劉 瀅 張 力 楊葉虹

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院內(nèi)分泌科 上海 200040）

糖尿病是由于胰島素分泌和（或）作用缺陷引起的，以慢性高血糖為特征的一類代謝性疾病。預(yù)計(jì)到2045 年全球糖尿病人數(shù)將從4.63 億人躍升至7億人，患病率增長46%［1］。糖尿病已成為全球最常見、發(fā)病增長速度最快的慢性病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約25%的2 型糖尿病患者患有糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變，近50%的糖尿病患者會出現(xiàn)糖尿病神經(jīng)病變［2］。長期慢性高血糖水平可損傷脈管系統(tǒng)，引起微血管并發(fā)癥，使腎臟、心臟和視網(wǎng)膜等器官發(fā)生功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，縮短預(yù)期壽命。從機(jī)制上看，多種機(jī)制參與調(diào)控糖尿病微血管并發(fā)癥，包括晚期糖基化終末產(chǎn)物途徑、慢性炎癥反應(yīng)、己糖胺途徑、多元醇途徑和蛋白激酶C 通路激活氧化應(yīng)激等［3］。此外，高血糖還可能直接刺激生長因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致血管損傷和細(xì)胞功能障礙［4］。臨床上糖尿病微血管并發(fā)癥的一線治療仍以藥物治療為主。但多數(shù)患者長期服用藥物只能延緩疾病進(jìn)展，且可能出現(xiàn)低血糖、惡心、嘔吐、頭痛等藥物相關(guān)不良反應(yīng)。故迫切需要尋找糖尿病微血管并發(fā)癥新的診斷工具和治療靶點(diǎn)。細(xì)胞和器官之間的級聯(lián)信號傳遞系統(tǒng)在糖尿病微血管損傷中起到重要作用［5］。外泌體（exosome）是內(nèi)吞體和脂膜內(nèi)陷形成的納米級細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），不僅能通過循環(huán)系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)胞通訊過程，也能參與炎癥和代謝反應(yīng)誘發(fā)全身性疾病［6］。其攜帶的miRNAs 在體液中能穩(wěn)定存在，可以囊泡形式經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)輸至靶細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)控受體細(xì)胞的病理生理過程。已有多種外泌體miRNAs 被報道參與調(diào)控糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，是新的診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶標(biāo)［7］。本文針對近年來外泌體miRNAs 的概況及其在糖尿病微血管并發(fā)癥的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，旨在為糖尿病微血管并發(fā)癥的臨床預(yù)防、診斷和治療提供新依據(jù)。

外泌體miRNAs 概況

外泌體miRNAs 的發(fā)現(xiàn)和研究現(xiàn)狀1981 年，Trams 等首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外膜脫落具有5’-核苷酸酶活性的微囊泡，并推測這類膜囊泡可能具有生理功能。隨后Pan 和Johnstone 在追蹤綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體釋放到細(xì)胞外的過程與分泌性囊泡相關(guān)，并首次將這類囊泡命名為“exosomes”。隨后的研究證明在B 淋巴細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞中，多囊泡體可與溶酶體或自噬小體融合后被降解，或通過與質(zhì)膜融合向細(xì)胞外分泌構(gòu)成外泌體［8］。外泌體腔內(nèi)可攜帶生長因子、DNA、RNA 和蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)，廣泛存在于幾乎所有的生物體液中［9］。

