阮紅良 佘冬梅 孫紹裘 陳振華

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨傷科,湖南 長(zhǎng)沙 410005

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一種多發(fā)于中老年女性的慢性全身代謝性疾病,起病隱匿,無(wú)特異性癥狀[1]。其發(fā)病機(jī)制主要是由于絕經(jīng)后雌激素及褪黑激素等缺乏,致使骨代謝失衡骨量減少,骨小梁微結(jié)構(gòu)破壞[2-3]。既往研究表明,20%的女性患有PMOP,其中10%的女性有不同部位的骨折,骨質(zhì)疏松性骨折嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[4]。因此,開(kāi)展PMOP臨床與基礎(chǔ)研究,早期診斷和治療對(duì)于預(yù)防骨質(zhì)疏松骨折至關(guān)重要。中醫(yī)論治PMOP多屬于腎陰虛證,補(bǔ)腎中藥能較好地治療PMOP。有文獻(xiàn)報(bào)道,六味地黃丸能提高患者骨密度,改善臨床癥狀。其臨床療效與絕經(jīng)后腎氣漸虛,腎陰陽(yáng)失調(diào),人體免疫機(jī)能失調(diào)有關(guān)[5-6]。目前六味地黃丸治療PMOP腎陰虛證作用的分子基礎(chǔ)尚不十分清楚,需進(jìn)一步探討。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),多種表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄因子表觀參與PMOP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程并起著重要調(diào)控作用[7-8]。溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(BRD4)是表觀調(diào)控蛋白BET家族成員[9]。研究發(fā)現(xiàn),BRD4是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,其可以與乙?；旧|(zhì)結(jié)合,參與細(xì)胞分裂循環(huán)過(guò)程中的基因穩(wěn)定表達(dá),在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中BRD4也發(fā)揮重要作用[10-11]。鑒于BRD4的重要作用使其成為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的新興治療靶點(diǎn)。本研究通過(guò)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型探討B(tài)RD4表達(dá)與PMOP關(guān)系及六味地黃丸干預(yù),旨在為中西醫(yī)防治PMOP提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雌性SD大鼠60只,6～8月齡,購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物科技有限公司動(dòng)物中心,動(dòng)物合格使用許可證號(hào):SYXK(河北省)2021-006。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批同意實(shí)施(202104100009)。

1.1.2主要儀器:Discovery A型骨密度測(cè)試儀(Holigic公司),YLS-16A型小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測(cè)定儀(濟(jì)南益延公司)。

1.1.3主要試劑:六味地黃丸購(gòu)自北京同仁堂(國(guó)藥準(zhǔn)字ZI9993068),阿侖膦酸鈉片購(gòu)自Merck公司(A4978)。BRD4抗體購(gòu)自Abcam公司(ab289886)。β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司(ab8227);蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自杭州碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型制備、分組和給藥:參照文獻(xiàn)[12]報(bào)道摘除雙側(cè)卵巢,建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型。腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg),無(wú)菌條件下腹部正中切口進(jìn)腹,絲線結(jié)扎卵巢并摘除?？p合切口前腹腔內(nèi)注入萬(wàn)古霉素10萬(wàn)單位。手術(shù)后大鼠常規(guī)單獨(dú)飼養(yǎng),自由飲水和進(jìn)食。術(shù)后2周實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷口完全愈合后合籠,灌胃給藥,分為假手術(shù)組、模型組(生理鹽水,10 mL/kg)、中藥組(六味地黃丸385.7 mg/kg)、西藥組(阿侖膦酸鈉0.893 mg/kg)。觀察大鼠體重、毛發(fā)色澤、飲水量、自主活動(dòng)次數(shù)、易激惹表型等。

1.2.2骨密度和骨生物力學(xué)測(cè)定:完整分離雙側(cè)股骨,標(biāo)本放置于骨密度測(cè)試儀平臺(tái)上,分析檢測(cè)整體股骨的骨密度(g/cm2)。同時(shí),通過(guò)小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測(cè)定儀,參照文獻(xiàn)[13]報(bào)道采用三點(diǎn)彎曲法測(cè)量骨骼強(qiáng)度。

