程姜鋌 林文耀 張思弘 許培榕 黃嘉琪 何敏坷 李耀輝 程 捷 王 杭△

（1復旦大學附屬中山醫(yī)院泌尿外科 上海 200032； 2上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院泌尿外科 上海 200032；3上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院泌尿外科 上海 201100）

老年人群中的良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是膀胱出口梗阻的常見誘因。據(jù)統(tǒng)計，BPH 在60 歲以上老年男性中，良性前列腺增生的發(fā)生率高達50%，至80 歲時，其發(fā)生率可達80%［1］。第七次全國人口普查結果顯示：65歲及以上人口為1.9 億人，占總人口的13.50%，較第六次人口普查增加4.63%。隨著社會人口的老齡化，老年性疾病成為人們關注的焦點之一。

膀胱出口部分梗阻（partial bladder outlet obstruction，pBOO）是臨床上BPH 常導致的繼發(fā)疾病，長時間的pBOO 容易發(fā)生逼尿肌功能障礙，繼而引起相應臨床癥狀。目前治療BPH 的主要方法為解除膀胱出口的梗阻，往往會忽視對逼尿肌功能障礙。據(jù)報道，約50%的BPH 患者合并膀胱不穩(wěn)定，其中約30%的患者由于長期梗阻造成的逼尿肌功能障礙，在接受治療后臨床癥狀不能有效緩解［2］，因此成為治療上的難點。學界仍缺乏對此過程中逼尿肌超微結構變化的深層次探究，因此在臨床實踐中依舊缺乏恢復長時間梗阻后膀胱功能的有效治療手段。

新西蘭雄性白兔膀胱構造同人體具有一定相似性，在既往研究中多次用于pBOO 模型的構建，以研究長期梗阻之后逼尿肌功能變化。在本次研究中，我們應用新西蘭雄性白兔建立pBOO 動物模型，在梗阻一定期限后解除梗阻，進行膀胱逼尿肌功能學與形態(tài)學實驗，以探討繼發(fā)于pBOO 后逼尿肌超微結構的變化，從微觀層面解釋其功能學的變化。

材 料 和 方 法

實驗動物分組依據(jù)隨機分組原則，將情況相近的24 只新西蘭雄性白兔隨機分為3 組（對照組、梗阻2 周組、梗阻解除組）。實驗動物由復旦大學附屬中山醫(yī)院動物房提供，實驗兔平均體重約為3 kg。對照組僅進行假手術操作，即僅打開和縫合下腹部，其余兩組實驗動物均制成pBOO 動物模型，梗阻組在梗阻2 周后處死，梗阻解除組梗阻2 周后解除梗阻并繼續(xù)飼養(yǎng)3周。

建立pBOO 動物模型［3］利用戊巴比妥（10 mg/kg）試劑麻醉雄性新西蘭兔，將其固定于實驗操作臺。于下腹部做恥骨上正中切口，暴露雄兔膀胱及頸部結構。用周長為2 cm 的1-0 絲線圈套結扎膀胱頸口，構建pBOO 動物模型。手術結束后，將切口分兩層逐步縫合，將實驗兔送入動物房飼養(yǎng)。2 周后，依據(jù)前述步驟沿原手術入路再次暴露雄兔膀胱頸，拆除膀胱頸部的結扎線，隨后縫合手術切口。

兔膀胱容量和重量的測定在戊巴比妥麻醉狀態(tài)下對實驗兔進行膀胱容量測試。將8F 導尿管插入膀胱后，持續(xù)以50～60 cm H2O （1 cm H2O=0.098 kPa，下同）的壓力灌注生理鹽水。待導尿管發(fā)生溢尿時，記錄此刻的生理鹽水灌注量并將其視為膀胱最大容量。在測定完畢后處死實驗兔，打開下腹并取出膀胱，剔除膀胱周圍脂肪組織和結締組織，將其置于天平上稱量。

逼尿肌超微結構的觀察和測量取膀胱體部的逼尿肌組織，于4 ℃中制成多個1 mm×1 mm 的小塊，使用2.5%戊二醛溶液固定標本。使用透射電子顯微鏡（型號：PHILIPS CM 120）于6×103倍和2×104倍下分別觀測內質網(wǎng)和線粒體。使用Imagine Too 對電鏡圖像進行分析，最高密度設定為255，最低密度設定為0。對每個視野單位內細胞核周圍的粗面內質網(wǎng)的面積進行觀測，連續(xù)測量5～7個視野。內質網(wǎng)測量完畢后將放大倍數(shù)切換至2×104，于不同的視野下取15 個線粒體，并在這些線粒體結構中選擇20 個觀測點，測量觀測點中的線粒體平均密度。于細胞質中選擇60 個觀測點計算細胞質平均密度，將線粒體平均密度除以細胞質平均密度，計算得到線粒體的相對密度，借此來排除曝光時間對線粒體密度測量造成的誤差。