外泌體miRNAs 的生成機(jī)制miRNAs 是一類長度約18～24 個核苷酸長度的短鏈非編碼RNA，具有高度保守性，能在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血流動力學(xué)改變等生理病理過程［10］。在經(jīng)典miRNAs 合成途徑中，編碼miRNAs 基因通過DNA 依賴性RNA 聚合酶Ⅱ催化生成初級轉(zhuǎn)錄物（primary miRNA transcripts，pri-miRNAs），pri-miRNAs 在細(xì)胞核內(nèi)由RNA 酶Ⅲ Drosha 及其輔助因子Pasha 剪切形成60～110 核苷酸長度的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNAs 前體（precursor miRNAs，pre-miRNA）。再由輸出蛋白5（exportin 5，Exp5）將pre-miRNAs 轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)中的Dicer 酶會進(jìn)一步切割pre-miRNAs形成雙鏈RNA（即miRNA/miRNA duplex）。哺乳動物體內(nèi)，一條miRNA 能與Argonaute（Ago）蛋白結(jié)合形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA induced silencing complex，RISC）。通過miRNA 與mRNA的序列匹配，RISC 復(fù)合體結(jié)合到目標(biāo)mRNA 的3’端非翻譯區(qū)誘導(dǎo)基因沉默［11］（圖1）。在細(xì)胞外或循環(huán)系統(tǒng)中，miRNAs 已被證實(shí)可存在于唾液、血液和尿液等體液中，其中由外泌體脂質(zhì)雙層包裹的miRNAs 可保護(hù)其免受體液中RNA 酶的降解，直接遞送至遠(yuǎn)端的靶細(xì)胞對mRNA 靶標(biāo)進(jìn)行功能調(diào)節(jié)。多項(xiàng)研究表明外泌體miRNAs 與糖尿病、心肌梗死和惡性腫瘤等多種疾病密切相關(guān)，有望作為早期診斷和預(yù)后治療的生物標(biāo)志物［12-13］。

圖1 外泌體miRNAs 的生成、分選和分泌過程Fig 1 Process of biogenesis， sorting and secretion of exosomal miRNAs

外泌體miRNAs 的分選機(jī)制miRNAs 在EVs核酸中的比例高于其親代細(xì)胞，且外泌體miRNAs的表達(dá)水平在不同的病理生理?xiàng)l件下發(fā)生改變，說明miRNAs 是主動裝載到外泌體中［14］。目前研究指出miRNAs 可以通過4 種途徑分選進(jìn)入外泌體：第一，中性鞘磷脂酶2（nSMase2）依賴性途徑。nSMase2 是第一個被發(fā)現(xiàn)與包裝外泌體miRNAs相關(guān)的分子，其過表達(dá)會上調(diào)外泌體中miRNAs 的含量，表明nSMase2 依賴性通路與外泌體中miRNAs 的分類有關(guān)［15］。第二，miRNAs誘導(dǎo)RISC（miRISC）相關(guān)途徑。在人類細(xì)胞中miRISC中AGO2蛋白能與miRNAs 5’端的U 堿基或A 堿基結(jié)合，調(diào)控外泌體中miRNAs的分泌類型或豐度。敲除AGO2基因可降低HEK293T細(xì)胞釋放的miR-142-3p、miR-150 和miR-451 等外泌體miRNAs 的含量［16］。第三，核異質(zhì)核糖核酸蛋白（hnRNPs）依賴性途徑。研究表明類泛素化修飾（small ubiquitin-related modifier，SUMOylation）的hnRNPA2B1 能識別特定的miR-185 3’端GGAG 和GGCU 堿基序列，使miRNAs 包裹進(jìn)外泌體中［17］。第四，miRNAs 3’端序列依賴性途徑。在正常細(xì)胞中存在兩種外泌體miRNAs，經(jīng)尿嘧啶化修飾的miRNAs 或經(jīng)腺苷?；揎椀膍iRNAs，其中經(jīng)腺苷?；揎椇蟮膍iRNAs分泌囊泡更為富集；而在腫瘤組織中，外泌體中主要攜帶尿嘧啶化修飾的內(nèi)源性miRNAs［18］。以上兩種修飾方式表明miRNAs 3’端攜帶關(guān)鍵的分選信號，可經(jīng)尿嘧啶化修飾或者腺苷?；揎椇蠼M裝到外泌體中。