1.2.3骨組織結(jié)構(gòu)觀察:用藥療程結(jié)束后,取各組大鼠雙側(cè)股骨組織標(biāo)本,4%多聚甲醛固定24 h,用10% EDTA脫鈣液(pH值8.0)脫鈣15 d后石蠟包埋。切片厚4 μm脫蠟,蘇木素-伊紅(HE)染色30 s,1%濃度鹽酸酒精分化后伊紅復(fù)染。

1.2.4BRD4蛋白表達(dá)水平檢測(cè):稱取雙側(cè)股骨組織約50 mg,用含蛋白酶抑制劑的蛋白提取試劑盒制備蛋白。在10% SDS-PAGE分離膠中進(jìn)行電泳,然后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含0.05% Tween-20和5%脫脂牛奶的Tris緩沖液封閉膜,與一抗4 ℃孵育過(guò)夜。一抗BRD4工作濃度為1∶500,內(nèi)參抗體工作濃度β-actin為1∶2 000,與HRP偶聯(lián)的二抗孵育,用PBS洗滌膜后,加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑在暗室曝光洗片。底片掃描用Image J軟件分析灰度值。

1.2.5PMOP中醫(yī)證型生物信息學(xué)分析:PMOP相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE56116從Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)下載并用于獲得BRD4信使RNA(mRNA)的差異表達(dá)。應(yīng)用KEGG通路富集分析和GO富集分析預(yù)測(cè)差異表達(dá)的BRD4 mRNA的相關(guān)功能。GSE56116數(shù)據(jù)集按中醫(yī)證型將共納入10例PMOP患者,分為3組,腎陰虛者4例,腎陽(yáng)虛者3例,非腎虛者3例[14-15]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組間比較采用單因素方差分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組骨密度、骨強(qiáng)度和骨組織結(jié)構(gòu)的變化

造模12周后,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠股骨骨密度明顯降低(表1);與模型組比較,中藥組和西藥組均能有效提高模型組大鼠骨密度和骨強(qiáng)度(表1),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中藥組與西藥組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠股骨干組織HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠骨膜完整,骨小梁致密且寬;與假手術(shù)組比較,模型組骨小梁稀少且窄,小梁間距加大;中藥組和西藥組治療后的大鼠則觀察骨小梁明顯增加,與模型組大鼠比較(圖1),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠骨密度、骨組織強(qiáng)度情況

圖1 各組大鼠骨組織HE染色情況

2.2 各組大鼠骨組織中BRD4蛋白表達(dá)的變化

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組BRD4蛋白表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,中藥和西藥干預(yù)后,BRD4蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。中藥組與西藥組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 各組大鼠骨組織BRD4蛋白表達(dá)情況

2.3 BRD4 mRNA表達(dá)與PMOP腎虛分型的分析

將GSE56116測(cè)序數(shù)據(jù)分為PMOP腎陰虛、腎陽(yáng)虛、非腎虛3組,比較BRD4轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果顯示(圖3A),腎陰虛組BRD4 mRNA表達(dá)明顯高于腎陽(yáng)虛組和非腎虛組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。為進(jìn)一步研究BRD4在PMOP中的分子作用基礎(chǔ),將PMOP分為BRD4 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組(圖3B)。結(jié)果顯示,BRD4 mRNA高表達(dá)涉及RHCE、WASF3、LTBP1、SVIP、STMP1等基因表達(dá)改變;BRD4 mRNA低表達(dá)涉及PCP4、CPN1和ARHGEF35等基因表達(dá)改變。提示BRD4 mRNA在腎陰虛P(yáng)MOP中上調(diào)累積系列基因表達(dá)事件。

