萬 冬,張煜英,王 歡,姚田子,郭建輝,劉鈺君,張賽暉,潘 杰

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù),全世界每年死于癌癥的人數(shù)超過700 萬,預計到2030 年將超過1 310萬[1]。 癌癥已成為人類健康和生命的頭號敵人,給世界帶來了巨大的經(jīng)濟負擔[2]。 為了提高癌癥的治療效率,新型抗癌藥物的研究仍然是一個挑戰(zhàn)。

多金屬氧酸鹽(Polyoxmetalates, POMs)是一組早期過渡金屬氧陰離子團簇,因其在催化、材料科學和醫(yī)學等領域的潛在應用而受到越來越多的關(guān)注[3-5]。 有趣的是,大多數(shù)影響POMs 與目標生物大分子識別和反應性的分子性質(zhì),如形狀、酸度、表面電荷分布、氧化還原電位和極性等,都可以通過改變反離子或引入有機基團來調(diào)整,這使得它們在醫(yī)學領域的應用,特別是在抗癌方面具有極大的吸引力[6,7]。 例如, Yamase 等設計了 [NH3Pri]6[Mo7O24]·3H2O (PM-8)來對抗人類肺部小細胞癌和乳腺癌[8,9]。 此外,根據(jù)Azizullah 小組的報告,發(fā)現(xiàn)Na12[α-P2W15O56]·24H2O 對Hela 和MCF-7 細胞[5]具有良好的抗腫瘤活性。 盡管POMs 有這些良好的特性和應用,但其水溶性差、毒性高嚴重限制了POMs 作為抗癌劑的發(fā)展,導致其治療效果較低,對正常組織器官的毒副作用嚴重[4,10]。 為了解決上述問題,設計一種低毒、高生物相容性和特異性靶向的新型聚合物納米顆粒(NPs) 是一種理想的策略。

近幾十年來,靶向聚合物NPs 在納米醫(yī)學領域引起了越來越多的興趣,主要用于治療和診斷癌癥[11]。 它們被認為是具有長循環(huán)效應的納米級給藥載體,極大提高了藥物的選擇性,從而減少了毒副作用,提高了治療效率。 一種方法是將聚乙二醇(mPEG1000)、D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸(TPGS)等三維生物相容性聚合物移植或結(jié)合在NPs 表面,可避免被巨噬細胞的識別和清除[12,13]。 例如,甲氧基聚乙二醇-聚乳酸共聚物(mPEG-PLA)已被合成用于抗腫瘤藥物的臨床管理。 這種負載紫杉醇的NPs在體外表現(xiàn)出良好的立體穩(wěn)定性,有望在血液循環(huán)[14]中實現(xiàn)長周期效應。 同時,通過修飾在NPs 表面的特定配體來實現(xiàn)靶向藥物傳遞,這些配體可以識別癌細胞并介導它們與癌細胞上的受體相互作用[15]。

Sun 等在2017 年描述了近紅外激光激活的帶有葉酸(FOL)修飾的NPs (Pt-IV-FINPs)可以選擇性地向表達葉酸受體的癌細胞傳遞藥物,以克服鉑基化療的缺點[16,15]。

因此,我們設計了POMs 負載FOL 修飾的靶向聚合物NPs,使POMs 具有水溶性,提高POMs 的體外生物相容性和穩(wěn)定性,并通過將POMs 靶向遞送到腫瘤組織中來提高對腫瘤細胞的敏感性。 我們進一步報道了POMs 負載聚合物NPs 的理化性質(zhì),如粒徑、電位、形貌,以及體外對MCF-7 黑色素癌細胞的細胞毒性。 在這項工作中,我們將潛在的新一代金屬藥物(POMs)與聚合物材料(PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL)結(jié)合,形成多功能聚合物NPs。 它們將能夠同時實現(xiàn)長循環(huán)和靶向治療的功能,成為納米醫(yī)學領域的一個新的研究熱點。

