惠珍珍，李 娜，王曉萱，孫舒揚，王 平，杜 超，3，4*

（1 魯東大學食品工程學院 山東煙臺264025 2 魯東大學生物納米技術(shù)研究院 山東煙臺264025 3 煙臺市預(yù)制食品納米科學與技術(shù)重點實驗室 山東煙臺264025 4 煙臺市綠色食品加工與質(zhì)量控制工程研究中心 山東煙臺 264025）

文蛤（Meretrix meretrix Linnaeus）又稱為蛤蜊，是重要的食用貝類之一，主要分布在我國沿海地區(qū)[1]。新鮮文蛤含水量約為85%，灰分含量約為1%，總糖含量約為2%，粗蛋白質(zhì)含量約為11%，其中水溶性蛋白約占45%，可作為活性組分的良好來源[2]。文蛤多肽是文蛤提取物中重要的生物活性成分，近代研究發(fā)現(xiàn)，它具有抗氧化、抗腫瘤、消除炎癥、抗衰老，調(diào)節(jié)機體免疫功能等多種活性作用[3-5]。

免疫活性肽是指具有免疫活性的分子質(zhì)量相對較小的寡肽。免疫活性肽的種類較多，包括從動植物組織器官中和微生物體內(nèi)提取的生物活性肽、食源性蛋白質(zhì)酶解生成的一些寡肽，以及利用化學法合成或DNA 重組來生成的一些寡肽等[6-8]。目前免疫活性肽制備最常用方法是酶解法，這是因為酶解法的生產(chǎn)條件比較溫和、安全性較高的同時又具有價格優(yōu)勢，且專一性強。He 等[9]采用堿性蛋白酶對波紋巴非蛤進行酶解，得到的最佳酶解條件為溫度51 ℃，時間3.14 h，酶添加量4 321 U/g。劉靜波等[10]用5 種蛋白酶對豆粕進行酶解，篩選出復(fù)合蛋白酶為最佳用酶，并對其制備工藝進行優(yōu)化，當?shù)孜镔|(zhì)量濃度0.04 g/mL，加1%的酶，調(diào)節(jié)pH 值至6.5 時在50 ℃酶解7 h，豆粕肽得率最高。胡旭陽等[11]利用日本黃姑魚魚肉制備多肽，確定最適用酶為木瓜蛋白酶，經(jīng)過優(yōu)化得到當料液比1∶11，pH 6，于59 ℃酶解5.4 h 時，所得多肽對RAW264.7 細胞的相對增殖率近62%。

本研究是酶解文蛤以制備免疫活性肽，先篩選最適用酶，然后對酶解條件進行優(yōu)化，從而確定文蛤免疫活性肽的最佳制備條件，并對其免疫活性進行研究，為文蛤蛋白制備新型免疫活性肽提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與主要儀器

文蛤，山東省煙臺市文化路市場；RAW264.7細胞（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞），中國科學院細胞庫；堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，北京Solarbio公司；木瓜蛋白酶，上海生物工程公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，美國Sigma 公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清，武漢普諾賽公司；CCK-8 試劑盒、一氧化氮（NO）試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH 計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；酶標儀，瑞士帝肯集團公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher 公司；熒光倒置顯微鏡，卡爾蔡司（上海）管理有限公司。

1.3 方法

1.3.1 文蛤初始酶解條件 文蛤去殼后于勻漿機內(nèi)攪成肉糜，取5 g 文蛤肉糜，以料液比1∶6 加入相應(yīng)溶液，對pH 值進行調(diào)節(jié)后預(yù)熱到對應(yīng)水解的溫度，再加入蛋白酶隨后酶解3 h，酶解結(jié)束，高溫滅酶15 min，冷卻、5 000 r/min 離心20 min，取上清液備用。

1.3.2 最適蛋白酶的篩選 參考白仁奧[12]、André等[13]的酶解條件略作修改，分別用5 種蛋白酶對文蛤勻漿進行酶解。利用CCK-8 法檢測不同酶解產(chǎn)物對細胞相對增殖率的影響，篩選出最適蛋白酶。酶解條件見表1。