圖3 BRD4 mRNA差異表達(dá)分析

2.4 BRD4表達(dá)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路及功能的預(yù)測(cè)分析

使用GSE56116數(shù)據(jù)對(duì)BRD4及其相互分子進(jìn)行KEGG通路分析和GO功能富集分析。KEGG通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖4A),BRD4表達(dá)上調(diào)涉及5-羥色胺能神經(jīng)突觸、血小板活性、神經(jīng)配體受體反應(yīng)以及鈣離子信號(hào)通路;BRD4表達(dá)下調(diào)涉及細(xì)胞因子相互作用、JAK-STAT信號(hào)通路。GO富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖4B),BRD4表達(dá)上調(diào)涉及第二信使介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、出凝血信號(hào)通路;BRD4表達(dá)下調(diào)涉及離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)軸突導(dǎo)航等。提示BRD4表達(dá)在PMOP局部骨微環(huán)境中起重要調(diào)控作用。

圖4 PMOP中BRD4表達(dá)的富集分析

3 討論

盡管六味地黃丸治療PMOP臨床療效取得肯定,但其作用于PMOP多成分、多靶點(diǎn)間的相互關(guān)系及作用機(jī)制仍有待深入研究[16]。中醫(yī)對(duì)PMOP的病因病機(jī)、治則治法的認(rèn)識(shí)均認(rèn)為腎虛為發(fā)病的關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明,六味地黃丸干預(yù)PMOP動(dòng)物模型,可下調(diào)表觀調(diào)控分子BRD4蛋白表達(dá)水平;提示六味地黃丸治療PMOP和BRD4蛋白表達(dá)下調(diào)可能存在內(nèi)在聯(lián)系。公共數(shù)據(jù)庫(kù)中BRD4基因表達(dá)與PMOP中醫(yī)腎虛癥候的相關(guān)性結(jié)果提示,BRD4基因表達(dá)與腎陰虛型PMOP密切相關(guān)。

最近的表觀基因組研究發(fā)現(xiàn),BET蛋白(BRD2、BRD3、BRD4和睪丸特異性BRDT)充當(dāng)表觀遺傳調(diào)控閱讀器,主要識(shí)別組蛋白尾部的乙酰化賴氨酸以調(diào)節(jié)染色質(zhì)可塑性。研究表明,BRD4的抑制因子JQ1參與PMOP破骨細(xì)胞分化和病理性骨丟失的調(diào)控。破骨細(xì)胞的分化和形成依賴于巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)的激活[10]。RANKL與核因子κB受體活化因子(RANK)的結(jié)合會(huì)誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)的募集,從而刺激破骨細(xì)胞生成所需的下游MAPK和NF-κB信號(hào)通路。此外,BRD4可讀取組蛋白的乙酰賴氨酸,從而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)以確定干細(xì)胞命運(yùn)和脂肪形成。敲除BRD4表達(dá)顯著減輕糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的對(duì)H3K9ac結(jié)合Runx2啟動(dòng)子的抑制、提高骨鈣素和Runx2的表達(dá)、礦化基質(zhì)堆積[11]。一般而言,表觀遺傳調(diào)控機(jī)制特別是DNA甲基化,可調(diào)節(jié)多種疾病的基因表達(dá),包括與骨代謝有關(guān)的關(guān)鍵基因。本研究發(fā)現(xiàn),腎陰虛組BRD4 mRNA表達(dá)明顯高于腎陽(yáng)虛組和非腎虛組,BRD4 mRNA高表達(dá)涉及RHCE、WASF3、LTBP1、SVIP、STMP1等基因表達(dá)改變;BRD4 mRNA低表達(dá)涉及PCP4、CPN1和ARHGEF35等基因表達(dá)改變。但是,BRD4是否與這些基因的互作參與腎陰虛型PMOP有待后續(xù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。

綜上所述,BRD4是腎陰虛型PMOP相關(guān)基因,其過(guò)表達(dá)可預(yù)測(cè)六味地黃丸療效。BRD4調(diào)控的RANKL/MAPK/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能參與PMOP的發(fā)生發(fā)展,BRD4有望成為PMOP的潛在治療靶點(diǎn)。