外泌體miRNAs 的功能和應(yīng)用一方面，外泌體miRNAs 能抑制翻譯或誘導(dǎo)靶mRNA 降解。人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 細(xì)胞、H460 細(xì)胞和Calu-1 細(xì)胞均分泌miR-619-5p，而上調(diào)的miR-619-5p 靶向抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)因子1.4（regulator of calcineurin 1.4，RCAN 1.4），誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞血管生長促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［19］。脂肪細(xì)胞衍生的外泌體miR-27a 和脂肪組織內(nèi)巨噬細(xì)胞衍生的miR-155 通過靶向抑制PPARγ 通路導(dǎo)致肌細(xì)胞胰島素抵抗［20-21］。另一方面，外泌體miRNAs 可通過調(diào)控p53信號通路、凋亡通路和Toll 樣受體家族蛋白等通路參與免疫反應(yīng)，如源自肺腺癌細(xì)胞的外泌體miR-125b 可調(diào)控p53 信號通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞復(fù)極化，從抗炎的M2 型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)向促炎和抗腫瘤的M1 型巨噬細(xì)胞［22］。黑色素瘤細(xì)胞分泌的外泌體miR-125b-5p 靶向溶酶體酸性脂肪酶A（LIPA），可增加腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M1 表型標(biāo)志物白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、CC 趨化因子家族中CCL1、CCL2 和免疫球蛋白超家族CD80 的表達(dá)［23］。相比于直接釋放到循環(huán)系統(tǒng)中的miRNAs，雙層脂質(zhì)封裝的外泌體miRNAs 更為穩(wěn)定，在疾病診斷和治療上具有廣闊的應(yīng)用前景。例如前列腺癌、乳腺癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌中外泌體miR-1246 的表達(dá)與腫瘤病理分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)［24］。Zheng 等［25］還建議將血漿外泌體miR-30d-5p 和let-7d-3p 作為宮頸癌非侵入性篩查的標(biāo)志物。有研究報道外泌體miRNAs 作為新型療法有望參與腫瘤治療，如以腫瘤細(xì)胞來源的外泌體為載體將miR-155 遞送到樹突狀細(xì)胞，上調(diào)MHCII（I/A-I/E）、CD86、CD40、CD83、IL-12p70、IFN-γ 和 IL-10 的表達(dá)水平，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，改善腫瘤細(xì)胞的免疫功能［26］。

外泌體miRNAs 在糖尿病微血管并發(fā)癥中的相關(guān)研究1 型糖尿?。═1DM）和2 型糖尿?。═2DM）可對機(jī)體多個器官的微血管系統(tǒng)造成損傷，且長期高血糖引起的微血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死和致殘的重要原因。2017 年美國內(nèi)分泌協(xié)會指出，盡管T1DM 和T2DM 的發(fā)病機(jī)制不同，但他們都存在長期慢性的微血管損傷和功能障礙［27］。高血糖是造成糖尿病微血管并發(fā)癥的主要危險因素。典型微血管病變包括糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）、糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）和糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）。多項(xiàng)研究表明糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，與外泌體miRNAs 的種類和功能密切相關(guān)［28］，可作為糖尿病微血管并發(fā)癥診斷的分子標(biāo)志物或潛在治療靶點(diǎn)（圖2）。

圖2 外泌體miRNA 調(diào)控糖尿病微血管并發(fā)癥的分子機(jī)制Fig 2 Molecular mechanism of exosomal miRNAs regulation of diabetes microvascular complications

