陳紫悅 劉 帥 杜婉潔 童 芳 王蕓蕓 華領(lǐng)洋 宮 曄， 韓清見△

（1復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院-醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點實驗室 上海 200032； 2復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)前沿科學(xué)中心 上海 200032；3復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 4神經(jīng)外科 上海 200040）

周圍神經(jīng)系統(tǒng)（peripheral nervous system，PNS）對于哺乳動物的生命活動必不可少，它調(diào)控著腺體的分泌，胃腸道的蠕動，呼吸和心跳，是外周器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)連接的橋梁［1-2］。在解剖學(xué)上，PNS 由感覺神經(jīng)和運動神經(jīng)這兩類神經(jīng)組成。感覺神經(jīng)可進一步分為軀體感覺神經(jīng)和內(nèi)臟感覺神經(jīng)，前者的胞體位于背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）或三叉神經(jīng)節(jié)（trigeminal ganglion，TG）中，后者的胞體位于頸靜脈神經(jīng)節(jié)、DRG 或TG 中［3］；運動神經(jīng)由胞體位于脊髓前角的軀體運動神經(jīng)和內(nèi)臟運動神經(jīng)組成。內(nèi)臟運動神經(jīng)也稱為植物神經(jīng)，包括交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)。交感神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)元的胞體聚集在脊柱旁的交感神經(jīng)節(jié)（sympathetic ganglion，SG）中，而支配內(nèi)臟的副交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的胞體則位于迷走神經(jīng)節(jié)（nodose ganglion，NG）中［3］。然而，由于這些神經(jīng)節(jié)體積小，分布分散，結(jié)構(gòu)致密，加之已知分子標記有限，利用現(xiàn)有的病毒或轉(zhuǎn)基因工具很難特異性操縱這些神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元。

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）是一種無包膜的單鏈線性DNA 病毒，屬于依賴細小病毒屬，不能獨立復(fù)制。其直徑約為20 nm，基因組大小約為4.7 kb，末端有145 個堿基組成的反向末端重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITRs）［4-5］。 自1982 年重組AAV2 首次建立以來，因其多樣化的優(yōu)勢得以廣泛用于動物體內(nèi)實驗，以將外源基因轉(zhuǎn)移到動物細胞和組織中［6-7］。目前已發(fā)現(xiàn)100 多種AAV 變體，神經(jīng)科學(xué)研究中常用其血清型1、2、5、6、8、9。由于其具有組織嗜性，不同血清型的AAV對同一組織的感染效率存在較大差異［8-9］。此外，AAV 的遞送方式也會影響AAV 介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)移效率。有研究表明，鞘內(nèi)注射重組AAV 在脊髓中的感染效率比外周器官高10 倍，而靜脈注射則相反［10］。因此，除了適當(dāng)?shù)腁AV 血清型和啟動子啟動靶基因外，優(yōu)化的遞送方式可以取得更好的感染效果。

近年來，研究人員開發(fā)了多種AAV 傳遞到DRG 神經(jīng)元的方法，如鞘內(nèi)注射、DRG 注射、神經(jīng)內(nèi)注射AAV2/6，AAV5，AAV6，AAV8，AAV2/9［11-13］。雖然這些方法感染效率高，但侵入性手術(shù)往往導(dǎo)致神經(jīng)周圍組織或初級感覺神經(jīng)元創(chuàng)傷，嚴重干擾疼痛測試或其他行為測試。皮下注射、肌內(nèi)注射AAV2/6 基本無創(chuàng)，但DRG 神經(jīng)元感染效率較低，阻礙了其進一步應(yīng)用［14］。P0 小鼠腹腔注射AAV2/9可將基因轉(zhuǎn)移到DRG 神經(jīng)元，感染效率又高［15］，但在其他神經(jīng)節(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)臟器官的感染特異性尚不明確。

我們對出生0 天的小鼠腹腔注射AAV2/9，發(fā)現(xiàn)僅外周神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元被特異性感染，如DRG 神經(jīng)元、TG 神經(jīng)元、NG 神經(jīng)元和SG 神經(jīng)元，而內(nèi)臟、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、腦和脊髓神經(jīng)元以及腸神經(jīng)系統(tǒng)很少被感染。這一發(fā)現(xiàn)為我們提供了一種將基因或shRNA 遞送到神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的有效途徑。

材 料 和 方 法

實驗動物C57BL/6 小鼠購自上海靈暢生物科技有限公司，分組飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部，光照12 h/黑暗12 h，溫度（22±1） ℃，自由獲取食物和水。未預(yù)先計算樣本量，樣本量的選擇基于我們先前類似的研究［16-17］，即組織學(xué)實驗所用小鼠每組不少于3 只，行為學(xué)實驗所用小鼠每組不少于5 只。所有動物實驗程序均經(jīng)復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準（批準號：20211018-002），并按照國家衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南進行。

