫水，100% 丙酮脫水。樣品嵌入Spur 樹(shù)脂（SpiChem，Spur，PA）中包埋24 h。超微切割機(jī)切片后用堿性檸檬酸鉛和醋酸鈾酰染色，使用H7650-TEM 電子顯微鏡觀察和記錄圖像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和整理采用Excel 2010 軟件，采用IBM SPSS 22.0 軟件顯著性分析（P<0.05），Graph-Pad Prism 8 軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣調(diào)貯藏對(duì)毛豆莢色澤的影響

a*、b*值分別代表果蔬色澤的紅綠和藍(lán)黃水平，a*值越大表明綠色越弱，b*值越大表明黃化程度越嚴(yán)重[31]。如圖1a 所示，貯藏過(guò)程中毛豆莢a*值逐漸增大，貯藏第8 天開(kāi)始?xì)庹{(diào)組a*值顯著地低于對(duì)照組（P<0.05）；貯藏20 天時(shí)，對(duì)照組a*值比4% CO2、8% CO2及12% CO2組分別高8.48%，39.12%，31.81%，說(shuō)明8% CO2和12%CO2貯藏組能夠更好的抑制毛豆莢貯藏期間綠色的減弱。如圖1b 所示，b*值在貯藏過(guò)程中整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，可能是因?yàn)橘A藏后期毛豆莢發(fā)生褐變，所以b*值開(kāi)始下降。貯藏后期氣調(diào)組b*值顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。綜上，氣調(diào)貯藏能夠有效延緩毛豆莢的黃化，達(dá)到較好的保綠效果，5% O2+8% CO2貯藏組效果最佳，5% O2+12% CO2貯藏組次之。

圖1 氣調(diào)貯藏對(duì)毛豆莢色澤的影響Fig.1 Effects of controlled atmosphere storage on the color of soybeans

2.2 氣調(diào)貯藏對(duì)毛豆莢葉綠素含量的影響

毛豆采后貯藏過(guò)程中色澤的變化與葉綠素含量密切相關(guān)[32]。如圖2a 所示，毛豆在貯藏過(guò)程中葉綠素含量隨貯藏時(shí)間逐漸下降，其中對(duì)照組下降最為迅速，貯藏20 d 時(shí)其葉綠素含量下降了49.83%；氣調(diào)貯藏組能夠顯著延緩葉綠素含量的下降（P<0.05），其中5% O2+8% CO2貯藏組保持較高的葉綠素含量。

圖2 氣調(diào)貯藏對(duì)毛豆莢葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of controlled atmosphere storage on the chlorophyll concent of soybeans

葉綠素含量是由葉綠素a 和葉綠素b 含量共同決定。由圖2b 和2c 可知，毛豆貯藏期間葉綠素a 和葉綠素b 含量均逐漸下降，對(duì)照組葉綠素a/b含量均顯著低于氣調(diào)貯藏組（P<0.05），其中5%O2+8% CO2貯藏組維持了較高的葉綠素a/b 含量，貯藏20 天時(shí)其含量最高分別為40.32 μg/g 和20.37 μg/g，12% CO2貯藏組次之，而對(duì)照組含量?jī)H30.61 μg/g 和11.00 μg/g，提示5% O2+8% CO2貯藏組能夠顯著抑制毛豆貯藏期間葉綠素的降解（P<0.05），維持較高的葉綠素含量，保持較好的色澤與品質(zhì)。與5% O2+8% CO2貯藏組相比，4%和12% CO2貯藏組加速了葉綠素的降解，CO2體積分?jǐn)?shù)過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致葉綠素降解，從而使毛豆出現(xiàn)黃化現(xiàn)象[15]。

2.3 氣調(diào)貯藏對(duì)毛豆莢葉綠素降解酶活性的影響

CLH 是果實(shí)成熟過(guò)程中的分解酶，也是葉綠素降解的限速酶，能夠催化葉綠素降解生成脫脂基葉綠素[33]。如圖3a 所示，貯藏過(guò)程中，毛豆莢CLH 活性整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，對(duì)照組保持較高的CLH 活性，貯藏20 天時(shí)對(duì)照組CLH 活性最高為0.87 U/g，4% CO2和12% CO2貯藏組活性分別為0.74 U/g 和0.63 U/g，5% O2+8%CO2貯藏組CLH 活性最低為0.50 U/g 相比對(duì)照下降了42.53%。因此，與4% CO2和12% CO2貯藏組相比，5% O2+8%CO2貯藏組能夠顯著地抑制CLH活性（P<0.05）。

圖3 氣調(diào)貯藏對(duì)毛豆莢CLH、MDCase和PPH 活性的影響Fig.3 Effects of controlled atmosphere storage on the activities of CLH，MDCase and PPH in soybeans