糖尿病腎病DN 是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥，早期無明顯臨床癥狀，若未及時干預(yù)，晚期可發(fā)展為終末期腎病。腎活檢是目前診斷DN 的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于該技術(shù)屬于侵入性操作且檢查成本較高，并不適用所有的糖尿病患者［29］。鑒于外泌體的雙層脂膜結(jié)構(gòu)能有效保護(hù)其裝載的內(nèi)容物避免miRNAs 降解，因此尿外泌體miRNAs 可用于分析DN 患者的臨床特征。杜鵬舉等［30］采集了168 例T2DM 患者尿液進(jìn)行外泌體鑒定，結(jié)果顯示早期DN 患者尿外泌體miR-129 表達(dá)降低，尿高遷移率族B1 蛋白（HMGB1）水平升高，miR-129 的表達(dá)與尿HMGB1 水平、尿蛋白/肌酐比值呈負(fù)相關(guān)性，和腎小球?yàn)V過率呈正相關(guān)性（P＜0.05），聯(lián)合檢測尿外泌體miR-129 和HMGB1 的水平對于早期DN 患者的診斷具有潛在價值。在晚期接受腹膜透析治療的DN 患者血清外泌體中，miR-301a 是主要差異表達(dá)的miRNA。高表達(dá)miR-301a 的患者在臨床上發(fā)生心血管事件風(fēng)險增加，推測外泌體miR-301a 可能通過調(diào)控炎癥因子誘發(fā)心血管風(fēng)險事件［31］。取DN 患者的尿液進(jìn)行二代測序發(fā)現(xiàn)，T2DM 患者尿液中有72 個差異表達(dá)的外泌體miRNAs，miR-188-5p 上調(diào)水平最高［32］。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)高糖誘導(dǎo)miR-188-5p 分泌，通過PTEN/PI3K/Akt 通路促進(jìn)人近端腎小管細(xì)胞系HK-2 細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，損傷腎小管功能，誘發(fā)腎纖維化［33］。

除了干擾PI3K/Akt 通路，外泌體miRNAs 還能調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路促進(jìn)或延緩糖尿病腎纖維化的發(fā)生發(fā)展。miR-21 和miR-433是糖尿病腎病中常見的兩種促纖維化miRNAs，與糖尿病腎病患者纖維化嚴(yán)重程度和腎功能損傷呈正相關(guān)。從機(jī)制上看，這兩種miRNA 可下調(diào)Smad7、PTEN、PPARα等抗纖維化基因，從而加重糖尿病腎纖維化進(jìn)程；此外，miR-Let-7 和miR-29 等細(xì)胞外囊泡包裹的抗纖維化miRNAs 也能通過靶向TGFR1、TGF-β2、膠原蛋白等促纖維化基因，負(fù)向調(diào)控TGF-β1/Smad3 信號通路以延緩腎纖維化進(jìn)展［34］。另有研究指出尿外泌體miR-30a-5p 與餐后血糖水平以及糖尿病患者腎小球?yàn)V過率下降正相關(guān)。生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)受高血糖和氧化應(yīng)激調(diào)控的miR-30a-5p 可參與調(diào)控泛素-蛋白酶體信號通路和嘌呤代謝過程，加重糖尿病腎損傷［35］。Tsai等［36］檢測了db/db 小鼠尿液和T2DM 患者尿液中的EVs 發(fā)現(xiàn)，在EVs 中miR-15b-5p 的水平較高，且高表達(dá)的miR-15b-5p 與尿白蛋白和肌酐比值升高相關(guān)。體外模型進(jìn)一步證實(shí)，高糖刺激的miR-15b-5p通過靶向抗凋亡因子Bcl-2 誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡，表明miR-15b-5p 可能是DN 進(jìn)展的關(guān)鍵因素。

此外，外泌體miRNAs 還能通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞焦亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激加重DN 進(jìn)程。Gao 等［37］發(fā)現(xiàn)miR-4449 在糖尿病腎病患者的血清外泌體中富集，miR-4449 靶向抑制癌高甲基化基因1（HIC1），增加腎小管上皮細(xì)胞ROS 水平，上調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18 的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞焦亡。2023 年有研究發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖刺激近端腎小管上皮細(xì)胞分泌miR-92a-1-5p，隨后該外泌體miR-92a-1-5p 被腎小球系膜細(xì)胞攝取，在系膜細(xì)胞中抑制Reticulocalbin-3（RCN3）的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，加重糖尿病腎損傷［38］。

