宋敏 李凱 王凱 范凱 海云翔 李金益 劉路

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院,甘肅 蘭州 730000 2.甘肅省中心醫(yī)院急診科,甘肅 蘭州 730050

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨轉(zhuǎn)化增多、骨量降低為特點(diǎn)的慢性骨病,病程發(fā)展上伴有骨微結(jié)構(gòu)破壞及骨強(qiáng)度降低等病理改變,導(dǎo)致發(fā)生骨折的危險(xiǎn)性增加[1]。隨著我國社會(huì)人口老齡化的加劇,OP的防治已成為我國面臨的重要公共健康問題。

甘肅省名中醫(yī)宋敏教授擅長運(yùn)用中醫(yī)藥防治骨傷科相關(guān)疾患,宋教授依據(jù)“脾腎虧虛-氣虛血瘀-髓空骨枯”核心病理機(jī)制,結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié),從整體觀念、辨證論治理念出發(fā),以益氣健脾、補(bǔ)腎壯骨、活血止痛治則,研發(fā)出固本增骨方,在長期臨床治療中療效顯著且具安全性高,前期臨床研究顯示固本增骨方能明顯增加OP患者的骨密度,并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有雌激素樣作用,可改善卵巢切除OP大鼠雌激素低下狀態(tài),調(diào)節(jié)骨代謝紊亂,預(yù)防骨量丟失[2]。

本研究在團(tuán)隊(duì)前期研究基礎(chǔ)上,通過體外培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞,觀察固本增骨方含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化及礦化的影響并探討其潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物與細(xì)胞:SPF級(jí)SD大鼠30只,雌雄各半,6周齡,體重為(200±20)g,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(甘)2020-0009。MC3T3-E1細(xì)胞株由賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司提供(貨號(hào):icell-m031),本實(shí)驗(yàn)通過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(文件批號(hào)2021-061)。

1.1.2藥物與試劑:固本增骨方藥物組成:當(dāng)歸12 g、炙黃芪30 g、熟地黃12 g、燙狗脊12 g、烏藥9 g、黨參12 g、淫羊藿9 g、補(bǔ)骨脂9 g、肉蓯蓉9 g、鹿角膠3 g、土鱉蟲9 g。由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥藥劑科提供,制成藥粉后配成1.13 g/mL混懸液。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(上海詠科生物科技有限公司,批號(hào)AS1012);磷酸化蛋白酶抑制劑(賽默飛世爾科技中國有限公司,批號(hào)AS1008);茜素紅染液(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號(hào)G1038);PD0325901(默克生命科學(xué)技術(shù)有限公司,批號(hào)EP013)。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器:酶標(biāo)檢測(cè)儀(Diatek,DR-200Bs)轉(zhuǎn)移電泳儀槽(北京市六一儀器廠,SCO6WE);臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠,TGL-16c);電泳儀(北京市六一儀器廠,DYY-6C);熒光定量PCR儀(Life technologies,QuantStudio 6)。

1.2 方法

1.2.1固本增骨方含藥血清的制備:30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為含藥血清組(20只)和空白血清組(10只),固本增骨方制成濃度為1.13 g/mL的混懸液,按照體表面積法換算(10 mL/kg藥液)后對(duì)含藥血清組大鼠按2.26 g/kg進(jìn)行灌胃,空白血清組用等體積生理鹽水灌胃,每日兩次,每次2 mL,連續(xù)灌胃7 d,最后一次給藥2 h后,用2%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉,心臟穿刺采血。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng):MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇,培養(yǎng)后重懸,將適宜密度細(xì)胞接種分瓶后在條件適宜的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:取消化重懸的MC3T3-E1細(xì)胞,以1.5×105個(gè)/mL接種于96孔板,共設(shè)立6組,每孔加100 μL,每組平行設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,分為空白血清組、5%、10%、15%、20%、25%各含藥血清組,空白血清組加入空白血清培養(yǎng)基200 μL,其余各組加入200 μL含有相應(yīng)濃度固本增骨方含藥血清的培養(yǎng)基。在對(duì)應(yīng)24、48、72 h干預(yù)時(shí)間點(diǎn)向每孔加入10 μL CCK-8溶液,培養(yǎng)箱中孵育2 h,酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處的吸光度值。

1.2.4細(xì)胞ALP活性檢測(cè):將MC3T3-E1細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以1.5×105個(gè)/mL密度接種細(xì)胞,按上述分組加入相應(yīng)培養(yǎng)基,每3 d換液1次,誘導(dǎo)7 d后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液,2000g×10 min離心,去不溶物,取上清作為樣品進(jìn)行ALP活力檢測(cè),酶標(biāo)儀檢測(cè)波長設(shè)置為520 nm。