膀胱逼尿肌束的收縮實驗將兔膀胱標本縱向剖開，并于輸尿管嵴上方切取長約1.0 cm、寬約0.2 cm 的兩條縱向逼尿肌束。將肌束浸泡于Tyrode 緩沖液中，用95%O2與5%CO2混合氣體平衡。將張力換能器同肌束的一端連接，以實時記錄肌束收縮力的變化。以2 g 張力靜息平衡30 min 后，將電極同肌肉束連接，并施加1～32 Hz 的電場刺激，使用雙向方形脈沖波，80 V持續(xù)電壓0.5 ms，刺激肌束20 s，兩次刺激間隙2 min。在不同的溶液環(huán)境下進行重復測試（Tyrode 緩沖液、阿托品液0.05 mmol/L），即高K＋環(huán)境（［K＋］＝120 mmol/L），ATP 環(huán)境（0.1 mmol/L），低Ca2+環(huán)境（［Ca2+］=0 mmol/L），從而確定肌束在不同環(huán)境下的反應性。每次測試前用新鮮緩沖液洗滌肌束3 次。記錄肌束的最大張力、最大張力速度，將其作為肌肉反應性特征。

統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均使用STATA 16.0 軟件進行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，所有實驗均重復3 次以上。實驗數(shù)據(jù)組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間數(shù)據(jù)使用單因素方差分析法（ANOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

膀胱的重量和容量對照組、梗阻解除組、梗阻組兔膀胱重量分別為（3.94±0.53）g、（12.43±2.72）g、（15.75±3.87）g。膀胱容量分別為（98.16±18.71）mL、（57.43±6.02）mL、（48.43±16.83）mL。對照組相較于其余兩組膀胱重量明顯降低（P＜0.01），且膀胱容量增大（P＜0.01），而梗阻組與梗阻解除組的膀胱重量和容量未發(fā)現(xiàn)明顯差異。

逼尿肌束收縮功能為便于分析，僅比較30 Hz 電場刺激下兔肌束的最大張力及最大張力速度。最大張力以g/100 mg 膀胱肌肉組織表示，最大張力產(chǎn)生速度以g·s-1·100 mg-1膀胱肌肉組織表示（表1、表2）。

表1 30 Hz 刺激下單位重量逼尿肌最大收縮速度Tab 1 Maximum contraction velocity per unit weight detrusor under 30 Hz stimulation（±s）

表1 30 Hz 刺激下單位重量逼尿肌最大收縮速度Tab 1 Maximum contraction velocity per unit weight detrusor under 30 Hz stimulation（±s）

P value was compared between control and relief groups.

Group Control Relief Obstruction P Maximum contraction velocity （g·s-1·100 mg-1）High K+0.081±0.067 0.035±0.017 0.014±0.004＜0.05 Tyrode 0.842±0.531 0.161±0.042 0.043±0.045＜0.01 ATP 0.453±0.302 0.084±0.057 0.042±0.032＜0.01 Atropine 0.624±0.573 0.123±0.032 0.034±0.024＜0.01 Ca2+-free 0.143±0.084 0.092±0.067 0.044±0.024 0.079

表2 30 Hz 刺激下單位重量逼尿肌最大張力Tab 2 Maximum tension power per unit weight detrusor under 30 Hz stimulation（±s）

表2 30 Hz 刺激下單位重量逼尿肌最大張力Tab 2 Maximum tension power per unit weight detrusor under 30 Hz stimulation（±s）

P value was compared between control and relief groups.

