安夢霞，王萍玉

0 引言

肺癌發(fā)病率和死亡率居高不下，其中肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）是肺癌中的常見病理亞型[1]。LUSC患者早期臨床癥狀不明顯，大多數(shù)患者臨床確診時，已處于中晚期，患者預后、治療效果不太理想，導致LUSC患者5年生存率很低[2]。

研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）影響肺鱗癌細胞增殖、遷移和凋亡[3]。Tsvetkov新發(fā)現(xiàn)了一種新的細胞死亡形式—銅死亡[4]。銅死亡相關lncRNAs（cuproptosis related lncRNAs, CRLs）的研究成為新熱點，越來越多的研究表明CRLs與癌癥患者的預后密切相關[5-6]。然而，CRLs與LUSC的進展是否有關尚不清楚，是否可以作為預測LUSC患者預后、選擇免疫治療和藥物治療的重要指標也尚不清楚。因此，本研究基于CRLs開發(fā)了一種新的LUSC患者預后模型，并進一步開展免疫相關功能分析、免疫檢查點基因（immune checkpoint genes, ICGs）分析，為LUSC的預后和患者個體免疫化治療選擇提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集及預處理

從GTEx數(shù)據(jù)庫（https://www.gtexportal.org/）下載正常肺組織的RNA-sep表達矩陣，共獲取288例。從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載LUSC的RNA-sep表達矩陣，其中LUSC組織502例、對照組49例，并對數(shù)據(jù)進行批量歸一化。同時下載了TCGA-LUSC患者臨床數(shù)據(jù)，排除臨床資料缺失、生存期<30天、RNA-seq表達矩陣不完整的患者，最終共納入451例LUSC患者。通過查閱文獻，檢索到19個銅死亡基因[7]，49個免疫檢查點基因[8]。

1.2 差異表達CRLs的鑒定

利用“l(fā)imma”R包對銅死亡基因與TCGALUSC組織中l(wèi)ncRNAs進行共表達分析，以|R|>0.3且P<0.001為篩選標準，鑒定出CRLs[9]。結合GTEx，鑒定差異表達的CRLs，設置篩選條件為|logFC|>1且AdjustedP<0.05，并利用“pheatmap”R包繪制火山圖進行展示[10]。

1.3 基于CRLs的LUSC預后風險模型的建立與評估

將以上差異表達的CRLs表達量與生存狀態(tài)、生存時間合并。通過單因素Cox回歸分析、Lasso回歸分析以及多因素Cox回歸分析，篩選與LUSC預后相關的CRLs以及計算它們的回歸系數(shù)，建立LUSC預后風險評分模型：Risk score=（lncRNA1表達量*系數(shù)）+（lncRNA2表達量*系數(shù)）+...+（lncRNAn表達量*系數(shù)）。

根據(jù)風險評分的中位值，將LUSC患者重新劃分為高風險組和低風險組，并應用“survminer”R包對高、低風險組的總生存期（OS）進行生存分析。繪制C-index曲線以及ROC曲線下面積（AUC）評估風險評分模型預測LUSC患者預后能力。

1.4 列線圖預后模型的建立及評估

將臨床特征及風險評分一起進行單因素及多因素Cox回歸分析，以確定獨立的預后特征。使用“rms”R包建立列線圖模型。通過計算AUC值以及繪制校準曲線、決策曲線分析（decision curve analysis, DCA）評估列線圖模型的預測效能。

1.5 風險評分在預測患者免疫治療中的作用

本研究利用單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）對TCGALUSC中每個樣本進行免疫相關功能評分[11]。探究免疫相關功能、ICGs在高、低風險組之間的差異情況[12]。

1.6 統(tǒng)計學方法

本研究應用R軟件（https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/，版本4.1.1）和Perl軟件（https://www.perl.org，版本5.30）進行數(shù)據(jù)整理及分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 篩選差異表達的CRLs

從TCGA-LUSC資料庫中提取了19個銅死亡基因以及16 882個lncRNAs的表達量。進行共表達分析以鑒定CRLs。根據(jù)設置Pearson的相關標準（|R|>0.3且P<0.001）識別出1 445個CRLs。

利用韋恩圖的方式將TCGA數(shù)據(jù)庫中1 455個CRLs與GTEx數(shù)據(jù)庫中相關基因取交集，共獲得1 204個CRLs，見圖1A，根據(jù)|logFC|＞1且P<0.05，發(fā)現(xiàn)LUSC與對照組之間有721個CRLs的表達量存在顯著差異，其中382個CRLs上調，339個CRLs下調，結果以火山圖形式進行展現(xiàn)，見圖1B。

