謝麗華 李生強(qiáng) 陳娟 葉云金 黃景文 陳玄 陳賽楠 葛繼榮*

1.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)研究室,福建 福州 350003 2.福建省中西醫(yī)結(jié)合防治骨質(zhì)疏松重點實驗室(福建省中醫(yī)藥科學(xué)院、福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院),福建 福州 350003

人心肌營養(yǎng)素樣細(xì)胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1,CLCF1)是糖蛋白(gp)130細(xì)胞因子家族的成員,位于11號染色體11q13.2位置,CLCF1是一種有效的神經(jīng)營養(yǎng)因子,B淋巴細(xì)胞催化劑,能促進(jìn)B細(xì)胞增殖[1-2]。課題組前期以絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)為研究對象,通過芯片、臨床驗證及體外過表達(dá)實驗證實,CLCF1是PMOP腎陰虛證的關(guān)聯(lián)基因,CLCF1可通過調(diào)控JAK2/STAT3蛋白、磷酸化水平,達(dá)到調(diào)控骨代謝的目的[3]。CLCF1 mRNA和蛋白在PMOP腎陰虛證患者中表達(dá)下調(diào)[4-5],但是具體下調(diào)機(jī)制尚未清楚?；虻谋磉_(dá)調(diào)控可在多個層次上進(jìn)行,其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是非常重要的環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)錄失調(diào)是發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵,轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是極具潛力的治療作用靶點[6]。因此研究基因的轉(zhuǎn)錄因子具有重要的意義。

本實驗通過DNA pulldown技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的方法檢測對CLCF1啟動子區(qū)域相互作用的蛋白進(jìn)行分析,并使用平行反應(yīng)監(jiān)視(parallel reaction monitoring,PRM)技術(shù)靶向驗證轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。旨在篩選出與CLCF1基因啟動子區(qū)相互作用的轉(zhuǎn)錄因子,對于揭示CLCF1基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制具有重要的科學(xué)價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株:MG-63成骨樣細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑:MEMα培養(yǎng)基(11900073,Thermofisher),胎牛血清(10100147,Thermofisher),PCR擴(kuò)增試劑盒(R011,Takara),DNA回收試劑盒(DP209,天根生化),Protease Inhibitor Cocktail(K1007,Apexbio),Trypsin(VA9000,Promega),甲酸(CAEQ-4-000306-4000,CNW Technologies),乙腈(CAEQ-4-000308-4000,CNW Technologies),引物(上海生工生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):復(fù)蘇細(xì)胞,將MG-63細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的MEMα培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2 d后細(xì)胞融合度為80%,進(jìn)行傳代。

1.2.2DNA pulldown實驗:分為實驗組和對照組。根據(jù)CLCF1堿基序列,設(shè)計并合成生物素標(biāo)記的探針為實驗組,非特異性探針作為對照組。從培養(yǎng)好的MG-63細(xì)胞沉淀中提取核蛋白。將蛋白與DNA、磁珠孵育過夜,形成蛋白-DNA-磁珠復(fù)合物。加入磁珠以及核酸酶,使之消化DNA并被磁珠吸附,得到目的蛋白。將蛋白酶解成肽段,洗脫、真空干燥后,分成兩份,一份用于質(zhì)譜鑒定,另一份用于PRM檢測。

1.2.3質(zhì)譜鑒定及分析:每個樣品取5 μL通過nano-UPLC液相系統(tǒng)分離后,在線質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。LC-MS/MS使用的數(shù)據(jù)庫:MaxQuant(version 1.6.1.0)。蛋白數(shù)據(jù)庫:UNIPROT_Human_2020_06;定量方式為MS1定量。多肽和蛋白水平FDR均控制在0.01;用于定量的多肽僅包括Unique,可變修飾的多肽不用于定量;同時進(jìn)行iBAQ非標(biāo)定量。