MDCase 和PPH 在葉綠素降解過(guò)程中起重要作用。如圖3b 和3c 所示，毛豆莢MDCase 和PPH活性均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸上升。貯藏前期對(duì)照組MDCase 和PPH 活性顯著高于5% O2+8%CO2處理組（P<0.05），與另外兩個(gè)處理組之間差異不顯著；對(duì)照組MDCase 和PPH 活性快速上升，至貯藏20 天時(shí)分別上升了42.86%和73.33%，其活性顯著高于氣調(diào)貯藏組（P<0.05）；其中8% CO2貯藏組MDCase 和PPH 活性最弱，12% CO2貯藏組次之，而4%和12% CO2貯藏組間差異不顯著。結(jié)果表明，氣調(diào)貯藏能夠有效鈍化MDCase 和PPH 活性，延緩葉綠素的降解，使毛豆在貯藏期間保持較好的綠色，其中5% O2+8%CO2貯藏組效果最佳。

2.4 氣調(diào)貯藏對(duì)毛豆莢葉綠素衍生物含量的影響

由圖4a 和4b 可知，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)毛豆莢脫鎂葉綠素a 含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。貯藏第8 天時(shí)各貯藏組保持較高的葉綠素a 含量，其中8% CO2貯藏組含量最高為10.10 μg/g，顯著高于其它貯藏組（P<0.05）；貯藏8 d 以后各貯藏組脫鎂葉綠素a 含量迅速下降，至貯藏20 d 時(shí)對(duì)照組含量?jī)H3.166 μg/g，顯著低于氣調(diào)貯藏組（P<0.05）。脫鎂葉綠素b 含量則隨貯藏時(shí)間逐漸減少，氣調(diào)貯藏組脫鎂葉綠素b 含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），其中5% O2+8% CO2貯藏組保持了較高的含量，4% CO2和12% CO2貯藏組含量雖顯著低于8% CO2貯藏組，但兩貯藏組之間無(wú)顯著性差異。

圖4 氣調(diào)貯藏對(duì)毛豆莢葉綠素衍生物含量的影響Fig.4 Effects of controlled atmosphere storage on the content of chlorophyll derivatives in soybeans

如圖4c 和圖4d 所示，脫植基葉綠素a 和脫鎂葉綠酸a 含量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)整體呈上升趨勢(shì)。其中，脫植基葉綠素a 含量在貯藏前8 天變化緩慢，貯藏第12 天時(shí)上升速度加快，貯藏20 天時(shí)對(duì)照組含量最高為1.78 μg/g 上升了49.43%；氣調(diào)貯藏組變化較為平緩，貯藏20 天時(shí)4% CO2和12% CO2貯藏組含量分別為1.48 μg/g 和1.38 μg/g，8% CO2貯藏組含量最低僅1.07 μg/g，顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。對(duì)照組脫鎂葉綠酸a 含量在貯藏8 天前迅速上升，在貯藏后期上升趨勢(shì)較為平緩，貯藏20 天時(shí)對(duì)照組含量最高為5.20 μg/g，4%CO2、8% CO2以及12% CO2貯藏組脫鎂葉綠酸a 含量分別為4.74，4.09 μg/g 和4.44 μg/g。氣調(diào)貯藏顯著抑制了脫鎂葉綠酸a 含量的上升（P<0.05），8% CO2貯藏組效果最好。因此，與對(duì)照相比氣調(diào)貯藏組顯著延緩了脫鎂葉綠酸a 和脫植基葉綠素a 含量的上升，其中5% O2+8% CO2貯藏組效果最佳，4%和12% CO2貯藏組與8% CO2貯藏組相比加快了毛豆葉綠素的降解，在貯藏后期效果更加明顯。

2.5 毛豆莢葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

在果蔬貯藏過(guò)程中葉綠素降解往往伴隨著葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化[34]。由圖5 可知，鮮莢毛豆采后隨貯藏時(shí)間葉綠體結(jié)構(gòu)逐漸解體。采收當(dāng)天葉綠體結(jié)構(gòu)完整，基質(zhì)片層與基粒片層排列規(guī)則，嗜鋨顆粒分散其中，雙層膜結(jié)構(gòu)完整。毛豆采后貯藏20 天時(shí)，對(duì)照組葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，基粒片層模糊不清，雙層膜結(jié)構(gòu)消失；5% O2+8% CO2處理組葉綠體結(jié)構(gòu)較完整呈橢圓形，基粒片層發(fā)生部分?jǐn)嗔?，排列輕微松散。結(jié)果表明人工氣調(diào)處理能夠延緩鮮莢毛豆貯藏過(guò)程中葉綠體超微結(jié)構(gòu)的分解，延長(zhǎng)鮮莢毛豆的貯藏時(shí)間。

圖5 氣調(diào)貯藏對(duì)毛豆莢葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of controlled atmosphere storage on chloroplast ultrastructure of soybean pods