表1 蛋白酶水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of protease

1.3.3 酶解條件的單因素實驗 以料液比1∶6、酶解時間3 h、溫度45 ℃、pH 7.0、酶添加量3 600 U/g 為基本條件，分別對酶添加量（2 600，3 100，3 600，4 100，4 600 U/g）、溫度（35，40，45，50，55℃）、pH（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）、酶解時間（2，3，4，5，6 h）、料液比（1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10）5 個因素進行優(yōu)化，最終以酶解產(chǎn)物對細胞相對增殖率的影響作為評價依據(jù)。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 對單因素實驗結(jié)果進行分析，選擇3 個影響較顯著酶解條件，進行響應(yīng)面優(yōu)化，并對優(yōu)化得到的結(jié)果進行驗證。

1.3.5 細胞培養(yǎng) 利用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃下培養(yǎng)細胞[14]。

1.3.6 CCK-8 法測細胞增殖率 細胞密度2.5×105cells/mL，每孔200 μL 加入96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后棄上清。樣品組加入一定濃度的樣品，空白組加等體積的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)8 h 后用CCK-8法測相對增殖率，用酶標儀于450 nm 處測定吸光度值[15]。細胞相對增殖率（Relative growth rate，RGR）按式（1）計算結(jié)果：

式中，A——樣品組吸光度，A0——空白組吸光度。

1.3.7 不同質(zhì)量濃度MLIP 對細胞相對增殖率的影響 參考1.3.6 節(jié)的密度接種細胞，培養(yǎng)24 h后棄上清，設(shè)樣品組和空白組，樣品組加入不同質(zhì)量濃度的MLIP（0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mg/mL），分別培養(yǎng)8 h 和24 h 后利用CCK-8 法測定相對增殖率[16]。

1.3.8 細胞形態(tài)學觀察 參考1.3.6 節(jié)的方法將稀釋好的細胞按每孔1 mL 加入12 孔板，培養(yǎng)24 h 后棄上清，設(shè)樣品組和空白組，樣品組加入不同質(zhì)量濃度的MLIP，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，利用倒置顯微鏡，進行細胞形態(tài)變化的觀察及拍照[17]。

1.3.9 不同質(zhì)量濃度MLIP 對細胞NO 釋放量的影響 參考1.3.6 節(jié)的方法將稀釋好的細胞按每孔200 μL 加入96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后棄上清，樣品組加入不同質(zhì)量濃度的MLIP，對照組加入1 μg/mL 脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），同時設(shè)空白組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將各孔中的細胞上清液收集后，參考試劑盒說明書，通過酶標儀測定吸光度值，計算NO 的釋放量[18]。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 SPSS 27.0 軟件進行顯著性分析，Design-Expert V8.0.6 軟件進行響應(yīng)面模擬分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶的篩選

如圖1 所示，酶解產(chǎn)物對細胞增殖率最高的是復(fù)合蛋白酶，其后依次為堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶。因此選擇復(fù)合蛋白酶為最適蛋白酶。

圖1 不同蛋白酶酶解液對細胞增殖率的影響Fig.1 Effects of different protease enzymolysis solution on cell proliferation rate

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 酶添加量對細胞相對增殖率的影響 如圖2 所示，酶添加量為2 600 U/g 到3 600 U/g 時，文蛤多肽對細胞的相對增殖率是越來越高的，酶添加量達到3 600 U/g 時，文蛤多肽對細胞的相對增殖率最高，這是因為酶添加量的增加，會使酶與底物蛋白之間的相互作用增強[19]。隨著酶加入量的不斷提高，文蛤多肽對細胞的相對增殖率不再隨著酶加入量的提高而提高，而是呈現(xiàn)出了降低的趨勢，這可能與所產(chǎn)生的多肽再一次被酶分解有關(guān)[20]。因而最適酶添加量選擇3 600 U/g。

圖2 酶添加量對細胞相對增殖率的影響Fig.2 Effects of enzyme additive amount on cell relative proliferation rate

2.2.2 pH 值對細胞相對增殖率的影響 如圖3所示，pH 值從5.0 到9.0，文蛤多肽對細胞的相對增殖率先升高，當pH 值為7.0 時達到最高，隨后又降低。這是因為每一種蛋白酶都有一個最適合的pH 值范圍，pH 值的變化會導致酶的作用位點產(chǎn)生變化，從而直接對酶解反應(yīng)產(chǎn)生影響[21]。因此，酶解的最佳pH 值選擇7.0。