1 材料與方法

1.1 材料

D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS3350)、FOL、 戊二酸均購自于 Sigma-Aldrich。 PLAmPEG1000購自于中國山東醫(yī)學儀器研究所。 在文獻[17](Inorg.Chem.2002,41,6112-6117)基礎上合成POMs(CTAB)7(TBAB)7[Eu(H2O)3(P2W17O61)]2。N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)乙二胺均由國藥化學試劑有限公司提供。 二甲基亞砜(DMSO)、乙腈和吡啶由天津密歐化學試劑有限公司提供。三氯甲烷(TCM)、乙二胺由北京化工廠提供。 聚乙烯醇、細胞計數(shù)試劑盒-8 測定(CCK-8)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、胎牛血清(FBS)、杜氏改良鷹牌培養(yǎng)基(DMEM)、青霉素-鏈霉素溶液。

1.2 合成TPGS3350-FOL

按照圖1 所示,將FOL 修飾的TPGS3350的制備分為2 個部分。 簡單地說,將TPGS3350與DCC、戊二酸和DMAP 在10 mL DMSO 中反應,n(TPGS3350) ∶n(DCC) ∶n(戊二酸) ∶n(DMAP)= 1.0 ∶2.0 ∶2.0 ∶0.2,反應24 h 后,通過透析收集并凍干,合成TPGS3350-COOH。 然后將1 mmol FOL 溶于30 mL DMSO、2 mmol NHS 和1.2 mmol DCC 中,在避光條件中溶解6 h。 過濾后,進一步向反應體系中加入10 mmol 乙二胺,在吡啶催化下攪拌12 h。 用大量的乙腈沉淀FOL-NH2,離心收集,真空干燥。 最后,在去離子水中利用TPGS3350-COOH、NHS、DCC 和FOL-NH2, 生成 TPGS3350-FOL。 通過透析獲得TPGS3350-FOL 的最終產(chǎn)品,并用TEA 將pH 值調(diào)整到8.0 后凍干[18]。 用1H-NMR 在300 MHz 下對溶解于DMSO-d6中的TPGS3350-FOL 進行表征(德國Bruker AVANCE AV 300)。

圖1 TPGS3350-FOL 的合成路線Fig.1 The synthetic route of TPGS3350-FOL

1.3 帶有FOL 裝飾的POMs 負載納米粒子的制備

POMs 負載具有FOL 修飾的NPs 的制備方法為:將10 mg TPGS3350-COOH 和40 mg PLA-mPEG1000混合在3 mL 三氯甲烷中,首先用含5 mg POMs 的2 mL 三氯甲烷活化。 接下來,將上述溶液緩慢倒入60 mL 含0.5%聚乙烯醇的水溶液中,并在25 W 下超聲120 s。 通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h 去除三氯甲烷。 之后,在10 000 r·min-1下離心15 min,并用蒸餾水洗滌3 次, 真空過濾收集 PLA-mPEG1000/TPGS3350-COOH。 將過量的EDC 和NHS 加入到10 mL 去離子水中,分散20 mg PLA-mPEG1000/TPGS3350-COOH NPs 以激活TPGS3350-COOH 的羧基。 2 h 后,加入FOL-NH2,并用三乙胺調(diào)整pH 值至8.0。 最后通過水洗得到POMs 負載的 PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL 納米粒子。

此外,POMs 負載的PLA-mPEG1000NPs 的制備與上述方法一致,只是未添加TPGS3350-COOH[18,19]。

1.4 NPs 的表征

將POMs 負載的PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL和PLA-mPEG1000NPs 分別用適量的去離子水稀釋至1 mg·mL-1。 利用Zeta 電位分析儀(ZETASIZER NANO)來測定含有或不含有TPGS3350-FOL 的POMs負載的NPs 的顆粒大小、尺寸分布和Zeta 電位。 同時,通過掃描電子顯微鏡(SEM,日立S4800,日本HITACHI)確認化合物的表面形態(tài)[19]。

1.5 POMs 載藥量和POMs 包封率

所有的NPs 都是采用納米沉淀法制備。 NPs 的載藥量和包封率是影響納米藥物遞送系統(tǒng)的重要因素,用熒光光譜法在393 nm 的激發(fā)波長下進行測量[18-20]。 POMs 載藥量和POMs 包封率計算如式(1)和式(2)。

