彭晨健 孫海濤 王軍 魏偉 劉岸龍 儲旭東 錢衛(wèi)慶 馬勇, 郭楊 王禮寧*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院骨傷科,江蘇 南京 210022 2.無錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院骨科,江蘇 無錫 214100 3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科,江蘇 南京 210001 4.南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實驗室,江蘇 南京 210023 5.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,江蘇 南京 210022

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種老年人尤其是絕經(jīng)后婦女常見的全身性代謝障礙性骨病,以骨組織微觀結(jié)構(gòu)退化、單位體積骨量減少、骨脆性增加為特征[1-2]。隨著人口老齡化的加快,骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率也越來越高,大多患者在發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折后才獲得明確診斷,從而使得骨質(zhì)疏松癥的診斷存在不同程度地滯后性,成為嚴重危害健康的公共衛(wèi)生問題,給患者和社會帶來了沉重的負擔(dān)[3-4]。

目前臨床上對骨質(zhì)疏松癥的診斷主要通過骨密度檢測(bone mineral density,BMD)來實現(xiàn),但是骨密度變化緩慢具有一定的局限性和滯后性。骨代謝相關(guān)生化指標可反映骨代謝狀態(tài),并作為協(xié)助診斷和鑒別診斷指標,但在疾病發(fā)展早期的敏感性仍顯不足。因此,積極發(fā)現(xiàn)并探索潛在的OP早期診斷相關(guān)生物標志物,提前干預(yù)防止骨質(zhì)疏松癥嚴重并發(fā)癥的發(fā)生,具有重要的臨床價值及社會意義。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一組非編碼RNA,具有較強的穩(wěn)定性和組織特異性,在細胞功能中起著重要作用。隨著人們對表觀遺傳學(xué)研究的深入,大量研究證明了circRNA通過多種途徑參與調(diào)控成骨細胞和破骨細胞分化及功能,從而影響骨形成和骨吸收,與骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),具有作為潛在臨床生物標志物的潛能[5-6]。

綜上,本文擬通過文獻綜述circRNA在骨代謝中的作用,以及circRNA作為生物標志物在骨質(zhì)疏松癥早期診斷中的研究進展。

1 骨質(zhì)疏松癥的生物標志物

生物標志物是指能被客觀測量和評價,反映生理或病理過程,以及對暴露或治療干預(yù)措施產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的指標。生物標志物不僅可從分子水平探討發(fā)病機制,而且在準確、敏感地評價早期、低水平的損害方面有著獨特的優(yōu)勢,可提供早期預(yù)警,很大程度上為臨床醫(yī)生提供了輔助診斷的依據(jù)。

臨床技術(shù)發(fā)展至今,仍是以骨密度作為診斷骨質(zhì)疏松癥、預(yù)測骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生風(fēng)險、評估抗骨質(zhì)疏松藥物治療效果的主要指標。但由于骨密度需憑借雙能DXA儀器進行測量,變化過程緩慢,不能反映短期內(nèi)骨質(zhì)的變化情況,常需結(jié)合骨代謝指標進行動態(tài)監(jiān)測觀察[7]。在OP的診斷過程中不同的生物標志物均發(fā)揮著相應(yīng)的作用,骨代謝的動態(tài)情況可通過骨代謝生物標志物反映,而circRNA被研究發(fā)現(xiàn)在OP早期診斷中發(fā)揮著潛在作用。

骨形成和骨吸收是骨代謝的基本活動,骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡是維持骨量和骨穩(wěn)定性的基礎(chǔ)[8]。成骨細胞在骨形成過程中起著關(guān)鍵作用,骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,B-ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OC)可反映成骨細胞的活性從而直接反映骨形成的狀態(tài)。同時成骨細胞所合成的I型原膠原可分解釋放Ⅰ型原膠原N末端前肽(procollagen type I amino-terminal propeptide,PINP)和Ⅰ型原膠原C末端前肽(procollagen type I carboxy-terminal propeptide,PICP)也可作為反映骨形成狀態(tài)的生物標志物。骨硬化蛋白(sclerostin) 作為成骨細胞的特異性表達蛋白可作為調(diào)控骨形成的生物標志物。骨保護素(osteoprotegerin,OPG)可抑制破骨細胞前體細胞向成熟破骨細胞分化,從而減少骨吸收增加骨形成,是一種新型骨形成標志物。