圖3 pH 值對細胞相對增殖率的影響Fig.3 Effects of pH value on cell relative proliferation rate

2.2.3 酶解溫度對細胞相對增殖率的影響 如圖4 所示，當溫度從35 ℃升高到55 ℃時，文蛤多肽對細胞相對增殖率逐漸升高，當酶解溫度為45 ℃時，細胞相對增殖率最高，而后有降低的趨勢。這是由于在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度的升高會加速分子的運動速度，因此，酶與底物反應(yīng)速率開始增加，這對制備免疫活性肽有利[22]。然而，如果溫度太高，則會使蛋白酶活力下降，對免疫活性肽的制備不利[23]。因此，最佳酶解溫度選擇45 ℃。

圖4 溫度對細胞相對增殖率的影響Fig.4 Effects of temperature on cell relative proliferation rate

2.2.4 酶解時間對細胞相對增殖率的影響 如圖5 所示，當時間在2～3 h 時，文蛤多肽對細胞的相對增殖率是升高的，3 h 時達到最高。超過3 h 后，文蛤多肽對細胞的相對增殖率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。推測主要原因是隨著酶解時間延長，所得到的產(chǎn)物會繼續(xù)被分解，使有效活性成分減少，進而造成細胞相對增殖率反而下降[24]。故選擇酶解時間為3 h 左右。

圖5 時間對細胞相對增殖率的影響Fig.5 Effects of time on cell relative proliferation rate

2.2.5 料液比對細胞的相對增殖率的影響 如圖6 所示，當料液比在1∶4～1∶8 范圍內(nèi)時，文蛤多肽對細胞的增殖作用先上升，當料液比為1∶6 時，細胞相對增殖率達到最大，隨后又逐漸下降?；谖墨I資料推斷：料液比較小時，酶與底物的接觸將更加充分，酶解的程度也將越來越大；隨著料液比的增加，底物被過度稀釋，酶解產(chǎn)物濃度也會隨之下降，從而對細胞相對增殖率產(chǎn)生影響[25-26]。因此，最佳料液比選擇1∶6。

圖6 料液比對細胞相對增殖率的影響Fig.6 Effects of solid-liquid ratio on cell relative proliferation rate

單因素結(jié)果表明，最適酶解條件是：料液比1∶6，酶添加量3 600 U/g 時，pH 7.0，溫度45 ℃，酶解3 h。經(jīng)SPSS 分析，酶添加量、pH 值和料液比對酶解產(chǎn)物的免疫活性影響較顯著，因此選擇這3個因素進行進一步優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗因素與水平表 單因素結(jié)果表明，本試驗最適酶添加量為3 600 U/g，pH 值為7.0，料液比為1∶6，選擇合適的范圍，對響應(yīng)面試驗因素與水平表進行設(shè)計（表2）。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Test factors and levels of response surface

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果 利用軟件Design-Expert V8.0.6 對表3 進行數(shù)據(jù)分析，得到結(jié)果如表4 所示。響應(yīng)值選擇細胞相對增殖率，經(jīng)回歸擬合，得到模型的回歸方程：Y=-903.57341 +0.25411A+121.46336B+39.92297C+0.010118AB+2.41912×10-3AC -0.98036BC -4.83084×10-5A2-11.16623B2-3.34436C2。

表3 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface design and results

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

回歸方程中各變量所對應(yīng)的P 值越小，則相應(yīng)的變量顯著程度越高[27]。如表4 所示，回歸模型P<0.001，說明該模型極顯著；一次項中，A、B 影響極顯著，C 影響顯著。由F 值大小可得，3 個因素對細胞相對增殖率影響影響的順序是，B>A>C；相互作用AB 極顯著（P<0.01）；失擬項不顯著（P=0.2883>0.05），R2=0.9801 說明回歸方程擬合度好，該模型成立。

2.3.3 各因素交互作用對RAW264.7 細胞增殖率的影響 固定一個變量，考察其余2 個變量對細胞增殖率的影響來繪制響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖7 所示。如果響應(yīng)面底部的等高線圖呈橢圓形，說明該變量交互作用顯著[28]。結(jié)果表明，酶添加量與料液比的交互作用最強，與方差分析中的結(jié)果一致。