3 討論

毛豆貯藏過(guò)程中的黃化現(xiàn)象主要是由葉綠素降解引起的。有研究表明適宜的CO2能夠有效延緩果蔬貯藏過(guò)程中綠素降解，然而CO2體積分?jǐn)?shù)過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)果蔬造成一定損傷，加速其葉綠素的降解，從而加快果蔬黃化的進(jìn)程[17]。在西蘭花貯藏過(guò)程中，CO2體積分?jǐn)?shù)過(guò)高易造成西蘭花無(wú)氧呼吸生成乙醇、乙醛，過(guò)低則會(huì)造成西蘭花CLH、和PPH 活性升高，加快葉綠素降解，使西蘭花發(fā)生黃化[15]。李棟[34]的研究也發(fā)現(xiàn)，10%和20%CO2處理能夠有效延緩果實(shí)采后硬度與色澤的變化，而30% CO2處理會(huì)造成果實(shí)色澤的劣變，高CO2能夠誘導(dǎo)葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)，并抑制葉綠素降解相關(guān)基因表達(dá)。這與本研究結(jié)果相似，4%，8%和12% CO2貯藏組均能鈍化CLH、MDCase 和PPH 活性，維持葉綠素含量，減慢毛豆莢貯藏過(guò)程中的黃化現(xiàn)象，其中5% O2+8% CO2貯藏組保綠效果最佳。

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，毛豆葉綠素含量整體呈下降趨勢(shì)。從葉綠素降解衍生物含量變化來(lái)看，氣調(diào)貯藏組脫鎂葉綠素a 含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，脫鎂葉綠素b 含量在貯藏初期較高，在貯藏后期含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；而脫植基葉綠素a 和脫鎂葉綠酸a 含量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升，出現(xiàn)積累現(xiàn)象，氣調(diào)貯藏延緩了其含量的上升。這可能是因?yàn)樵诿官A藏過(guò)程中呈黃綠色的葉綠素b 在葉綠素還原酶的的催化下轉(zhuǎn)化為葉綠素a，葉綠素a 又在CLH 和MDCase 的作用下生成脫鎂葉綠酸a；MDCase 也會(huì)以脫鎂葉綠素作為中間產(chǎn)物，先除去鎂離子，隨后在PPH 的作用下除去植基，最終轉(zhuǎn)化生成脫鎂葉綠酸a[35]。葉綠素的降解可能會(huì)受到酶類(lèi)的控制[36]，其酶活性的高低可能會(huì)影響葉綠素降解的進(jìn)程。在本研究中氣調(diào)貯藏能夠顯著鈍化CLH、MDCase、PPH 等酶的活性，從而延緩了脫鎂葉綠素a/b 轉(zhuǎn)化為脫植基葉綠素a 和脫鎂葉綠酸a 的進(jìn)程[21]，抑制了葉綠素降解。5% O2+8%CO2貯藏組保綠效果最佳，較好地維持了毛豆的色澤，12% CO2貯藏組次之。4% CO2貯藏組由于CO2體積分?jǐn)?shù)較低，導(dǎo)致葉綠素降解酶活性升高，加快了葉綠素的降解。萬(wàn)永紅[37]、宋慕波等[38]研究發(fā)現(xiàn)適宜的CO2能夠通過(guò)抑制MDCase、PPH 等酶的活性，從而延緩葉綠素a 的降解，維持果蔬較長(zhǎng)的貨架期。Yu 等[39]研究發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)抑制葉綠素酶和磷酰氧化物a 加氧酶等的酶活性和基因表達(dá)從而減緩采后茶葉葉綠素的降解。同時(shí)高體積分?jǐn)?shù)CO2可以加快PPH、PAO 等葉綠素降解相關(guān)酶基因的表達(dá)，促進(jìn)葉綠素的降解，加快柑橘果皮顏色的變化[40]。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化是果實(shí)發(fā)育成熟及衰老過(guò)程的重要特征。隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果實(shí)細(xì)胞及其超微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，葉綠體發(fā)生解體[41]。本研究發(fā)現(xiàn)5% O2+8% CO2貯藏組與對(duì)照相比能夠保持較為完整的葉綠體超微結(jié)構(gòu)，減緩了細(xì)胞結(jié)構(gòu)與葉綠體的損傷，從而減緩葉綠素的降解。

4 結(jié)論

氣調(diào)貯藏能夠顯著抑制毛豆貯藏期間葉綠素的降解，保持較好的外觀品質(zhì)，貯藏8 d 開(kāi)始5 O2+8% CO2處理組與4% CO2和12% CO2處理組相比更好地保持了色澤，鈍化了鮮莢毛豆貯藏過(guò)程中CLH、PPH 以及MDCase 活性升高，抑制了葉綠素含量的下降，延緩了脫植基葉綠素a 和脫鎂葉綠酸a 含量的增加。5 O2+8% CO2貯藏組保持了相對(duì)完整毛豆莢葉綠體結(jié)構(gòu)。因此5 O2+8%CO2處理能夠通過(guò)鈍化葉綠素降解相關(guān)酶活性的上升，延緩葉綠素衍生物含量的增加，從而延緩葉綠素的降解，使其維持較好的色澤和品質(zhì)，為鮮莢毛豆貨架期延長(zhǎng)提供理論依據(jù)。