骨吸收的代謝產(chǎn)物和體現(xiàn)破骨細胞活性的物質(zhì)通常被用來作為骨吸收的生物標志物?？咕剖崴嵝粤姿崦?tartrated resistant acid phosphatse,TRAP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽( cross linked C-telopetide of collagen type I,CTX)、Ⅰ型膠原交聯(lián) N-末端肽( cross linked N-telopetide of collagen type I,NTX)、吡啶啉(pyridinoline,PYD)和脫氧吡啶啉(deoxypyridinoline,DPD)與破骨細胞活性成相關(guān),可作為反映骨吸收狀態(tài)的生物標志物。羥脯氨酸(hydroxyproline,HOP)和組織蛋白酶K(cathepsin,Cat K)作為骨吸收的代謝產(chǎn)物也可作為骨吸收的生物標志物,但HOP可來源于皮膚等其他組織,故缺乏特異性?，F(xiàn)有的這些骨代謝生物標志物(表1)多為骨代謝的生化產(chǎn)物,可從體液中檢出,具有安全、便捷、快速、經(jīng)濟的特征,但這些骨代謝生物標志物一般只能從單一角度反映骨代謝的現(xiàn)狀,僅可用于骨平衡情況的監(jiān)測,并不能直接用于骨質(zhì)疏松癥的診斷[9]。因此尋找更具特異性和靈敏度的生物標志物,在骨質(zhì)疏松癥早期診斷上發(fā)揮更大作用是今后的研究重點。

表1 骨形成與吸收的骨代謝生物標志物

2 circRNA作為骨質(zhì)疏松癥生物標志物

circRNA作為一種具有穩(wěn)定環(huán)狀結(jié)構(gòu)的ncRNA,穩(wěn)定存在于血液及各類體液中,可在基因?qū)用嬲{(diào)控骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展,因此其具備了成為骨質(zhì)疏松癥早期診斷生物標志物的潛能[10]。

2.1 circRNA的生物學(xué)特性及功能

作為目前非編碼RNA領(lǐng)域研究的熱點,circRNA可在多種生物體中表達,具有穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu),可防止外切核酸酶介導(dǎo)進行降解,使其成為疾病中特殊的分子標記物[11-13]。研究表明,circRNA可通過不同的機制在疾病的發(fā)生、發(fā)展及演變過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[14-17]。目前已有大量相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)circRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展和治療中起著重要作用,可作為疾病診斷及判斷預(yù)后重要的生物標志物,也可作為治療的分子靶標,具有非常重要的研究意義及臨床應(yīng)用價值[18-20]。

2.2 circRNA調(diào)節(jié)成骨細胞與骨形成

成骨細胞作為骨形成過程中的重要細胞,可通過骨礦化、分泌生物活性因子及參與骨基質(zhì)合成等多方面調(diào)控骨形成過程。對于成骨細胞分化活動,Qian等[21]通過使用RNA測序技術(shù)檢測BMP-2誘導(dǎo)鼠成骨細胞分化過程中circRNA的差異性表達發(fā)現(xiàn),circ_19142、circ_5846 和circ_10042在高分化的成骨細胞中表達水平顯著升高。并通過實驗發(fā)現(xiàn)BMP2通過circ_19142/circ_5846 靶向 miRNA-mRNA 軸誘導(dǎo)MC3T3-E1細胞成骨分化。而Huang等[22]在研究YAP1促進BMSCs和MC3T3-E1的成骨分化的機制中發(fā)現(xiàn),circ_0024097可通過miR-376b-3p/YAP1軸和Wnt/β-catenin通路促進BMSCs和MC3T3-E1成骨分化以促進骨形成。對于成骨分化相關(guān)生長因子方面的研究,骨橋蛋白( osteopontin,OPN)和膠原蛋白α-1(COL15A1)可調(diào)節(jié) MC3T3-E1和MDPC23細胞的分化和礦化,而經(jīng)驗證這一過程是circ_003795通過miR-1249-5p/COL15A1軸實現(xiàn)的[23]。也有實驗研究表明,沉默circ_ 009056可以增加miR-22-3p的表達,并降低BMP7、Runx2 的表達水平[24]。因此circ_009056可作為miR-22-3p的海綿,調(diào)節(jié)降鈣素基因相關(guān)肽誘導(dǎo)的細胞成骨過程。關(guān)于circ_0062582國內(nèi)學(xué)者研究有著不同的研究發(fā)現(xiàn),Li等[25]研究得出circ_0062582可通過靶向miR-145/CBFB軸來促進BMSCs的成骨分化,并上調(diào)OSX、OCN和COL1等成骨分化相關(guān)蛋白的水平;而Chen等[26]則研究發(fā)現(xiàn)circ_0062582也可通過海綿化miR-197-3p上調(diào)Smad5的表達,從而促進BMSCs增殖和成骨分化。通過不同方法對不同種類的成骨細胞進行研究分析發(fā)現(xiàn),circRNA可反映成骨細胞在不同骨形成階段對于分化、增殖等多方面的調(diào)控作用。