Group Control Relief Obstruction P Maximum tension power （g/100 mg）High K+0.373±0.204 0.242±0.052 0.175±0.043＜0.05 Tyrode 1.672±0.848 0.582±0.286 0.348±0.073＜0.01 ATP 0.965±0.427 0.434±0.181 0.242±0.034＜0.01 Atropine 1.286±0.604 0.471±0.153 0.248±0.057＜0.01 Ca2+-free 0.435±0.396 0.453±0.124 0.273±0.054 0.1427

對照組、梗阻解除組單位重量逼尿肌最大收縮速度和最大張力明顯大于梗阻組（P＜0.05），除在無鈣液中對照組單位重量逼尿肌最大收縮速度及最大張力與梗阻解除組無明顯差異外，在其他溶液中對照組都明顯大于梗阻解除組，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

內質網(wǎng)和線粒體形態(tài)梗阻組和梗阻解除組核周圍內質網(wǎng)相對于對照組均發(fā)生明顯擴張（圖1）。梗阻組線粒體發(fā)生明顯的水腫，相對密度降低，相對于對照組更為稀疏（圖2）。

圖1 電子顯微鏡下對照組（A）、梗阻解除組（B）、梗阻組（C）逼尿肌細胞內的內質網(wǎng)（×6 000）Fig 1 The endoplasmic reticulum in the detrusor cells of control group （A）， relief group （B） and obstruction group （C） under the electron microscope （×6 000）

圖2 電子顯微鏡下對照組（A）、梗阻解除組（B）、梗阻組（C）逼尿肌細胞內的線粒體（×20 000）Fig 2 The mitochondria in the detrusor cells of control group （A）， relief group （B） and obstruction group （C）under the electron microscope （×20 000）

粗面內質網(wǎng)面積觀測視野面積為108.02～114.25 μm2。 其中對照組平均內質網(wǎng)面積為（0.189±0.140）μm2，梗阻組為（3.204±2.281）μm2，梗阻解除組為（2.740±1.232）μm2。梗阻組及解除梗阻組內質網(wǎng)平均面積均明顯大于對照組，且兩組之間差異無統(tǒng)計學意義。

線粒體相對密度對照組線粒體平均相對密度為1.645±0.276，梗阻組為0.832±0.197，梗阻解除組為1.253±0.084。梗阻組的線粒體相對密度明顯下降，且低于其他兩組，對照組的線粒體相對密度最大。

討 論

由于BPH 患者的膀胱功能障礙多繼發(fā)于pBOO，在應用手術或藥物解除pBOO 后，逼尿肌功能是否恢復是令人關心的問題。在兔pBOO 模型中，梗阻2 周后解除梗阻，2～4 周后其膀胱功能可以恢復至正常水平［4］。長時間的膀胱梗阻會造成實驗兔膀胱功能不可逆的受損：經(jīng)過8 周pBOO 后，膀胱功能隨著恢復時間增長逐漸好轉，但始終低于正常水平［5］。學界關于解除梗阻后逼尿肌恢復時間仍有爭論，但多以2 周為主要觀點，因此本實驗認為解除梗阻后3 周兔逼尿肌恢復已較為完全。本研究以新西蘭白兔制成pBOO 動物模型，于梗阻2 周后解除梗阻模擬人類BPH 患者治療后的情況，觀察逼尿肌功能的恢復情況。結果顯示：在膀胱出口梗阻2 周后解除梗阻3 周，其逼尿肌功能可以部分恢復，單位重量逼尿肌的最大張力及最大張力速度在臺氏液及各種溶液中皆明顯大于梗阻2 周組。但是這種恢復作用是不完全的，梗阻解除組的膀胱重量及容量較梗阻組并未好轉；梗阻解除組的膀胱逼尿肌功能在3 周后并不能恢復至正常水平，僅在無鈣液中和對照組的收縮功能比較無顯著性差異。這是由于在逼尿肌細胞中，鈣是介導粗細肌絲耦合，引起肌肉收縮的重要離子［6］，無論是對照組或是梗阻解除組膀胱逼尿肌的細胞在無鈣液中都不能有效收縮。

由于本研究中制成的動物模型是嚴重梗阻模型，在2 周梗阻后其逼尿肌的病理生理改變已進入失代償期，而當膀胱功能進入失代償期后，其部分變化已不可逆。從而造成逼尿肌功能無法完全恢復。由此可見，BPH 患者治療后（解除梗阻后），其逼尿肌的功能恢復不僅與梗阻的時間有關，而且與梗阻的嚴重程度相關。在梗阻時，逼尿肌細胞內的線粒體酶活性明顯下降，而解除梗阻后大部分酶活性可以恢復至正常水平，同時線粒體自噬標志物Bnip3 和LC3B-II 也表現(xiàn)出上升趨勢［7］。這可能與逼尿肌功能無法完全恢復有關。Chai 等［8］動物實驗證實，部分動物解除pBOO 后，其排尿癥狀無明顯好轉，膀胱測壓提示仍然存在出口梗阻，但是尿道灌注測壓證實無梗阻存在，我們認為存在“功能性pBOO”，即膀胱功能障礙。

