謝麗華 李生強 陳娟 葉云金 黃景文 陳玄 陳賽楠 葛繼榮*

1.福建省中醫(yī)藥科學院骨質(zhì)疏松證候基因組學研究室,福建 福州 350003 2.福建省中西醫(yī)結合防治骨質(zhì)疏松重點實驗室(福建省中醫(yī)藥科學院、福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院),福建 福州 350003

人心肌營養(yǎng)素樣細胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1,CLCF1)是糖蛋白(gp)130細胞因子家族的成員,位于11號染色體11q13.2位置,CLCF1是一種有效的神經(jīng)營養(yǎng)因子,B淋巴細胞催化劑,能促進B細胞增殖[1-2]。課題組前期以絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)為研究對象,通過芯片、臨床驗證及體外過表達實驗證實,CLCF1是PMOP腎陰虛證的關聯(lián)基因,CLCF1可通過調(diào)控JAK2/STAT3蛋白、磷酸化水平,達到調(diào)控骨代謝的目的[3]。CLCF1 mRNA和蛋白在PMOP腎陰虛證患者中表達下調(diào)[4-5],但是具體下調(diào)機制尚未清楚?；虻谋磉_調(diào)控可在多個層次上進行,其中轉錄水平的調(diào)控是非常重要的環(huán)節(jié)。轉錄失調(diào)是發(fā)病機制的關鍵,轉錄因子被認為是極具潛力的治療作用靶點[6]。因此研究基因的轉錄因子具有重要的意義。

本實驗通過DNA pulldown技術聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的方法檢測對CLCF1啟動子區(qū)域相互作用的蛋白進行分析,并使用平行反應監(jiān)視(parallel reaction monitoring,PRM)技術靶向驗證轉錄因子的表達情況。旨在篩選出與CLCF1基因啟動子區(qū)相互作用的轉錄因子,對于揭示CLCF1基因表達調(diào)控的分子機制具有重要的科學價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株:MG-63成骨樣細胞株購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2主要試劑:MEMα培養(yǎng)基(11900073,Thermofisher),胎牛血清(10100147,Thermofisher),PCR擴增試劑盒(R011,Takara),DNA回收試劑盒(DP209,天根生化),Protease Inhibitor Cocktail(K1007,Apexbio),Trypsin(VA9000,Promega),甲酸(CAEQ-4-000306-4000,CNW Technologies),乙腈(CAEQ-4-000308-4000,CNW Technologies),引物(上海生工生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng):復蘇細胞,將MG-63細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的MEMα培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2 d后細胞融合度為80%,進行傳代。

1.2.2DNA pulldown實驗:分為實驗組和對照組。根據(jù)CLCF1堿基序列,設計并合成生物素標記的探針為實驗組,非特異性探針作為對照組。從培養(yǎng)好的MG-63細胞沉淀中提取核蛋白。將蛋白與DNA、磁珠孵育過夜,形成蛋白-DNA-磁珠復合物。加入磁珠以及核酸酶,使之消化DNA并被磁珠吸附,得到目的蛋白。將蛋白酶解成肽段,洗脫、真空干燥后,分成兩份,一份用于質(zhì)譜鑒定,另一份用于PRM檢測。

1.2.3質(zhì)譜鑒定及分析:每個樣品取5 μL通過nano-UPLC液相系統(tǒng)分離后,在線質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。LC-MS/MS使用的數(shù)據(jù)庫:MaxQuant(version 1.6.1.0)。蛋白數(shù)據(jù)庫:UNIPROT_Human_2020_06;定量方式為MS1定量。多肽和蛋白水平FDR均控制在0.01;用于定量的多肽僅包括Unique,可變修飾的多肽不用于定量;同時進行iBAQ非標定量。

1.2.4PRM驗證差異轉錄因子:多肽經(jīng)nano-UPLC液相系統(tǒng)進行分離,在線質(zhì)譜儀(Q-Exactive)進行質(zhì)譜分析。采用反相色譜柱(Reprosil-Pur 120 C18-AQ,1.9 μm,Dr.Math)分析。質(zhì)譜分析時長:120 min/sample,采用正離子檢測模式。PRM采集方式為:MS2在m/z @200時分辨率為17500,AGC為5E+4,最大離子注入時間 (Max IT) 200 ms。標準化碰撞能量(NCE)為27%,隔離窗口為2.0 m/z。將所采集的PRM數(shù)據(jù)導入Skyline進行transition提取。Method match tolerance:0.005 m/z;MS2在m/z@200時分辨率為17500。

1.2.5數(shù)據(jù)處理和生物信息學分析:數(shù)據(jù)處理方法參照文獻[7],篩選條件為FCa值>log2(1.5),同時滿足unique peptide≥2。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,P<0.05作為富集結果的篩選標準。

2 結果

2.1 DNA pulldown實驗獲得的差異蛋白

獲得的多肽總數(shù)為14 085條,去除常見污染蛋白,獲得1 573個蛋白。根據(jù)FCa值、unique peptide數(shù),實驗組與對照組相比,存在的差異蛋白有251個,部分差異蛋白見表1。

表1 部分差異表達蛋白

2.2 差異蛋白的生物信息學分析

對實驗組和對照組篩選出的差異蛋白進行GO、KEGG富集分析。GO包括參與的生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。圖1展示了GO、KEGG前5條條目。GO富集結果表明與CLCF1結合的蛋白主要涉及核糖體生物發(fā)生、正向調(diào)控DNA模板轉錄等生物學過程,包含轉錄調(diào)節(jié)復合物、SWI/SNF超家族型復合物,具有與cAMP應答元件結合、ATP水解活性等分子功能。KEGG通路顯示,與CLCF1結合的蛋白主要參與人t細胞白血病病毒1型感染、線粒體自噬、甲狀腺激素等信號通路。