1.2.4PRM驗證差異轉(zhuǎn)錄因子:多肽經(jīng)nano-UPLC液相系統(tǒng)進(jìn)行分離,在線質(zhì)譜儀(Q-Exactive)進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用反相色譜柱(Reprosil-Pur 120 C18-AQ,1.9 μm,Dr.Math)分析。質(zhì)譜分析時長:120 min/sample,采用正離子檢測模式。PRM采集方式為:MS2在m/z @200時分辨率為17500,AGC為5E+4,最大離子注入時間 (Max IT) 200 ms。標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量(NCE)為27%,隔離窗口為2.0 m/z。將所采集的PRM數(shù)據(jù)導(dǎo)入Skyline進(jìn)行transition提取。Method match tolerance:0.005 m/z;MS2在m/z@200時分辨率為17500。

1.2.5數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析:數(shù)據(jù)處理方法參照文獻(xiàn)[7],篩選條件為FCa值>log2(1.5),同時滿足unique peptide≥2。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進(jìn)行 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,P<0.05作為富集結(jié)果的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 DNA pulldown實驗獲得的差異蛋白

獲得的多肽總數(shù)為14 085條,去除常見污染蛋白,獲得1 573個蛋白。根據(jù)FCa值、unique peptide數(shù),實驗組與對照組相比,存在的差異蛋白有251個,部分差異蛋白見表1。

表1 部分差異表達(dá)蛋白

2.2 差異蛋白的生物信息學(xué)分析

對實驗組和對照組篩選出的差異蛋白進(jìn)行GO、KEGG富集分析。GO包括參與的生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。圖1展示了GO、KEGG前5條條目。GO富集結(jié)果表明與CLCF1結(jié)合的蛋白主要涉及核糖體生物發(fā)生、正向調(diào)控DNA模板轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過程,包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、SWI/SNF超家族型復(fù)合物,具有與cAMP應(yīng)答元件結(jié)合、ATP水解活性等分子功能。KEGG通路顯示,與CLCF1結(jié)合的蛋白主要參與人t細(xì)胞白血病病毒1型感染、線粒體自噬、甲狀腺激素等信號通路。

圖1 差異表達(dá)蛋白GO、KEGG富集分析

2.3 PRM檢測結(jié)果

由于轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的相互作用是基因表達(dá)的關(guān)鍵,因此本次PRM實驗只驗證屬于轉(zhuǎn)錄因子的蛋白。通過UCSC數(shù)據(jù)庫查找CLCF1基因的啟動子序列,輸入PROMO數(shù)據(jù)庫,再結(jié)合JASPAR數(shù)據(jù)庫,預(yù)測CLCF1基因的轉(zhuǎn)錄因子。將預(yù)測到的轉(zhuǎn)錄因子與251個差異蛋白中屬于轉(zhuǎn)錄因子的蛋白取交集,最后選擇count數(shù)較高的50個轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行PRM驗證。圖2顯示了5個轉(zhuǎn)錄因子的PRM定量圖,MG63-CTRL為對照組,MG63-IP為實驗組,縱坐標(biāo)表示二級質(zhì)譜所有子離子的累積峰面積。從表2可以發(fā)現(xiàn),MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2這5個轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)趨勢與DNA pulldown檢測結(jié)果一致。說明MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2這5個轉(zhuǎn)錄因子可能與CLCF1基因啟動子區(qū)相結(jié)合。

圖2 轉(zhuǎn)錄因子定量圖

表2 PRM驗證的結(jié)果

3 討論

相關(guān)統(tǒng)計顯示,隨著人口老齡化,我國60歲以上女性骨質(zhì)疏松癥患病率為49%,男性為23%[8]。它已經(jīng)成為嚴(yán)重影響中老年人群健康的慢病之一。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)CLCF1基因在絕經(jīng)后女性外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)水平可以反映骨量或骨量丟失的嚴(yán)重程度[9]。其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)CLCF1不僅影響小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[10],而且還能影響破骨細(xì)胞的分化[11]。可見研究CLCF1基因?qū)^經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有重要意義,但CLCF1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未闡明。