P0 小鼠腹腔注射腹腔注射采用P0-P1 小鼠。注射前須將小鼠膀胱內(nèi)的尿液排盡，可用右手示指輕輕按壓小鼠腹部，并向尿道方向推數(shù)次，直到不再排出尿液。然后用左手固定小鼠，使小鼠呈仰臥位，暴露出腹部。右手持針，將針尖從小鼠右后肢上許處慢慢插入。待看見針尖全部沒入腹腔后推針，注射完成后緩慢拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)防止漏液。AAV 病毒滴度為（2～5）×1012vg/mL，注射劑量為10 μL。本研究所用病毒為pAAV-CAG-MCSEGFP-3FLAG［和元生物技術(shù)（上海）股份有限公司 ， AOV002］ 和 pAAV-CAG-hChR2-H134RtdTomato-WPRE-pA（上海泰兒圖生物科技有限公司，6253357）。

免疫組織化學(xué)免疫染色如文獻所述［16，18］。取樣小鼠深度麻醉后，經(jīng)升主動脈灌注1×PBS 和4%多聚甲醛（上海-國藥集團化學(xué)試劑有限公司，80096618）。取下組織和器官，4%多聚甲醛中4 ℃固定過夜，蔗糖（美國Sigma 公司，V900116）梯度脫水，然后在冰凍切片機（德國徠卡公司）上切成連續(xù)橫切面。切片厚度：腦和脊髓為30 μm，DRG、TG、NG、SG、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胰腺、皮膚、肺和腸為14 μm。用封閉緩沖液（1×PBS 配制：含10%山羊血清，美國Gibco 公司，16210072 ；0.1% Triton X-100，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，30188928）在37 ℃下封閉45 min，然后與一抗在4 ℃孵育過夜。本研究中使用的一抗如下：鼠抗NF200（1∶1 000，美國Millipore 公司，N2912），兔抗CGRP（1∶1000，美國Millipore 公司，C8198），兔抗TH（1∶1 000，美國Millipore 公司，ab152），兔抗GS（1∶1 000，英國Abcam 公司，ab49873）和兔抗P2X3（1∶1 000，美國Neuromics 公司，RA10109）。之后用1×PBS 洗滌，并與二抗在室溫下孵育2 h。使用的二抗如下：驢抗鼠IgG Alexa Fluor 555（美國Invitrogen 公司，A-31570，1∶400）和驢抗兔IgG Alexa Fluor 555（美國Invitrogen 公司，A-31572，1∶400）。DAPI（美國Invitrogen 公司，D1306，1∶1 000）用于標記細胞核，Nissl（美國Invitrogen 公司，N21479，1∶500）用于標記神經(jīng)元的胞體。1×PBS 洗滌后滴加固體封片劑封片，晾干后用激光共聚焦顯微鏡（日本尼康株式會社）掃描并采集圖像。

行為學(xué)測試疼痛行為測試按照紀如榮教授實驗室發(fā)表的方法進行［19］。使用波長為470 nm 的藍光（光電測量儀器，千奧星科南京生物科技有限公司）刺激小鼠后爪10 s。光強范圍為1～2.5 mW，刺激頻率為2 Hz、5 Hz 和10 Hz，間隔2 min。所有行為均用攝像機（日本佳能株式會社）記錄并回放。在小鼠接受單次刺激后10 s 內(nèi)計算小鼠抬、舉、抖、舔和跳的總時間。

離體DRG 膜片鉗記錄取樣小鼠麻醉后斷頭處死，暴露出脊髓與DRG?？焖俜蛛xDRG 用酶混合物（DNA 酶：0.1 mg/mL，DN25；胰酶：0.4 mg/mL，T8003；膠原酶：1 mg/mL，C9891；均為美國Sigma公司產(chǎn)品）在37 ℃下消化45 min。1 200 r/min 離心（離心半徑為8.4 cm）2 min（高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司，5424R）后用neurobasal 培養(yǎng)基（Gibco，10888022；含 10% 胎牛血清：Gibco，10091148；2% 雙抗：Gibco，15140122；2%B27：Gibco，17504044；均為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品）重懸細胞，吹吸混勻，通過100 μm 細胞過濾器（上海拓然生物科技有限公司，122104）制成單細胞懸液。接種在細胞爬片（世泰實驗器材有限公司，10211818C）上，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）中培養(yǎng)。使用Axopatch-700B 放大器和1550B 數(shù)模轉(zhuǎn)換器（美國Axon Instruments 公司）在室溫下進行全細胞膜片鉗記錄，使用波長為483 nm 的藍光刺激離體DRG 神經(jīng)元，記錄不同頻率（1、2、5、10、20 Hz）下的內(nèi)向電流和膜電位變化情況。數(shù)據(jù)采集和分析使用pClamp 10（美國Axon Instruments 公司）。