圖7 各因子交互作用的曲面圖Fig.7 Surface diagram of interaction of various factors

2.3.4 驗證試驗 響應(yīng)面優(yōu)化出的最優(yōu)酶解條件為：酶添加量3 493.03 U/g，pH 6.75，料液比1∶6.24，RAW264.7 細胞相對增殖率為71.395%。由于需要考慮實際操作的準確性與可行性，故確定最佳的制備條件為：酶添加量3 500 U/g，pH 6.8，料液比為1∶6.2。該條件下經(jīng)過3 次平行試驗，測得RAW264.7 細胞相對增殖率為71.75%，與理論值基本吻合，說明響應(yīng)面分析法對文蛤免疫活性肽的制備條件優(yōu)化是可行的。

2.4 MLIP 免疫活性的研究

2.4.1 不同質(zhì)量濃度MLIP 對RAW264.7 細胞相對增殖率的影響 由圖8 可以看出，不同質(zhì)量濃度的MLIP 對RAW264.7 細胞的相對增殖均有一定的促進作用，當MLIP 質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時，MLIP 對RAW264.7 細胞的相對增殖率最高，且存在一定的時間效應(yīng)。MLIP 作用24 h 后對RAW264.7 細胞的增殖率將近110%。葉旺盛等[29]利用青蛤制備免疫活性肽，得到的酶解產(chǎn)物對RAW264.7 細胞的相對增殖率將近80%，董曉澤等[30]利用日本黃姑魚魚皮制備免疫活性肽，得到的酶解產(chǎn)物RAW264.7 細胞的相對增殖率將近60%。

圖8 不同質(zhì)量濃度MLIP 對RAW264.7 細胞相對增殖率的影響Fig.8 Effects of MLIP at different mass concentration on the relative proliferation rate of RAW264.7 cells

2.4.2 細胞形態(tài)觀察 圖9 所示為不同質(zhì)量濃度的MLIP 對RAW264.7 細胞形態(tài)的影響，空白組細胞成團生長，而經(jīng)過MLIP 處理的細胞數(shù)量和形態(tài)都發(fā)生了明顯變化，在數(shù)量上相比空白組明顯增多，隨著MLIP 質(zhì)量濃度的增大，細胞數(shù)量增多越明顯，同時發(fā)生了不同程度的分化。當MLIP 質(zhì)量濃度達到0.8 mg/mL 時，大部分細胞已經(jīng)分化。與葉蕾等[31]的研究中文蛤寡肽高劑量組會導致細胞分化的結(jié)果一致。

圖9 不同質(zhì)量濃度MLIP 對RAW264.7 細胞形態(tài)的影響Fig.9 Effects of MLIP at different mass concentrations on the cell morphology of RAW264.7cells

2.4.3 不同質(zhì)量濃度MLIP 對RAW264.7 細胞NO 釋放量的影響 LPS 可以刺激機體導致機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，會使RAW264.7 細胞被激活從而釋放NO。而NO 是一種信號傳導介質(zhì)，它可以參與一系列生理和病理代謝[32]。圖10 為不同質(zhì)量濃度MLIP 對RAW264.7 細胞NO 釋放量的影響，當加入不同質(zhì)量濃度的MLIP 進行作用，NO 的釋放量相比空白組有明顯的增加，隨著MLIP 質(zhì)量濃度的增加，細胞的NO 的釋放量先增加后減少，當MLIP 質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 時，NO 釋放量達到最大值，甚至略高于LPS 處理組，說明MLIP 可以刺激RAW264.7 細胞釋放NO，進而激活細胞發(fā)生免疫反應(yīng)。

3 結(jié)論

根據(jù)試驗結(jié)果分析，得到的結(jié)果為，制備文蛤免疫活性肽的最適蛋白酶是復(fù)合蛋白酶。通過響應(yīng)面試驗確定文蛤免疫活性肽制備的最佳酶解條件為，酶添加量3 493 U/g、料液比1∶6.2、pH 6.8。通過驗證試驗得到細胞相對增殖率為71.75%，與模型預(yù)測值接近，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化制備文蛤多肽是可行的。細胞增殖、形態(tài)學觀察和NO 釋放結(jié)果表明MLIP 可以有效促進RAW264.7 細胞的增殖，且對NO 的釋放有一定促進作用。本文的研究結(jié)果為文蛤免疫活性肽的制備提供了理論基礎(chǔ)，為免疫活性肽的開發(fā)及文蛤的高值化利用提供了一定思路。