2.3 circRNA調(diào)節(jié)破骨細胞與骨吸收

隨著人們對circRNA研究不斷的深入,越來越多的研究表明circRNA通過不同機制參與破骨細胞的成熟、分化、凋亡等過程。關(guān)于破骨細胞的增殖,Miao等[27]發(fā)現(xiàn)circRNA_009934作為miR-5107的ceRNA,調(diào)節(jié)其下游TRAF6靶基因的表達,促進破骨細胞的生成。在破骨細胞的分化研究中,Chen等[28]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)骨髓單核細胞巨噬細胞 (BMM) 分化中circ_28313的差異化表達,同時生物信息學(xué)分析表明circ_28313、miR-195a和CSF1形成一個ceRNA網(wǎng)絡(luò),circ_28313通過miR-195a 間接調(diào)控靶基因CSF1的表達,從而調(diào)節(jié)BMM細胞向破骨細胞分化。而Liu等[29]通過生物信息學(xué)分析和熒光素酶報告揭示了circ_Hmbox1/miR-1247-5p/Bcl6的相互作用的機制。circ_Hmbox1主要通過與miR-1247-5p結(jié)合來抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化,miR-1247-5p可靶向bcl6調(diào)控破骨細胞分化和成骨細胞分化,以參與骨代謝的調(diào)節(jié)。也有學(xué)者通過分析絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者中不同表達水平的circRNA發(fā)現(xiàn)circ_0007059在骨質(zhì)疏松癥患者和人骨髓基質(zhì)細胞破骨分化過程中表達上調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)circ_0007059可通過miR-378/BMP-2軸在破骨細胞形成中發(fā)揮重要作用,circ_0007059過表達可抑制BMSCs向破骨細胞的分化[30]。

3 circRNA與骨質(zhì)疏松癥的早期診斷

目前,骨質(zhì)疏松癥的診斷仍是以骨密度作為主要指標,但由于其檢測具有局限性及不便性,往往不能對骨質(zhì)疏松癥進行早期診斷。circRNA可穩(wěn)定并廣泛存在于人體的體液、血液及其他組織標本中,且在不同時期、不同組織的表達水平不同,具有時序性和組織特異性,使得circRNA成為現(xiàn)階段研究的熱點[31]。大量臨床及實驗研究證實circRNA在骨質(zhì)疏松癥患者的外周血、骨髓干細胞或骨組織中表達均存在顯著差異,因而circRNA具備作為早期診斷生物標志物的潛能。