式(1)和式(2)中:M為NPs 和POMs 的總質(zhì)量;Ma為NPs 的質(zhì)量;Mb為加入的POMs 質(zhì)量。

1.6 體外細胞毒性實驗

通過細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測NPs 的體外細胞毒性,用酶標儀(Perkin-Elmer)進行檢測。 將MCF-7 黑色素癌細胞培養(yǎng)約15 h。 隨后根據(jù)1.5 中的藥物負載情況,將負載的PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL 和PLA-mPEG1000NPs 分別配制成藥物濃度為1、4 和10 μg·mL-1的溶液。 培養(yǎng)8 h 后,除去孔中含有藥物的培養(yǎng)基,然后用PBS 緩沖溶液洗2 次。之后,加入CCK-8 測定法,將細胞培養(yǎng)2 h,并記錄每孔的吸光度。 細胞存活率按參考文獻[18,19]計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 TPGS3350-FOL 共聚物的表征

圖2 TPGS3350-FOL 共聚物在DMSO-d6中的1HNMR 譜圖。 可以看到,圖2 中化學位移3.51 處的—CH2—質(zhì)子的核磁峰是TPGS3350中的mPEG1000。1.09 處的峰顯示了—TOS 的特征峰,TPGS3350-FOL共聚物中戊二酸和乙二胺的甲基和亞甲基的結(jié)構(gòu)分別出現(xiàn)在1.25、1.50 ～1.80、1.90 ～2.10、2.69 和2.85 處。 FOL 的—COOH 特征峰位于11.53 處,這是該化合物的一個重要標志。 共聚物的其他質(zhì)子位于6.63 和7.59 等處。 結(jié)果表明,成功合成了TPGS3350-FOL。

圖2 TPGS3350-FOL 共聚物在DMSO-d6 中的1H-NMR 譜圖Fig.2 1H-NMR spectra of the TPGS3350-FOL copolymer in DMSO-d6

2.2 NPs 的表征

膠束懸浮液的穩(wěn)定性是藥物遞送的一個重要指標,它由NPs 的粒徑和Zeta 電位決定。 長鏈PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL 作為外層的親水結(jié)構(gòu),而POMs 作為疏水結(jié)構(gòu)嵌入內(nèi)層,通過靶向FOL 形成穩(wěn)定的NPs。

圖3 顯示PLA-mPEG1000NPs 直徑約為200 nm,尺寸分布較窄。 PDI (Polydispersity index) 為0.194。 結(jié)果表明PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs的直徑約為220 nm。 PDI 為0.243。 據(jù)報道,傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物分子在細胞攝取作用下,通過包埋、吸附或共價鍵作用,針對特定的受體和表面被吸收到細胞中。 從而提高化療藥物的水溶性、穩(wěn)定性,減少其對正常組織和器官的毒副作用[4,10,21]。 此外,抗癌納米藥物的粒徑大小對靶向治療有很大影響。 當粒徑小于5 nm 時,容易被腎臟代謝掉;當粒徑大于250 nm 時,容易在脾臟、肝臟和肺部的毛細血管內(nèi)蓄積[22,23]。 當平均粒徑在200 nm 左右時,它往往會在體內(nèi)進行長時間的循環(huán),并通過內(nèi)皮細胞的活性過程而集中在腫瘤部位[24,25]。 NPs 表面較高的電荷可以產(chǎn)生強大的排斥力,從而阻止NPs在分散溶液中的聚集[26,27]。

圖3 NPs 的粒徑Fig.3 Particle size of NPs

此外,表面電荷是影響NPs 懸浮液穩(wěn)定性的重要參數(shù)。 用粒徑電位儀測量出,PLA-mPEG1000NPs和PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 均帶負電荷,它們的Zeta 電位分別為-35.3 和-18.6 mV。 認為NPs 的負電荷在體內(nèi)長期循環(huán)過程中不容易與血紅蛋白結(jié)合,進而被癌細胞攝取,減少了機體的毒副作用[28,29]。

同時,用FESEM 檢測的粒度與激光光散射(LLS)測定的粒徑具有良好的一致性(圖4)。 可以看出,NPs 在這個分辨率下呈球形,表面光滑。 如圖4 所示,觀察到的膠束的平均粒徑約為140 nm。 據(jù)報道,平均粒徑小于200 nm 的NPs 在血液中的循環(huán)時間比粒徑較大的NPs 更長。 它可以保證藥物的長期的療效和在體內(nèi)更長的循環(huán)時間[30]。