糖尿病視網(wǎng)膜病變DR 是嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，也是造成糖尿病患者失明的主要原因。血管損傷初期視網(wǎng)膜細(xì)胞受損、新血管生成、炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激等導(dǎo)致患者視力下降［39］。病變后期，持續(xù)高血糖環(huán)境導(dǎo)致幾乎所有類型的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變，血-視網(wǎng)膜屏障完整性喪失，微血管的通透性增加、血流量減少甚至出現(xiàn)閉合，最終使視網(wǎng)膜微血管細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全破環(huán)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的視力障礙甚至失明［40］。眾多學(xué)者近年來致力于尋找更有效的生物標(biāo)志物，期望用來監(jiān)測和治療DR。目前多種外泌體miRNAs，如miR-3197、miR-2116-5p、miR-152、miR-34a，被鑒定為直接參與調(diào)節(jié)DR 的特異性生物標(biāo)志物［41-42］。

Zeng 等［43］發(fā)現(xiàn)DR 患者血液中的外泌體miR-29b-3p 可與SIRT1 的3’-UTR 直接結(jié)合，上調(diào)的miR-29b-3p 會降低SIRT1 的表達(dá)并增加Bax/Bcl-2的比值，促進(jìn)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮HRMEC 細(xì)胞凋亡，造成視網(wǎng)膜損傷；使用miR-29b-3p 抑制劑SRT1720 可以上調(diào)SIRT 1 蛋白的表達(dá)，減輕高糖條件誘導(dǎo)的促凋亡作用。Maisto 等［44］報道血液中葡萄糖濃度升高會增加視網(wǎng)膜感光細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的水平，同時降低感光細(xì)胞和外泌體中抗血管生成miRNAs，如miR-106a-5p、miR-20a-5p 和 miR-20a-3p 的表達(dá)。 體外轉(zhuǎn)染上述miRNAs 后，HUVEC 細(xì)胞內(nèi)管狀毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)和血管分支點(diǎn)增多促進(jìn)血管生成。最新研究報道稱Müller 膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體miRNA-9-3p 在高糖條件下會導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管功能障礙。這是由于外泌體miRNA-9-3p 被轉(zhuǎn)移到視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞后與1-磷酸鞘氨醇受體S1P1序列結(jié)合，經(jīng)AKT/ERK 通路促使 VEGFR2 磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)人原代視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成［45］。

此外內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化也能參與DR 的病理性纖維化過程。在高糖刺激下，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分泌的外泌體通過轉(zhuǎn)移miR-202-5p 作用于TGF /Smad信號通路，調(diào)控HUVEC 細(xì)胞的生長和遷移，抑制內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程［46］。也有研究指出間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）分泌的外泌體miRNAs 可有效緩解DR 中的腎小管上皮細(xì)胞EMT 和血管形成［47］。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型中，MSCs分泌的EVs 使大鼠視網(wǎng)膜中miR-18b 的表達(dá)升高，miR-18b 通過靶向絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1，MAP3K1）抑制NF-κB p65 磷酸化，減輕視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)并減少HUVEC 細(xì)胞凋亡進(jìn)而緩解DR，為DR的防治提供了新策略［48］。Safwat 等［49］在DR 兔模型中揭示MSC 衍生的外泌體miR-222 與視網(wǎng)膜的再生變化密切相關(guān)，指出外泌體miR-222 在視網(wǎng)膜組織修復(fù)過程中起重要的作用。因此，在未來DR 治療中有望通過外源性增加人體內(nèi)某些外泌體miRNAs 的含量來改善視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞的狀態(tài)。