圖1 篩選LUSC中差異表達的CRLsFigure 1 Screening for differentially expressed CRLs in LUSC

2.2 CRLs預后模型的構建

將以上篩選的721個CRLs，通過單因素Cox回歸分析從中獲得42個CRLs與LUSC患者的OS顯著相關，見圖2A。Lasso回歸分析對變量進行降維，篩選出27個最具代表性的CRLs，見圖2B、C。對27個CRLs進行多因素Cox回歸分析，結果顯示有9個CRLs是LUSC預后獨立的lncRNA。其中BX546450.2、AP006545.1的風險比（HR）<1；AP003071.4、AC092140.2、BLACE、AC007336.1、AC012676.4、LINC00229、AC060814.2的HR>1，見圖2D。此外，我們利用?；鶊D展現(xiàn)銅死亡基因與這9個CRLs之間共表達關系，見圖2E。Risk score= [AP003071.4表達量*（0.582）]+[AC092140.2表達量*（0.4 7 4）]-[B X 5 4 6 4 5 0.2 表達量*（0.246）]+[BLACE表達量*（0.115）]+[AC007336.1表達量*（0.8 3 3）]+[A C 0 1 2 6 7 6.4 表達量*（0.8 9 6）] + [L I N C 0 0 2 2 9 表達量*（0.1 2 2）]-[A P 0 0 6 5 4 5.1 表達量*（0.288）]+[AC060814.2表達量*（0.384）]。

圖2 基于CRLs的LUSC患者風險模型Figure 2 Risk model based on CRLs for patients with LUSC

2.3 風險評分模型的預后價值

使用風險評分公式計算了451例LUSC患者的風險評分，取中位值，將所有LUSC患者劃分為高風險組與低風險組。風險評分分布的風險曲線、散點圖顯示患者隨著風險評分增加，患者死亡率升高，見圖3A。Kaplan-Meier生存曲線比較兩組之間的OS，發(fā)現(xiàn)LUSC患者高風險組患者的OS低于低風險組（P<0.001），見圖3B。繪制C-index曲線，發(fā)現(xiàn)風險評分的C-index依次高于年齡、性別、吸煙史、種族、原發(fā)腫瘤位置、放療史、TNM分期，見圖3C。計算風險評分及臨床特征預測LUSC患者1、3、5年生存率的AUC值，結果顯示風險評分預測LUSC患者1、3、5年生存率的AUC值分別為0.710、0.718、0.743，均大于其他臨床特征，見圖3D～F。

圖3 風險評分模型的預后價值Figure 3 Prognostic value of the risk score model

2.4 確定獨立預后特征

為了確定獨立預后特征，將年齡、性別、種族、腫瘤原發(fā)位置、TNM分期、吸煙史、放療史以及風險評分一起進行單因素及多因素Cox回歸分析，結果顯示年齡：≥65歲（HR=1.48, 95%CI: 1.07～2.05,P=0.018）、性別：女（HR=0.61, 95%CI: 0.43～0.87,P=0.006、腫瘤原發(fā)部位：肺中葉（HR=3.32, 95%CI:1.69～6.52,P<0.001）和肺下葉（HR=0.72, 95%CI:0.52～1.00,P=0.048）、TNM分期：Ⅲ期（HR=1.95,95%CI: 1.33～2.85,P<0.001）以及風險評分特征：高風險（HR=3.04, 95%CI: 2.22～4.15,P<0.001）是LUSC患者預后影響因素，見圖4。

圖4 LUSC預后的多因素Cox回歸分析結果森林圖Figure 4 Forest map of multivariate Cox regression analysis of LUSC prognosis

2.5 構建及評估列線圖預測模型

基于性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、TNM分期和風險評分構建LUSC患者預測預后列線圖模型，見圖5A。列線圖模型預測LUSC患者1、3、5年生存率的AUC值分別為0.733、0.763、0.773。與風險評分模型相比，列線圖模型進一步增強了預測能力，見圖5B。校準曲線顯示患者實際1、3、5年生存率與預測患者1、3、5年生存率一致性較高，見圖5C，表明模型校準度強。DCA顯示列線圖模型的臨床預測效能較好，見圖5D。

圖5 構建及評估預測LUSC患者預后的列線圖模型Figure 5 Construction and evaluation of the nomogram model to predict the prognosis of patients with LUSC

2.6 風險評分與免疫特征的相關性分析

為了進一步探索LUSC不同風險人群與抗腫瘤免疫之間的關系，本研究使用ssGSEA分析了免疫相關功能與LUSC高風險、低風險人群之間的相關性。結果顯示抑制腫瘤抑制基因、細胞因子受體、細胞溶解活性、炎性反應以及T細胞共同刺激等免疫功能存在顯著差異，見圖6A。細胞因子受體、細胞溶解活性、炎性反應以及T細胞共同刺激在高風險組中更活躍。本研究還比較了高風險和低風險組中免疫檢查點基因的表達水平，結果顯示49個ICGs中有19個ICGs在高低危險組中存在差異，其中17個ICGs（CD40、CD86、CD160、CD274、TNFSF18、TNFRSF8、CD244、TNFSF9、VTCN1、HAVCR2、ICOSLG、ICOS、LGALS9、CD28、TNFRSF18、IDO2、TNFRSF25）在低風險組中的表達高于高風險組，有2個ICGs（TNFRSF9、KIR3DL1）在高風險組的表達高于低風險組（P<0.05），見圖6B。