3.1 血清及血漿中的circRNA

血清及血漿作為血液的重要組成部分,含有多種蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)、維生素、無機物、核酸衍生物等分子成分,作為常用的臨床檢驗檢測標本,具有獲取簡便、質(zhì)量穩(wěn)定等特點,近年來也廣泛用于circRNA的研究。Yao等[32]對20例合并有椎體壓縮性骨折的骨質(zhì)疏松癥患者的血清進行circRNA測序,共檢測出884個差異表達的 circRNA,其中上調(diào)554個,下調(diào)330個。Huang等[33]通過芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)circ_0006873和circ_0002060在老年性骨質(zhì)疏松癥患者的血清表達中顯著升高,且circ_0006873和circ_0002060的表達量與BMD和T值呈顯著相關(guān)。ROC曲線顯示circ_0002060(AUC=0.746,P<0.05,靈敏度78%,特異性69%)對骨質(zhì)疏松癥具有潛在的診斷價值,具有進一步開發(fā)作為骨質(zhì)疏松癥生物標志物的作用。Han等[34]研究發(fā)現(xiàn)circ_0076690作為骨質(zhì)疏松癥的診斷價值(ROC曲線顯示AUC = 0.829 9,P< 0.001,靈敏度為 79%,特異性為 85%)后,通過生物信息學(xué)分析和實驗驗證進一步發(fā)現(xiàn)circ_0076690可通過海綿化miR-152靶向Runx2以調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化,因此認為circ_0076690可以通過調(diào)節(jié)成骨分化影響骨代謝,從而作為骨質(zhì)疏松癥診斷的潛在生物標志物。

3.2 外周血單核細胞中的circRNA

外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)作為破骨細胞前體細胞可以被誘導(dǎo)分化為破骨樣細胞,這使得外周血單核細胞與骨質(zhì)疏松癥關(guān)系密切,且外周血循環(huán)中單核細胞的RNA表達穩(wěn)定,具備成為生物標志物的良好潛力。Guan等[35]從外周血單核細胞中探究潛在的生物標志物,通過芯片測序及qPCR驗證發(fā)現(xiàn)circ_0021739在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者外周血單核細胞中表達顯著升高,ROC分析提示(AUC=0.849,P<0.001,靈敏度100%,特異性42.9%)circ_0021739具有作為PMOP診斷生物標志物的潛能。進一步研究發(fā)現(xiàn)circ_0021739可靶向miR-502-5p以調(diào)控破骨細胞生成,為開發(fā)骨質(zhì)疏松癥的早期預(yù)防和診斷方法提供了新的途徑。Zhao等[36]用同樣的方法對58例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者及41例絕經(jīng)后老年健康對照組志愿者的外周血單核細胞進行研究發(fā)現(xiàn),circ_0001275存在差異性表達,其表達量與T值呈負相關(guān),ROC曲線顯示circ_0001275具有顯著的診斷價值(AUC=0.759,P<0.001),所以circ_0001275可作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在生物標志物。

3.3 血清外泌體中的circRNA

外泌體(eosomes)是直徑在30～150 nm的盤狀囊泡,攜帶有大量生物學(xué)信息如蛋白質(zhì)、核酸及轉(zhuǎn)錄因子等,在進入靶細胞后可以對細胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。此外,外泌體的脂質(zhì)雙層可以保護RNAs不被核糖核酸酶降解,從而保留它們的功能活性,有利于標志物樣本的采集和儲存。Zhi等[37]在對以血清外泌體為檢測標本的一項對照研究中發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松癥患者外泌體中的circ_0006859上調(diào),ROC曲線分析表明,circ_0006859可將骨質(zhì)疏松癥患者與健康對照組區(qū)分開(AUC=0.897 4,P< 0.000 1,靈敏度93.1%,特異性93.33%),進一步生物信息學(xué)和實驗探究發(fā)現(xiàn)circ_0006859可通過海綿化miR-431-5p上調(diào)ROCK1抑制骨生成并促進脂肪生成,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生。且對患者進行9個月的抗骨質(zhì)疏松治療后,血清外泌體中circ_0006859的表達水平也顯著下調(diào),這進一步驗證了circ_0006859作為骨質(zhì)疏松癥生物標志物的巨大潛力。