DNA pulldown聯(lián)合質(zhì)譜檢測方法,為研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了有力的工具。PRM是基于高分辨率、高精度的質(zhì)譜平臺,通過對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性檢測,從而實現(xiàn)對復(fù)雜樣本中的目標(biāo)蛋白質(zhì)、肽段進(jìn)行定量分析的技術(shù)[12]。它是近年新出現(xiàn)的靶向蛋白質(zhì)組定量方法,靈敏度更佳,提高通量的同時且減少對抗體的依賴性[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MG-63細(xì)胞中共篩選到251個與CLCF1基因啟動子區(qū)特異性結(jié)合的蛋白,通過PRM進(jìn)一步驗證,發(fā)現(xiàn)MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2這5個蛋白表達(dá)趨勢與DNA pulldown檢測結(jié)果一致,說明MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2這5個轉(zhuǎn)錄因子可能與CLCF1基因啟動子區(qū)相結(jié)合。

MAFK屬于小Maf家族蛋白,是一種包含堿性亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子。有研究報道rs7220711差異結(jié)合MAFK轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控骨硬化蛋白SOST的表達(dá)[14]。FOSL2基因編碼亮氨酸拉鏈蛋白,屬于FOS家族。研究表明特異性敲除成骨細(xì)胞FOSL2基因的小鼠骨量、骨鈣素水平降低,但脂聯(lián)素水平升高[15]。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)FOSL2主要通過激活Wnt16促進(jìn)骨形成并抑制骨吸收[16]。JUNB也是一種包含堿性亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子,與FOS家族成員二聚化,形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1。Zhang等[17]通過整合GEO數(shù)據(jù)庫骨質(zhì)疏松芯片數(shù)據(jù)集,發(fā)現(xiàn)與低骨密度骨質(zhì)疏松人群相比,JUNB基因在高骨密度人群中表達(dá)水平比較高。Wang等[18]用熒光定量PCR實驗證實,骨質(zhì)疏松患者外周血中JUNB基因表達(dá)水平顯著高于低于正常組。機(jī)制實驗表明JUNB參與成肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化,并有助于骨質(zhì)疏松后的骨修復(fù)[19]。

MITF是一種含螺旋-環(huán)-螺旋和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。MITF基因是破骨細(xì)胞形成后期的關(guān)鍵調(diào)控因子,位于M-CSF和RANKL信號通路的下游,這對破骨細(xì)胞增殖、分化和功能至關(guān)重要[20]。TFE3是免疫球蛋白重鏈增強(qiáng)子3,MiTF/TFE家族成員之一,與MiTF有著密切的同源性。TFE3基因參與破骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化等生理過程,促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟和融合[21]。在破骨細(xì)胞中,TFE3可以調(diào)節(jié)TRAP、組織蛋白酶K等破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)[22]。當(dāng)TFE3和MITF同時敲除時,大鼠會出現(xiàn)嚴(yán)重的骨硬化癥,但是只敲除單個基因時并不出現(xiàn)此表型[23]。所有這些研究表明,以上5個轉(zhuǎn)錄因子很可能通過調(diào)控CLCF1基因影響骨代謝,但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究在DNA pulldown技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的基礎(chǔ)上,通過PRM技術(shù)初步篩選到MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2這5個轉(zhuǎn)錄因子,下一步需要熒光素酶報告基因?qū)嶒炓约叭旧|(zhì)免疫共沉淀實驗進(jìn)一步驗證轉(zhuǎn)錄因子與靶基因CLCF1的關(guān)系。本研究為進(jìn)一步研究CLCF1表達(dá)調(diào)控的機(jī)制提供實驗依據(jù)和研究方向,并可能為骨質(zhì)疏松治療提供治療作用靶點。