圖6 風險評分與免疫特征的相關性分析Figure 6 Correlation analysis of risk score and immune signature

3 討論

LINC00482主要被報道于其他部位的腫瘤，如膀胱細胞癌和肝細胞癌[13-14]。LINC00482在膀胱癌細胞和組織中高表達，LINC00482可作為致癌基因結合轉錄因子FOXA1發(fā)揮作用，LINC00482通過FOXA1在膀胱細胞癌中下調MMP-15的表達量，抑制膀胱腫瘤相關炎性反應和血管生成。本研究也發(fā)現(xiàn)LINC00482是LUSC的危險因素，對LUSC預后不利。本研究對lncRNAs在腫瘤進展過程中的作用知之甚少。提示研究這些未知的lncRNAs，可以確定預測LUSC預后和治療的新方案。

以往研究基于29個鐵死亡相關lncRNAs開發(fā)的風險評分模型預測LUSC患者1、3年生存率的AUC值分別是0.658、0.693[15]。而本研究基于9個CRLs開發(fā)的風險評分模型相對較優(yōu)，預測LUSC患者1、3、5年生存率的AUC值分別是0.710、0.718和0.743。此外，風險評分能夠準確區(qū)分LUSC患者的高低風險組，并且高風險患者的OS低于低風險患者。

本研究中，多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位、TNM分期與LUSC患者預后密切相關。患者年齡越大對預后越不利，與Liu等[16]研究結果一致。以往研究表明，與男性相比，女性患者癌細胞發(fā)生轉移頻率更低[17]。因此，男性患者的生存結果比女性差，與本研究結果一致。國外學者研究報道，由于肺中葉解剖結構獨特，它被肺上葉、肺下葉以及心包包圍，不易于發(fā)現(xiàn)且臨床癥狀輕，大多數(shù)患者確診時已發(fā)生轉移，與肺上葉患者相比，其預后差[18]。此外，風險評分是LUSC預后的影響因素，且風險評分特征的C-index和AUC值均大于其他臨床特征。綜上所述，本研究基于9個CRLs開發(fā)的風險評分模型可以更準確的預測LUSC的預后情況。

癌細胞的進展與免疫抑制有關，癌細胞通過不同的機制逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視，包括激活抑制抗腫瘤免疫反應的免疫功能和免疫檢查點通路。ICGs在調節(jié)自身免疫反應性方面發(fā)揮著核心作用，成為腫瘤治療重要手段[19]。免疫功能分析顯示，高風險組患者更多參與細胞因子受體、細胞溶解活性、炎性反應以及T細胞共同刺激等免疫功能。表明這些免疫功能在低風險組中受到抑制，需要激活它們，增強機體的抗腫瘤免疫功能，從而抵抗癌細胞的攻擊，延長低風險組患者的生存時間[10]。ICGs差異分析，發(fā)現(xiàn)只有TNFRSF9在高風險組中表達水平高于低風險組。TNFRSF9是一種T細胞共刺激受體，它對調節(jié)性T細胞、活化的自然殺傷T細胞和活化的NK細胞有作用，提示TNFRSF9抑制劑進入機體后，機體的T細胞可以識別癌細胞，通過免疫系統(tǒng)殺死癌細胞，改善高風險患者預后[20-21]?？傊?，風險評分模型可以在一定程度上反映免疫治療的效果和免疫應答率，從不同的角度為LUSC患者的免疫干預治療提供新的見解。

本研究存在幾處局限性。首先，研究數(shù)據(jù)是從國外公共據(jù)庫（TCGA和GTEx）提取，缺乏臨床樣本對結果進行外部驗證。其次，在以往研究中發(fā)現(xiàn)手術、化療對LUSC患者預后也有顯著影響，但國外數(shù)據(jù)庫的臨床信息中缺乏這些治療方法。因此，有必要收集更多的LUSC臨床樣本，以及更全面的臨床特征進行外部驗證。

綜上所述，本研究構建了一個基于9種CRLs的風險模型，在預測LUSC患者預后方面準確性高。同時，風險評分結合年齡、性別、TNM分期以及腫瘤原發(fā)位置構建的列線圖模型，可以作為一種新穎的臨床工具使用。本研究增加了免疫相關功能分析、ICGs分析，對LUSC的預后和患者個體免疫化治療選擇提供科學依據(jù)。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。