圖1 差異表達蛋白GO、KEGG富集分析

2.3 PRM檢測結果

由于轉錄因子與啟動子的相互作用是基因表達的關鍵,因此本次PRM實驗只驗證屬于轉錄因子的蛋白。通過UCSC數(shù)據(jù)庫查找CLCF1基因的啟動子序列,輸入PROMO數(shù)據(jù)庫,再結合JASPAR數(shù)據(jù)庫,預測CLCF1基因的轉錄因子。將預測到的轉錄因子與251個差異蛋白中屬于轉錄因子的蛋白取交集,最后選擇count數(shù)較高的50個轉錄因子進行PRM驗證。圖2顯示了5個轉錄因子的PRM定量圖,MG63-CTRL為對照組,MG63-IP為實驗組,縱坐標表示二級質(zhì)譜所有子離子的累積峰面積。從表2可以發(fā)現(xiàn),MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2這5個轉錄因子表達趨勢與DNA pulldown檢測結果一致。說明MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2這5個轉錄因子可能與CLCF1基因啟動子區(qū)相結合。

圖2 轉錄因子定量圖

表2 PRM驗證的結果

3 討論

相關統(tǒng)計顯示,隨著人口老齡化,我國60歲以上女性骨質(zhì)疏松癥患病率為49%,男性為23%[8]。它已經(jīng)成為嚴重影響中老年人群健康的慢病之一。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)CLCF1基因在絕經(jīng)后女性外周血單個核細胞中的表達水平可以反映骨量或骨量丟失的嚴重程度[9]。其他學者發(fā)現(xiàn)CLCF1不僅影響小鼠間充質(zhì)干細胞的成骨分化[10],而且還能影響破骨細胞的分化[11]?？梢娧芯緾LCF1基因對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有重要意義,但CLCF1基因的表達調(diào)控機制尚未闡明。

DNA pulldown聯(lián)合質(zhì)譜檢測方法,為研究基因的轉錄調(diào)控提供了有力的工具。PRM是基于高分辨率、高精度的質(zhì)譜平臺,通過對目標蛋白質(zhì)進行選擇性檢測,從而實現(xiàn)對復雜樣本中的目標蛋白質(zhì)、肽段進行定量分析的技術[12]。它是近年新出現(xiàn)的靶向蛋白質(zhì)組定量方法,靈敏度更佳,提高通量的同時且減少對抗體的依賴性[13]。本研究結果發(fā)現(xiàn)在MG-63細胞中共篩選到251個與CLCF1基因啟動子區(qū)特異性結合的蛋白,通過PRM進一步驗證,發(fā)現(xiàn)MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2這5個蛋白表達趨勢與DNA pulldown檢測結果一致,說明MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2這5個轉錄因子可能與CLCF1基因啟動子區(qū)相結合。

MAFK屬于小Maf家族蛋白,是一種包含堿性亮氨酸拉鏈的轉錄因子。有研究報道rs7220711差異結合MAFK轉錄因子可以調(diào)控骨硬化蛋白SOST的表達[14]。FOSL2基因編碼亮氨酸拉鏈蛋白,屬于FOS家族。研究表明特異性敲除成骨細胞FOSL2基因的小鼠骨量、骨鈣素水平降低,但脂聯(lián)素水平升高[15]。機制研究發(fā)現(xiàn)FOSL2主要通過激活Wnt16促進骨形成并抑制骨吸收[16]。JUNB也是一種包含堿性亮氨酸拉鏈的轉錄因子,與FOS家族成員二聚化,形成轉錄因子復合物AP-1。Zhang等[17]通過整合GEO數(shù)據(jù)庫骨質(zhì)疏松芯片數(shù)據(jù)集,發(fā)現(xiàn)與低骨密度骨質(zhì)疏松人群相比,JUNB基因在高骨密度人群中表達水平比較高。Wang等[18]用熒光定量PCR實驗證實,骨質(zhì)疏松患者外周血中JUNB基因表達水平顯著高于低于正常組。機制實驗表明JUNB參與成肌細胞向成骨細胞的分化,并有助于骨質(zhì)疏松后的骨修復[19]。

MITF是一種含螺旋-環(huán)-螺旋和亮氨酸拉鏈結構的轉錄因子。MITF基因是破骨細胞形成后期的關鍵調(diào)控因子,位于M-CSF和RANKL信號通路的下游,這對破骨細胞增殖、分化和功能至關重要[20]。TFE3是免疫球蛋白重鏈增強子3,MiTF/TFE家族成員之一,與MiTF有著密切的同源性。TFE3基因參與破骨細胞和巨噬細胞分化等生理過程,促進破骨細胞的成熟和融合[21]。在破骨細胞中,TFE3可以調(diào)節(jié)TRAP、組織蛋白酶K等破骨細胞相關基因的表達[22]。當TFE3和MITF同時敲除時,大鼠會出現(xiàn)嚴重的骨硬化癥,但是只敲除單個基因時并不出現(xiàn)此表型[23]。所有這些研究表明,以上5個轉錄因子很可能通過調(diào)控CLCF1基因影響骨代謝,但具體機制需進一步研究。

綜上所述,本研究在DNA pulldown技術聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的基礎上,通過PRM技術初步篩選到MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2這5個轉錄因子,下一步需要熒光素酶報告基因實驗以及染色質(zhì)免疫共沉淀實驗進一步驗證轉錄因子與靶基因CLCF1的關系。本研究為進一步研究CLCF1表達調(diào)控的機制提供實驗依據(jù)和研究方向,并可能為骨質(zhì)疏松治療提供治療作用靶點。