1.2.5茜素紅染色:選取MC3T3-E1細(xì)胞,以2×105個(gè)/孔的密度于6孔板,細(xì)胞分組同上,根據(jù)各組條件干預(yù)培養(yǎng)14 d后進(jìn)行茜素紅染色。具體步驟為吸去各組相應(yīng)培養(yǎng)基,用PBS沖洗3次,每次5 min,加入2 mL 4%多聚甲醛固定20 min,再用PBS沖洗3次,每次5 min,加入茜素紅染液,染色5～10 min,PBS沖洗3次。在倒置顯微鏡下觀察茜素紅染色效果并拍照存檔。

1.2.6RT-PCR檢測(cè)ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA表達(dá):根據(jù)CCK-8、ALP活性檢測(cè)及茜素紅染色結(jié)果綜合分析,將MC3T3-E1細(xì)胞分為A、B、C、D 4組。A組:空白血清組,B組:20%含藥血清組,C組:空白血清+PD0325901組,D組:20%含藥血清+PD0325901組,各組加入相應(yīng)血清及PD0325901繼續(xù)培養(yǎng)14 d,采用trizol法提取總RNA,核酸蛋白儀檢測(cè)總RNA的濃度及純度,按照說明書逆轉(zhuǎn)錄步驟得到cDNA。設(shè)計(jì)引物及反應(yīng)體系。后在RT-PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)后檢測(cè)目的基因CT值。

1.2.7Western blot檢測(cè)ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白表達(dá):4組細(xì)胞按相應(yīng)條件干預(yù)培養(yǎng)36 h后棄掉培養(yǎng)基,用PBS沖洗后每孔加入裂解液,置于冰上裂解細(xì)胞30 min后提取細(xì)胞總蛋白,蛋白變性后,采用BCA法進(jìn)行蛋白定量,后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉,先后加入一抗和二抗,將配置好發(fā)光液,均勻滴加發(fā)光液于膜中,顯影,成像,分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析法,組間兩兩比較采用LSD法,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 固本增骨方含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,10%、15%、20%、25%含藥血清組在24、48、72 h時(shí)的OD值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且以20%含藥血清組在48 h時(shí)間點(diǎn)的OD值最高。干預(yù)至48 h后,細(xì)胞增殖呈下降趨勢(shì),48 h時(shí)間點(diǎn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性與24、72 h各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度固本增骨方含藥血清對(duì)各組細(xì)胞增殖的影響

2.2 固本增骨方含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響

與空白對(duì)照組相比,10%、15%、20%、25%含藥血清組ALP活性明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與各含藥血清組相比,20%含藥血清組ALP活性升高更加顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組MC3T3-E1細(xì)胞干預(yù)7 d后細(xì)胞ALP的活性比較

2.3 固本增骨方含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨礦化的影響

藥物干預(yù)14 d后茜素紅染色,鏡下觀察可見,與空白對(duì)照組組間對(duì)比,各含藥血清組(10%、15%、20%、25%)紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯更為密集,5%含藥血清組紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量無明顯差異,其中20%含藥血清組紅色鈣結(jié)節(jié)密集程度最為顯著,當(dāng)濃度增加到25%時(shí),鈣結(jié)節(jié)密集程度略呈下降趨勢(shì),見圖1。

圖1 各組MC3T3-E1細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果(×200)

2.4 各組細(xì)胞ERK1/2、Runx2、BMP-2的mRNA表達(dá)

與A組相比,B組ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA的表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);使用抑制劑后,相比于A組、B組,C組及D組上述目的基因表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),與D組相比,C組的下降趨勢(shì)更為顯著(P<0.05)。見表3。

表3 各組MC3T3-E1細(xì)胞中ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA表達(dá)量

2.5 各組細(xì)胞ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2的蛋白表達(dá)

與A組相比,B組ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異顯著(P<0.05)。相比D組,B組ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2表達(dá)水平升高(P<0.05)。A組與C組相比,結(jié)果無明顯差異(P>0.05)。與D組相比,C組ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2表達(dá)水平較低(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 各組細(xì)胞目的蛋白P-ERK1/2、ERK1/2、Runx2、BMP-2的表達(dá)量