3.4 骨髓間充質(zhì)干細胞及骨組織中的circRNA

骨髓間充質(zhì)干細胞作為骨代謝過程的重要細胞,可促進骨修復(fù)和促進骨發(fā)育,與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展也有密切關(guān)系。骨髓間充質(zhì)干細胞中的circRNA不少都可作為治療骨質(zhì)疏松癥的潛在新靶點。在對骨質(zhì)疏松癥患者BMSCs進行研究上,Qiao等[38]發(fā)現(xiàn)circ_0048211的表達與miR-93-5p呈負相關(guān),與BMP2呈正相關(guān)。circ_0048211可負向靶向miR-93-5p以上調(diào)BMP2,以減緩絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的進展。Wen等[39]通過對骨質(zhì)疏松癥患者的骨組織標本進行研究發(fā)現(xiàn)circ_0076906通過海綿化miR-1305上調(diào)OGN的表達以促進BMSCs的成骨分化,減緩骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。Long等[40]研究發(fā)現(xiàn)circ_0016624可通過海綿化miR-98,增強BMP-2的表達,加強成骨誘導(dǎo)因子的生成從而改善骨代謝預(yù)防骨質(zhì)疏松癥發(fā)生。同時Liu等[41]研究證明circ_0007059可直接靶向miR-378,而miR-378又靶向BMP-2,circ_0007059過表達可抑制BMSCs向破骨細胞的分化,因而靶向circ_0007059/miR-378/BMP-2軸可能是治療骨質(zhì)疏松的新思路。Ji等[42]研究新發(fā)現(xiàn)circ_0006215 通過競爭性結(jié)合miRNA-942-5p可調(diào)節(jié)BMSCs中RUNX2和VEGF的表達,以促進成骨分化及血管新生。同時體內(nèi)實驗又通過敲低和過表達circ_0006215在皮質(zhì)骨缺損模型驗證了其骨修復(fù)的作用,所以circ_0006215具有成為治療老年性骨質(zhì)疏松癥的新靶點的巨大潛能。見表2。

表2 不同樣本中circRNA作為骨質(zhì)疏松癥生物標志物的機制和潛能

4 總結(jié)與展望

綜上所述,眾多circRNA已被證實可通過多種機制參與骨代謝的調(diào)節(jié),并影響成骨細胞、破骨細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖、分化及凋亡,調(diào)控骨形成與骨吸收過程。circRNA由于其特殊的穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu),且具備時空特異性和組織細胞特異性等特征,可在血清、細胞、外泌體、組織等中穩(wěn)定表達,已逐漸顯現(xiàn)出了成為骨質(zhì)疏松癥診斷生物標志物的出色潛能。

目前對于circRNA作為骨質(zhì)疏松癥生物標志物的研究,大多通過微陣列或circRNA測序技術(shù)分析篩選臨床樣本中差異化表達的circRNA,并與骨質(zhì)疏松癥臨床特征相關(guān)聯(lián),通過ROC分析曲線篩選具備生物標志物潛能的候選circRNA。后續(xù)根據(jù)實驗驗證circRNA 作為生物標志物的可靠性和靈敏度,同時生物信息學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究也可分析論證其在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展中的作用機制。但就目前已有的研究報道,circRNA大多通過形成circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)引起骨代謝調(diào)控失常,從而影響骨質(zhì)疏松癥的疾病進展,但其精確的作用靶標往往難以尋找。相信隨著生物信息學(xué)技術(shù)及基因測序技術(shù)的發(fā)展,骨質(zhì)疏松癥中有關(guān)circRNA作為診斷標志物的研究也將更加深入。

作為生物標志物,必須有性質(zhì)穩(wěn)定、重復(fù)性好、采集方便、便于重復(fù)檢測動態(tài)觀察其表達水平等特質(zhì)?，F(xiàn)有研究中,相同來源的不同組織樣本作為研究對象往往會得出不同的研究結(jié)果。因此,樣本的來源和處理、保存、測定方法便顯得尤為重要。血清、外周血單核細胞及血清外泌體作為標本均具有上述優(yōu)勢,后續(xù)的保存加工也相對簡單。如何從這幾類樣本中選取合適的類別作為骨質(zhì)疏松癥早期診斷生物標志物也是亟需關(guān)注的問題。

同時,由于現(xiàn)有研究的樣本量往往較少,研究結(jié)論差異性較大。未來隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)、影像組學(xué)的不斷發(fā)展,可以嘗試進行多種生物診斷標志物的聯(lián)合應(yīng)用,如體液標志物和影像標志物的聯(lián)合。另外可通過進行多中心大樣本量的人群研究,對具有巨大生物標志物潛力的circRNA進行進一步的體內(nèi)實驗驗證及隨訪觀察,以實現(xiàn)circRNA作為診斷生物標志物在骨質(zhì)疏松癥中的臨床應(yīng)用,為骨質(zhì)疏松癥的早期診斷提供有效手段。