定量和統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)均用±s表示。柱狀圖中的點表示每只小鼠或每張圖像的單個值，水平線表示平均值。使用Prism 8.0 進行統(tǒng)計分析，采用雙因素方差分析（two-way ANOVA）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 感染神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元為了探究AAV2/9 對神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的感染效率，我們于2 個月后處死P0 腹腔注射AA2/9-EGFP 的小鼠取材，并檢測了EGFP 在DRG、NG、TG 和SG 中的表達。結(jié)果顯示，69.11%±1.42%的DRG 神經(jīng)元，32.46%±1.81%的NG 神經(jīng)元，7.08%±1.16%的TG 神經(jīng)元和4.76%±0.29%的SG 神經(jīng)元被感染（圖1A～C）。此外，神經(jīng)節(jié)內(nèi)的衛(wèi)星膠質(zhì)細胞（圖1D）、固有免疫細胞或內(nèi)皮細胞很少被感染。這些數(shù)據(jù)表明，AAV2/9 通過腹腔注射給P0 小鼠可感染神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，并趨向感染DRG 和NG 中的神經(jīng)元。

圖1 免疫熒光檢測P0 腹腔注射AAV2/9 小鼠各神經(jīng)節(jié)中EGFP 的表達Fig 1 Immunofluorescence detection of EGFP expression in the ganglia of mice injected with AAV2/9 intraperitoneally at P0

P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 感染DRG 神經(jīng)元時無細胞類型特異性DRG 由許多不同類型的神經(jīng)元組成［20］，可通過免疫染色不同的分子標記物來區(qū)分。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）可標記肽能神經(jīng)元；三磷酸腺苷受體P2X3可標記非肽能神經(jīng)元；神經(jīng)絲重鏈200 可標記大直徑和有髓鞘的低閾值機械感受器（low threshold mechanoreceptors，LTMRs）或 Aδ/Aβ -LTMRs；酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）可標記小直徑C 纖維-LTMRs［20］。結(jié)果顯示，17.05%±1.24% 的EGFP+神經(jīng)元表達CGRP，27.95%±1.57%的EGFP+神經(jīng)元表達P2X3，18.00%±1.60%的EGFP+神經(jīng)元表達NF200，9.15%±1.78% 的EGFP+神經(jīng)元表達TH（圖2A～B）。此外，50.08%±2.22% 的CGRP+DRG 神經(jīng)元，55.66%±2.79% 的P2X3+DRG 神經(jīng)元，53.25%±3.33%的NF200+DRG神經(jīng)元和41.15%±6.93%的TH+DRG 神經(jīng)元表達EGFP（圖2A、2C）。這些結(jié)果表明，P0小鼠腹腔注射AAV2/9 可以高效感染神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元且無神經(jīng)元亞型偏好。

圖2 免疫熒光檢測P0 腹腔注射AAV2/9 小鼠DRG 中不同神經(jīng)元標記物的表達Fig 2 Immunofluorescence detection of the expression of different neuronal markers in DRG of mice injected with AAV2/9 intraperitoneally at P0

P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元感染效率極低為了探究P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 是否特異性感染神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，我們檢測了2 月齡小鼠全腦和不同脊髓節(jié)段中EGFP 的表達。結(jié)果顯示，在海馬區(qū)（hippocampus，HIP）和初級軀體感覺皮層（primary somatosensory cortex，S1）中只有少數(shù)神經(jīng)元是EGFP+，而在在薄束核、前庭核和蒼白球等切面中，只能檢測到EGFP+神經(jīng)纖維，未檢測到神經(jīng)元胞體（圖3）。在脊髓的不同節(jié)段，如頸段、腰段和骶段，神經(jīng)元胞體聚集的灰質(zhì)中僅檢測到EGFP+纖維。這些纖維主要分布在脊髓背側(cè)，可能是被感染的DRG 神經(jīng)元向中樞的投射。白質(zhì)中存在大量EGFP+神經(jīng)纖維，特別是在楔束和薄束上行的后索中（圖4A、4B）。這些纖維是DRG中低閾值機械感受器向中樞的投射，編碼紋理和精細觸覺［21-22］。此外，我們還檢測了皮膚中的感染情況，同樣發(fā)現(xiàn)只有EGFP+的神經(jīng)纖維，局部的皮膚細胞或免疫細胞則都未被AAV2/9 感染（圖4C）。這些數(shù)據(jù)表明，P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 可特異性感染神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，特別是DRG 和NG。