糖尿病周圍神經(jīng)病變一半以上的慢性糖尿病患者后期會出現(xiàn)周圍神經(jīng)病變，據(jù)估計(jì)到2030 年全世界將有近50 億人患有DPN。DPN 的癥狀因疾病的不同階段而異，早期患者主要表現(xiàn)為疼痛和痛覺過敏，隨著疾病的進(jìn)展患者逐漸出現(xiàn)肌肉無力、麻木和足部潰瘍等。除了負(fù)擔(dān)昂貴的醫(yī)療費(fèi)用，DPN 患者長期自覺身體不適也會導(dǎo)致抑郁和焦慮發(fā)作，肢體潰瘍和截肢的概率較高，整體生活質(zhì)量較差［50］。臨床研究發(fā)現(xiàn)控制血糖水平只能延緩DPN 進(jìn)展，故亟需尋找有效療法減輕DPN 相關(guān)的外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷。Jia 等［51］報道過表達(dá)的miR-28、miR-31a 和miR-130a 源自高糖刺激的施萬細(xì)胞向外分泌，分泌出來的miRNAs 可與背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal Root Ganglion，DRG）的軸突進(jìn)行細(xì)胞間通訊。若向糖尿病db/db 小鼠的坐骨神經(jīng)局部注射外泌體miR-28、miR-31a 和miR-130a 后，外泌體miRNAs 可調(diào)節(jié)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶-3α（DNMT3A）、突觸體相關(guān)蛋白25（SNAP25）、內(nèi)吞銜接蛋白NUMB 以及軸突中生長相關(guān)蛋白43（GAP43）的表達(dá)，減慢神經(jīng)傳導(dǎo)速度，誘導(dǎo)機(jī)械痛和熱痛感覺減退，加重周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展。在T2DM db/db 小鼠模型中注射施萬細(xì)胞分泌的外泌體后，miR-21、miR-27a 和miR-146a 表達(dá)增加，促進(jìn)糖尿病小鼠DRG 的軸突生長，改善坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，增加熱痛和機(jī)械痛的敏感性［52］。此外，MSCs 分泌的外泌體還可以修復(fù)受損的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)功能障礙。在大鼠DPN 模型中，源自間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體miR-221、miR-17 和miR-23a 能負(fù)向調(diào)控NF-κB 信號通路、晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）和細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子3（SOCS3）的表達(dá)，下調(diào)前列腺素E2、IL-6、IL-1β 和TNF-α 等促炎介質(zhì)的水平，緩解DPN 大鼠的神經(jīng)血管功能障礙［53-54］。以上結(jié)果證實(shí)外泌體miRNAs 有望作為糖尿病神經(jīng)損傷的有效治療靶標(biāo)。

外泌體miRNAs 在糖尿病微血管并發(fā)癥治療的應(yīng)用外泌體運(yùn)輸功能性miRNAs 是細(xì)胞間信息通訊的重要途徑之一。相比于傳統(tǒng)的基因載體，外泌體作為運(yùn)載體具有獨(dú)特的生物學(xué)優(yōu)勢：（1）作為細(xì)胞來源的納米級膜囊泡，外泌體具有低免疫原性；（2）外泌體的生物相容性結(jié)構(gòu)使其更容易進(jìn)入細(xì)胞，高效提高基因傳遞效率；（3）外泌體外膜堅(jiān)硬，可有效保護(hù)囊泡內(nèi)容物，避免溶酶體吞噬外泌體降級其包裹的生物活性物質(zhì)，在體液中具有良好的耐受性；（4）定向歸巢，修飾后的外泌體可用于靶向遞送實(shí)現(xiàn)組織或細(xì)胞特異性分布［55-58］。近年來，將miRNAs、miRNAs 激動劑或抑制劑等靶向分子加載到EVs 和外泌體中，或篩選出天然富含某些miRNAs 的外泌體，再運(yùn)送到特定的細(xì)胞（如人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）的相關(guān)研究表明，外泌體遞送miRNAs 系統(tǒng)對非小細(xì)胞肺癌、阿爾茨海默病等多種疾病具有潛在的治療作用，是下一代藥物輸送系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)，也是治療糖尿病微血管并發(fā)癥的新策略。