表4 各組細(xì)胞目的蛋白ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2的表達(dá)量

3 討論

骨質(zhì)疏松癥作為一種系統(tǒng)代謝性疾病,在病程發(fā)展及轉(zhuǎn)歸預(yù)后上嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量[3]。中醫(yī)學(xué)將OP歸屬為“骨痿”范疇[4],《素問·痿論》曰:“腎氣熱,則腰膝不舉,骨枯而髓減,發(fā)為骨痿”,原文首次闡明了“腎氣熱”是OP發(fā)生的致病因素,“髓減骨枯”是OP發(fā)展的核心病機(jī)。又有《脾胃論·脾胃勝衰論》曰:“脾病則下流乘腎……是為骨蝕”,將脾病亦作為OP發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[5]。由此可見,脾虛乏源損及腎,脾腎不足,則骨削肉減,發(fā)為骨痿。OP為老年慢性骨病,發(fā)病緩慢,病程較久,久病則生瘀滯,正如《靈樞·營衛(wèi)生會(huì)》云:“老者之氣血衰,其肌肉枯,氣道澀[6]。”因此,氣虛血瘀是OP發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵促進(jìn)因素。由上述可知,OP的發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果,而中醫(yī)藥防治疾病立足于“整體觀念、辨證論治”體系,具有多途徑、多靶點(diǎn)、多層面等突出特點(diǎn),在OP的防治中可發(fā)揮其綜合治療優(yōu)勢(shì)。固本增骨方由黃芪、黨參、熟地黃、淫羊藿、肉蓯蓉、當(dāng)歸等藥組成,全方溫、補(bǔ)、通、調(diào)并用,共奏補(bǔ)腎壯骨、益氣健脾、活血止痛之效,能夠有效增加患者骨密度,同時(shí)改善其臨床癥狀,具有良好的臨床療效。前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究提示[7],固本增骨方發(fā)揮抗OP作用與多種入血活性分子的交感、聯(lián)合效應(yīng)有關(guān),這一過程涉及多條信號(hào)通路的調(diào)控。

MAPK作為一類介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的蛋白激酶家族廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi),活化的MAPK參與細(xì)胞增殖、分化、應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等過程[8]。ERK1/2是MAPK通路的主要亞型之一,其通過依次激活MAPKKK-MAPKK-MAPK三級(jí)激酶模式實(shí)現(xiàn)信號(hào)由細(xì)胞膜外向核內(nèi)的傳遞,活化的MAPK/ERK1/2通路廣泛參與調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖與分化,從而發(fā)揮防治OP的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷可通過調(diào)控MAPK/ERK1/2的磷酸化抑制OC分化,從而達(dá)到防治OP的作用[10]。陳錦成等[11]研究發(fā)現(xiàn),龜鹿二仙膠含藥血清可通過激活MAPK/ERK1/2通路及該通路下游靶蛋白E26轉(zhuǎn)錄因子1促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化。丁道芳等[12]研究了不同濃度大鼠含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)激活MAPK-ERK1/2通路可提高成骨基因Ⅰ型膠原、Runx2和ALP的表達(dá)水平,有助于提高成骨細(xì)胞的增殖活性。

本研究結(jié)果顯示,固本增骨方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性具有促進(jìn)作用,其中,20%含藥血清干預(yù)48 h對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖作用最為顯著,當(dāng)含藥血清濃度增加到25%時(shí),MC3T3-E1細(xì)胞生長速度呈現(xiàn)下降趨勢(shì),這可能與細(xì)胞間接觸性抑制作用有關(guān)。ALP活性檢測(cè)與茜素紅染色實(shí)驗(yàn)也印證了這一結(jié)果,檢測(cè)各組培養(yǎng)液中ALP活性表達(dá)水平,結(jié)果表明,在一定含藥血清濃度范圍(10%～20%),ALP活性增長呈現(xiàn)濃度依賴性,其中,以20%含藥血清組ALP活性最為顯著。當(dāng)濃度增加到25%時(shí),ALP活性降低。茜素紅染色后,20%含藥血清組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量最為密集。為了驗(yàn)證固本增骨方促M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞成骨分化作用與MAPK/ERK1/2信號(hào)通路的關(guān)系,進(jìn)一步檢測(cè)了MAPK/ERK1/2信號(hào)通路相關(guān)蛋白基因。WB及RT-PCR結(jié)果表明,與空白對(duì)照組相比,固本增骨方含藥血清能夠顯著上調(diào)P-ERK1/2、ERK1/2、BMP-2、Runx2蛋白及ERK1/2、BMP-2、Runx2 mRNA的表達(dá)水平。加入PD0325901通路抑制劑后,空白血清組與含藥血清組中目的蛋白及mRNA表達(dá)均下調(diào),但含藥血清組目的蛋白及mRNA的表達(dá)水平仍高于空白血清組,表明固本增骨方含藥血清具有促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化的作用,其作用機(jī)制可能與激活MAPK/ERK1/2信號(hào)通路,上調(diào)成骨相關(guān)因子Runx2、BMP-2有關(guān)。然而,由于中藥復(fù)方具有多層面、多途徑的綜合治療機(jī)理,當(dāng)前對(duì)固本增骨方防治OP的研究仍處于中藥復(fù)方的整體調(diào)控作用,其中發(fā)揮作用的具體有效成分及潛在分子靶點(diǎn)尚不明確。此外,研究發(fā)現(xiàn)除ERK1/2通路外,p38與JNK通路同樣作為MAPK的主要亞型對(duì)于骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)控也具有一定作用[13-14],而對(duì)于ERK1/2與JNK及p38各通路之間是否存在交互調(diào)控作用尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。