圖4 PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL 的POMs加載NPs 的FESEM 圖像Fig.4 FESEM image of POMs-loaded NPs of PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL

2.3 載藥量和包封率

PLA-mPEG1000NPs 和PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 的載藥量分別為6.523%和6.134%。 藥物包封率分別為(65.31 ± 0.446)% 和(61.45 ±0.586)%。 由此可見,PLA-mPEG1000NPs 表現(xiàn)出更高的載藥量和包封率,說明TPGS3350-FOL 的引入對兩者都有影響。 在本研究中,不同的材料和制備方法以及詳細的給藥參數(shù)都對藥物包封率和載藥量有很大影響。 我們選擇了一種簡單的納米沉淀法,NPs 的藥物包封率不高,這可能是由于在制備過程中,一些藥物分子從NPs 中擴散出去,被沖走所致。

2.4 體外細胞毒性

采用CCk-8 法對PLA-mPEG1000NPs 和PLAmPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 進行體外細胞毒性實驗。 圖5 分別顯示了其在4、8 和24 h 的不同藥物濃度下的細胞存活率,可以得出以下幾個結(jié)論。

圖5 PLA-mPEG1000 NPs 和PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 制劑在不同藥物濃度下培養(yǎng)4 h、8 h、24 h 后MCF-7 小鼠乳腺癌細胞的體外細胞存活率Fig.5 In vitro cell viability of MCF-7 murine breast cancer cells with PLA-mPEG1000 NPs and PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs formulations after 4 h, 8 h, 24 h incubation at various drug concentration

(1) 在相同的POMs 濃度下,PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 對MCF-7 細胞的細胞毒性明顯高于PLA-mPEG1000NPs。 這可能與MCF-7 細胞中存在FOL 受體有關(guān),TPGS3350-FOL 可被FOL 受體靶向識別,NPs 通過受體介導的內(nèi)吞作用主動靶向癌細胞,導致癌細胞中化療藥物的數(shù)量高于未修飾FOL的NPs。 同時,說明合成的納米藥物具有較強的抗癌作用。

(2)我們還清楚地看到,隨著NPs 濃度的逐漸增加,細胞活性逐漸降低,毒性逐漸增強。 例如,當納米顆粒濃度低于50 μg·mL-1時,PLA-mPEG1000NPs 和PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPS 的細胞活性可達50%以上。

(3)培養(yǎng)時間越長,PLA-mPEG1000NPs 和PLAmPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 的細胞毒性越高。 此外,PLA-mPEG1000NPs 在150 μg·mL-1培養(yǎng)24 h 的毒性比100 μg·mL-1時的毒性高40.46%。 PLAmPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 的效果更為顯著,其在150 μg·mL-1培養(yǎng)24 h 的毒性比在100 μg·mL-1培養(yǎng)的毒性增加了65.05%。 當NPs 在100 μg·mL-1培養(yǎng)24 h,PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 的細胞存活率比PLA-mPEG1000NPs 低1.59 倍。 當NPs 在150 μg·mL-1下培養(yǎng)時,PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 中的細胞存活率比PLA-mPEG1000NPs 低2.71倍。 當PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 在200 μg·mL-1下培養(yǎng)24 h,存活率為(0.91±0.67)%,毒性很大,細胞幾乎死亡。 此外,圖5 清楚地表明,細胞存活率也呈現(xiàn)出相同的趨勢。 因此,我們可以得出結(jié)論,FOL 有助于提高細胞攝取。

3 結(jié)論

綜上所述,設計了一種POMs 負載FOL 修飾的靶向聚合物NPs,用于靶向治療癌癥。 這些構(gòu)建物被充分地表征出來,并對MCF-7 小鼠乳腺癌細胞進行了體外實驗。 本研究設計的聚合物NPs 的結(jié)果表明,與傳統(tǒng)的藥物制劑相比,POMs 在腫瘤部位的生物活性靶向性和聚集性得到了改善,細胞內(nèi)化得到了加強,從而具有顯著的抗癌活性和低毒副作用。 這種新型聚合物NPs 具有廣闊的臨床應用前景。