圖3 免疫熒光檢測P0 腹腔注射AAV2/9 小鼠腦中EGFP 的表達Fig 3 Immunofluorescence detection of EGFP expression in the brain of mice injected with AAV2/9 intraperitoneally at P0

P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 可用于操縱DRG 神經(jīng)元近年來，化學(xué)遺傳學(xué)和光遺傳學(xué)都已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域［23］。我們對P0 小鼠腹腔注射了AAV2/9-ChR2（H134R）-Tdtomato，病毒滴度為5×1012vg/mL， 使 光 敏 感 通 道 蛋 白（channelrhodopsin-2，ChR2）［24-25］特異性感染DRG 中的傷害性感受器。小鼠成年后，我們?nèi)RG 神經(jīng)元離體培養(yǎng)，當(dāng)用483 nm 的藍光照射時，被感染的DRG 神經(jīng)元自發(fā)熒光（圖5A）。用不同頻率（1、2、5、10、20 Hz）的藍光刺激，均可誘導(dǎo)出DRG 神經(jīng)元的內(nèi)向電流和膜電位變化（圖5B）。同時，我們還進行了疼痛行為測試，將小鼠后爪暴露于不同強度和刺激頻率的藍光10 s，這些小鼠出現(xiàn)了光強度和刺激頻率依賴性的疼痛反應(yīng)，包括退縮、抬爪、舔舐行為（圖5C）。這些數(shù)據(jù)表明，P0 小鼠腹腔注射時，傷害性感受器被AAV2/9 感染并表達ChR2，該方法可用于疼痛研究。此外，對于一些特異性表達Cre的小鼠，可以通過化學(xué)遺傳學(xué)或光遺傳學(xué)來操縱DRG 神經(jīng)元的不同亞群，研究它們在疼痛信號傳遞中的作用和機制。

P0 小鼠腹腔注射AAV2/9 對內(nèi)臟器官感染效率極低我們檢測了小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸等臟器細胞的感染情況。結(jié)果顯示，在腎臟、脾臟、胰腺和腸道中幾乎未檢測到EGFP+細胞（圖6A～6D），但在結(jié)直腸周圍發(fā)現(xiàn)了一些EGFP+神經(jīng)纖維（圖7D）。此外，有少量的肝細胞、肺細胞和心肌細胞被感染（圖7A～7C）。

圖6 免疫熒光檢測P0 腹腔注射AAV2/9 小鼠腎等外周器官中EGFP 的表達Fig 6 Immunofluorescence detection of EGFP expression in peripheral organs such as kidney of mice injected with AAV2/9 intraperitoneally at P0

圖 7 免疫熒光檢測P0 腹腔注射AAV2/9 小鼠肝等外周器官中EGFP 的表達Fig 7 Immunofluorescence detection of EGFP expression in peripheral organs such as liver of mice injected with AAV2/9 intraperitoneally at P0

為了進一步驗證我們的結(jié)論，我們采用了不同數(shù)量級的病毒滴度觀察比較，分別為稀釋后的5×1010vg/mL、5×1011vg/mL 以及病毒原液1.4×1013vg/mL。P0 小鼠腹腔注射4 周后灌流取材，切片染色。結(jié)果顯示，當(dāng)注射劑量統(tǒng)一為10 μL、病毒滴度為5×1010vg/mL 時，各外周神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、中樞系統(tǒng)神經(jīng)元、皮膚和內(nèi)臟器官幾乎無感染（附圖1）。當(dāng)病毒滴度為5×1011vg/mL 時，AAV2/9 感染模式與前述一致，不過感染效率較低且綠色熒光微弱（附圖2），雖然我們在采集圖像時可以通過提高激光強度與增益來提高顯示的熒光亮度，但較低的感染效率不利于后續(xù)實驗的開展。當(dāng)病毒滴度為1.4×1013vg/mL 時，綠色熒光明顯，感染模式與前述基本一致，但過高的病毒滴度不僅價格昂貴，而且可能出現(xiàn)非特異性感染（附圖3）。綜合考慮，我們進行P0 小鼠腹腔注射AAV 時，選取了1012數(shù)量級，實驗結(jié)果良好且效益最大。