本次實驗中，我們?yōu)檫M一步測觀測增生逼尿肌細胞內部的超微結構變化，使用透射電鏡對逼尿肌組織標本進行掃描觀察，希望能在亞顯微層次發(fā)現(xiàn)逼尿肌增生背后的超微結構變化。梗阻組中粗面內質網(wǎng)的面積增加，提示其合成蛋白質的功能得到了加強，處于相對活躍狀態(tài)；而梗阻解除組內質網(wǎng)面積相較于梗阻組有所回落，但仍然大于對照組。內質網(wǎng)作為細胞內蛋白質合成的主要場所，在細胞蛋白大量合成時會發(fā)生形態(tài)改變。Sw?rd 團隊對膀胱梗阻后的大鼠膀胱平滑肌進行檢測，發(fā)現(xiàn)其內質網(wǎng)擴展超過10 倍，且高爾基體也發(fā)生了擴張［8］。本研究中，由于pBOO，逼尿肌細胞需要合成大量的蛋白以滿足自身增生需要，因此必定會引發(fā)細胞內粗面內質網(wǎng)合成功能的增強。結合后續(xù)逼尿肌的功能學實驗，我們有理由相信其內質網(wǎng)結構變化同肌束收縮功能改變有所關聯(lián)。

膀胱逼尿肌增生不可避免地會對其內在線粒體微環(huán)境造成影響。有研究報道，逼尿肌內部線粒體的腫脹程度和結構破壞隨著梗阻嚴重程度的提升而增加［9］。此外，線粒體內部的三羧酸循環(huán)酶活性也會隨水腫而活力降低，從而減少了能量產(chǎn)出。Lin 等［10］在對梗阻后膀胱逼尿肌進行了線粒體酶活性測試，發(fā)現(xiàn)在梗阻2 周后，逼尿肌的收縮反應明顯降低。在進一步探究分子層面變化后發(fā)現(xiàn)，逼尿肌三羧酸循環(huán)中大部分酶活性均降低，且琥珀酸細胞色素還原酶水平發(fā)生了不可逆轉的損傷，這均會對線粒體的產(chǎn)能造成極大影響。Zhu 等［11］則對梗阻后線粒體功能進行檢測，結果表明線粒體基線耗氧率和最大耗氧率相較于無梗阻組均出現(xiàn)了明顯下降，提示線粒體氧化功能受損。本實驗發(fā)現(xiàn)兔梗阻組逼尿肌細胞中線粒體發(fā)生水腫且相對密度明顯下降，這一趨勢在解除梗阻后得到了改善。這一變化特點同肌束的功能學變化存在一定的相關性，線粒體的形態(tài)完好與否與逼尿肌收縮功能相關聯(lián)。pBOO 后的膀胱逼尿肌變化復雜多樣，除線粒體與內質網(wǎng)外，也有研究提示在梗阻后膀胱逼尿肌超微結構中存在大量細胞間隙，促進了相鄰細胞膜的去極化和廣泛的細胞間電通信，造成膀胱過度活動癥［12］。

臨床上由于長期排尿困難、反復尿潴留而行手術治療的患者往往由于長期的pBOO 導致膀胱功能的失代償，應注意到術后逼尿肌功能的恢復問題。在對BPH 患者進行治療時，不僅要注意到出口梗阻的解除，更為重要的是在治療前了解逼尿肌的功能狀態(tài)，對其受損程度進行評價，以客觀估計治療后尤其是手術后膀胱功能恢復的可能，采取綜合治療方案，在解除梗阻的同時，根據(jù)不同的逼尿肌功能狀態(tài)采用針對性治療措施，以獲得最佳的臨床療效。

本研究存在以下不足：（1）對兔pBOO 模型中梗阻前后的細胞微環(huán)境變化進行分析；（2）未涉及人體標本，降低了實驗結論的臨床外推可靠性。在本研究的基礎上，我們進一步探究pBOO 中的潛在機制。

作者貢獻聲明程姜鋌，林文耀 模型構建，數(shù)據(jù)采集，論文撰寫。張思弘，許培榕 文獻調研，論文修改。黃嘉琪，何敏坷 透射電子顯微鏡拍攝指導。李耀輝，程捷 逼尿肌電生理實驗指導。王杭 實驗設計和指導，論文撰寫和修改。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。