研究表明用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體治療可增加miR-146a 的表達(dá)，減少大腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥，從而導(dǎo)致突觸形成，改善糖尿病引起的認(rèn)知障礙［59］。Huang 等［60］在糖尿病大鼠足缺血模型中證實(shí)，過表達(dá)人MSCs 來源的外泌體miR-21-5p具有顯著的促血管活性。外泌體治療處理14 天后，數(shù)字減影血管造影術(shù)分析顯示相比對照組，注射外泌體miR-21-5p 后大鼠缺血后肢新生血管數(shù)量增加3 倍，血管密度明顯提高。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示外泌體miR-21-5p 通過上調(diào)VEGF 受體，激活A(yù)KT 和MAPK 信號通路促進(jìn)血管生成，是用于治療糖尿病足的新的潛在生物標(biāo)志物。Yan 等［61］通過電穿孔法負(fù)載牛奶來源的外泌體miR-31-5p（mEXO-31），體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)mEXO-31 在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，通過下調(diào)靶基因缺氧誘導(dǎo)因子1 亞基α 抑制劑（HIF1 AN）的表達(dá)促進(jìn)糖尿病傷口的愈合過程；在糖尿病小鼠背部傷口模型中mEXO-31 能使傷口再上皮化、誘導(dǎo)膠原和血管生成，顯著加快糖尿病傷口愈合。以上研究結(jié)果為基于外泌體遞送的miRNAs 療法在糖尿病微血管并發(fā)癥中的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

然而，外泌體miRNAs 應(yīng)用于實(shí)際臨床治療仍存在一些問題。第一，外泌體分離、純化和鑒定方法尚未達(dá)到成熟水平。目前多采用差速離心、密度梯度離心、尺寸排阻色譜法、超濾法、聚合物沉淀法和免疫親和法等方法收集外泌體［62］。但是由于外泌體粒徑較小且與多種其他生物分子混合在一起，其分離純化困難。如超高速離心分離出的外泌體通常會含有蛋白質(zhì)和脂蛋白；超濾法過濾后可能會導(dǎo)致堵塞，縮短外泌體的壽命降低分離效率，甚至可能影響下游機(jī)制分析。第二，若將外泌體作為治療方法，目前急需解決的問題是治療性外泌體miRNAs 的產(chǎn)量低，裝載效率低。如前所說牛奶來源的外泌體囊泡構(gòu)建藥物遞送平臺的新技術(shù)可能會解決外泌體產(chǎn)量低的問題［61］。第三，天然未經(jīng)過工程化改造的外泌體靶向性不足，進(jìn)入體內(nèi)容易被非靶細(xì)胞快速攝取，導(dǎo)致外泌體治療藥物半衰期短，降低治療效率。盡管目前出現(xiàn)多種增強(qiáng)外泌體靶向性的方法，仍急需開發(fā)新技術(shù)拓展攜帶miRNAs 的外泌體囊泡。多項(xiàng)體外研究發(fā)現(xiàn)MSC衍生的外泌體miRNAs 對胰腺癌、黑色素瘤、糖尿病等疾病治療效果突出。 但有關(guān)MSC 衍生的miRNAs 的制備標(biāo)準(zhǔn)、保存運(yùn)輸、供體來源等關(guān)鍵問題還需解決。相信隨著外泌體運(yùn)載非編碼RNAs 研究的深入，有望開發(fā)出更準(zhǔn)確、高效、標(biāo)準(zhǔn)化的外泌體miRNAs 分離純化技術(shù)，外泌體miRNAs 也將在糖尿病微血管并發(fā)癥的預(yù)防、診斷和治療中發(fā)揮巨大價值。

結(jié)語外泌體和外泌體內(nèi)容物可作為糖尿病微血管并發(fā)癥的生物標(biāo)志物，但其機(jī)制尚未完全明確。外泌體具有良好的生物相容性，能穿過生物屏障，且其雙層脂膜保護(hù)miRNAs 免受RNA 酶降解，顯著增加miRNAs 的穩(wěn)定性。近年來眾多學(xué)者逐漸轉(zhuǎn)向外泌體miRNAs 與糖尿病微血管并發(fā)癥的診斷、監(jiān)測和治療的研究。雖然外泌體miRNAs 在糖尿病微血管病變中的研究是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)，但特異性miRNAs 的分選、裝載、轉(zhuǎn)運(yùn)及對受體細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，外泌體miRNAs 將為糖尿病微血管并發(fā)癥的預(yù)防、診斷和治療帶來新的策略。

作者貢獻(xiàn)聲明劉瀅 文獻(xiàn)查閱，制圖，論文構(gòu)思、撰寫和修訂。張力 綜述修訂和審校。楊葉虹 綜述構(gòu)思、修訂和審校。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。