總之，這些數(shù)據(jù)表明，在P0 小鼠上腹腔注射AAV2/9 可以特異性感染神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，尤其是DRG 神經(jīng)元和NG 神經(jīng)元。這為我們研究這些神經(jīng)元中的基因表達的作用和機制，以及DRG 或NG對其他器官的調(diào)控提供了有力的工具。

討 論

周圍神經(jīng)系統(tǒng)是連接外周器官和腦的紐帶，調(diào)節(jié)著眾多的生命過程，其胞體主要聚集在神經(jīng)節(jié)中，如DRG、TG、NG 和SG 等［26-29］。神經(jīng)科學(xué)家，免疫學(xué)家和細胞生物學(xué)家越來越關(guān)注神經(jīng)系統(tǒng)與其他器官之間的相互作用，因此迫切需要開發(fā)新的工具或方法，將基因、shRNA 或其他基因修飾工具專門傳遞到這些神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中。這將使我們能夠輕松地操縱這些神經(jīng)元來研究它們本身及其與外周器官的相互作用。AAV 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移為我們提供了一種強有力的工具，以血清型嗜性的方式將基因或shRNA 有效遞送到多種組織和細胞類型中［30］。然而，分散的位置和緊湊的結(jié)構(gòu)使得它們很難被病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移靶向［26，31-32］。 在本項研究中，我們建立了一種新的方法，即在P0 小鼠腹腔內(nèi)注射AAV2/9［滴度為（2～5）×1012vg/mL，劑量=10 μL］。該方法能特異性感染神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，但很少影響外周器官或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元。這使得在這些神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中特異性過表達或敲低某種基因，或者使用光遺傳學(xué)或化學(xué)遺傳學(xué)工具以研究它們與其他器官的相互作用成為可能。

為了將基因或shRNA 遞送到DRG 神經(jīng)元，目前已經(jīng)有幾種途徑，包括系統(tǒng)性注射（如靜脈注射）和局部注射（如鞘內(nèi)注射，DRG 注射，神經(jīng)內(nèi)注射）。然而，這些遞送方法的局限性嚴重阻礙了其靶向DRG 神經(jīng)元的使用。直接DRG 注射、神經(jīng)內(nèi)注射和鞘內(nèi)注射可導(dǎo)致18%～48%的高感染效率［33-34］，但這些侵入性方法往往導(dǎo)致神經(jīng)損傷，嚴重干擾后續(xù)的行為測試［33］。對P0 小鼠腹腔注射AAV 是無創(chuàng)的，感染率達到約70%，顯著高于以往的方法（圖2）。

我們也檢測了其他神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的感染情況，結(jié)果表明只有7.08%的TG 神經(jīng)元和4.76%的SG神經(jīng)元被感染，而有超過30.46%的NG 神經(jīng)元被感染（圖1）。今后可以利用這種方法并結(jié)合光遺傳學(xué)，研究NG 神經(jīng)元中表達的基因功能以及副交感神經(jīng)在調(diào)節(jié)外周器官中的作用。我們還檢測了AAV 在腦和脊髓中的感染情況，結(jié)果顯示脊髓和腦中感染的局部神經(jīng)元很少。有趣的是，我們在脊髓不同節(jié)段背角的淺層和深層以及背柱中都發(fā)現(xiàn)了大量的EGFP+神經(jīng)纖維，這也表明DRG 神經(jīng)元存在普遍感染（圖3～4）。而脾、腸、腎和胰腺等內(nèi)臟器官感染效率極低（圖6～7）。

AAV 常被用作治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的工具［35］。P0 小鼠腹腔注射可以特異性靶向DRG 或NG 相關(guān)的遺傳?。?7，36-37］。這種遞送方法的基因治療存在一個缺點，它不適合治療慢性疼痛和慢性瘙癢，比如我們不可能給新生兒注射AAV 來預(yù)防他們長大后的疼痛或瘙癢。

綜上，我們建立了一種無創(chuàng)的AAV 遞送方法，該方法可以高效地特異性感染DRG 神經(jīng)元和NG神經(jīng)元，為專注于DRG 和NG 的科學(xué)家或研究周圍神經(jīng)系統(tǒng)與外周器官相互作用的科學(xué)家提供了一種新的系統(tǒng)藥物遞送方法。

作者貢獻聲明陳紫悅 冰凍切片，免疫組織化學(xué)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，論文撰寫。劉帥 電生理，行為學(xué)測試。杜婉潔 收集實驗樣本。童芳 P0小鼠腹腔注射。王蕓蕓，華領(lǐng)洋 論文修訂。宮曄，韓清見 論文構(gòu)思和修訂，研究指導(dǎo)。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。