沈嘉銘 陶云珍 劉長鵬 馮 爽 王運中 薛 建張優(yōu)儀 趙根明，3 邵雪君 張 濤，3△

（1復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室/公共衛(wèi)生安全教育部重點實驗室 上海 200032；2蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科 蘇州 215003； 3上海市重大傳染病和生物安全研究院 上海 200032）

侵襲性肺炎鏈球菌性疾?。╥nvasive pneumococcal disease，IPD）指從正常無菌部位（如血、腦脊液、胸腹水或關(guān)節(jié)腔積液等）分離到肺炎鏈球菌的感染性疾病，如腦膜炎、胸膜炎、菌血癥和菌血癥性肺炎等［1］。IPD 在兒童中發(fā)病率和病死率均較高［2］，且機體健康狀況、抗菌藥物的使用情況、地區(qū)所流行的血清型等因素也會影響其發(fā)生率［3］。據(jù)估計，我國每100 萬名5 歲以下兒童中約有30 000 例死于IPD，疾病負擔(dān)嚴(yán)重［4］。肺炎球菌結(jié)合疫苗（13-valent pneumococcal conjugate vaccine，PCV13）是預(yù)防侵襲性肺炎鏈球菌感染的重要手段［5］。研究顯示，在歐美等將PCV 疫苗納入國家免疫計劃的國家，兒童PCV 疫苗的廣泛接種大幅降低了疫苗血清型引起的IPD 發(fā)病，但非疫苗血清型的占比逐漸升高，即血清型替換現(xiàn)象。PCV13 于2016 年11 月在我國作為二類疫苗獲批上市，各地區(qū)的接種率有所不同，在當(dāng)前的免疫策略下PCV13 接種是否會導(dǎo)致類似血清型替換現(xiàn)象尚不清楚。

蘇州作為中國東部發(fā)達地區(qū)的代表城市之一，擁有繁榮的經(jīng)濟和優(yōu)越的醫(yī)療條件，該地區(qū)的研究結(jié)果對華東地區(qū)及其他相似地區(qū)均具有較好參考價值。蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院是蘇州地區(qū)唯一一家三級甲等兒童?？漆t(yī)院，兒童住院總量占蘇州市轄區(qū)的65.2%，選擇該醫(yī)院開展研究，具有良好的人群代表性。因此，為了解PCV13 引入前后侵襲性菌株對常見藥物的敏感性和血清型分布的變化情況，本研究將分析2010—2020 年間從蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院就診患兒無菌部位標(biāo)本分離的肺炎鏈球菌菌株的流行病學(xué)特征、血清型分布及抗菌藥物敏感性情況，為兒童IPD 防治提供參考。

資 料 和 方 法

研究對象2010 年1 月—2020 年12 月期間就診于蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院患兒中，根據(jù)診療常規(guī)需要采集了正常無菌部位標(biāo)本如血液、腦脊液、胸腔積液、關(guān)節(jié)積液等，且病原菌培養(yǎng)為肺炎鏈球菌陽性者均為本研究的對象?；純旱娜丝趯W(xué)信息及菌株抗菌藥物藥敏結(jié)果，包括性別、年齡、就診時間、出院診斷等，通過查閱病歷進行回顧性收集。本研究獲得復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：IRB#2017-11-0646）。

菌株來源系統(tǒng)收集研究期間從患兒無菌部位標(biāo)本分離的肺炎鏈球菌菌株，并剔除從同一個患兒中分離的重復(fù)菌株。肺炎鏈球菌的判定標(biāo)準(zhǔn)為：（1）菌落特點：α 溶血，菌落中心凹陷呈“臍狀”；（2）奧普托欣實驗敏感；（3）膽汁溶菌試驗陽性［6］。分離的菌株用MicrobankTM磁珠凍存于-80 ℃冰箱，定期轉(zhuǎn)運至復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生安全教育部重點實驗室完成菌株的復(fù)蘇及血清分型。

藥敏試驗菌株藥敏試驗由蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科在患兒住院期間完成。通過 Kirby-Bauer 紙片擴散法測定肺炎鏈球菌菌株對利福平的敏感性，采用E-test 法測定紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、喹奴普丁/達福普汀、青霉素G、頭孢噻肟、氯霉素、阿莫西林、萬古霉素、左氧氟沙星和利奈唑胺對肺炎鏈球菌菌株的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。 Kirby-Bauer 紙片擴散法及E-test 法藥敏紙片和MH 瓊脂平板均購自英國OXOID 公司。藥敏試驗結(jié)果按照臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)進行判定［7］。將肺炎鏈球菌ATCC49619 作為質(zhì)控菌株。

血清分型將菌株從-80 ℃冰箱中取出，接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上進行復(fù)蘇培養(yǎng)，成功復(fù)蘇的菌株使用乳膠凝集試劑盒進行初篩確定血清群，然后進行莢膜腫脹反應(yīng)明確菌株的血清型。血清分型試劑（Pneumococcus Pool Antisera 和Pneumococcus Factor Serum）均購自丹麥國家血清研究所。

統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS26.0 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。采用聚類分析將菌株對抗菌藥物的敏感性分類。采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法比較不同標(biāo)本來源（腦脊液和血液等）、不同時間（2010—2016 年與2017—2020 年）分離的肺炎鏈球菌耐藥性、血清型及臨床特點差異，并比較青霉素敏感菌株（penicillin-susceptiblestreptococcus pneumoniae，PSSP）和青霉素不敏感菌株（penicillin nonsusceptiblestreptococcal pneumoniae，PNSP）對其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的敏感性及其與血清型的關(guān)聯(lián)。雙側(cè)P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

菌株基本信息2010—2020 年從就診患兒無菌部位標(biāo)本中共分離到215 株肺炎鏈球菌，分別為腦脊液61 株（28.4%）、血液139 株（64.7%）和胸水15 株（7.0%）。其中135株（62.8%）分離自2010—2016 年，80 株（37.2%）來自2017—2020 年。126 株（58.6%）來自男性患兒，89 株（41.4%）來自女性患兒。83.3%的菌株（179 株）分離自5 歲以下兒童。這215 名侵襲性肺炎鏈球菌疾病患兒中，55 例（25.6%）被診斷為腦膜炎（pneumococcal meningitis，PM）、160 例（74.4%）屬于血流感染。秋冬季發(fā)病者最多（秋季、冬季各占30.7%），春季次之（27.9%）。

藥敏試驗結(jié)果本研究收集的215 株肺炎鏈球菌菌株中，97%以上菌株對紅霉素和克林霉素耐藥，未檢測到對萬古霉素、左氧氟沙星和利奈唑胺耐藥的菌株（表1）。

表1 2010—2020 年蘇州地區(qū)兒童侵襲性肺炎鏈球菌藥敏試驗結(jié)果Tab 1 Results of antimicrobial susceptibility testing for invasive Streptococcus pneumoniae isolated from children in Suzhou from 2010 to 2020

根據(jù)菌株的耐藥特點，共發(fā)現(xiàn)30 種耐藥模式，僅有1 株（0.5%）分離株對13 種抗菌藥物均表現(xiàn)敏感，1 株（0.5%）僅對一類抗菌藥物（復(fù)方新諾明）耐藥，1 株（0.5%）對兩類抗菌藥物（紅霉素+克林霉素）耐藥，98.6%（212/215）的分離株均為多重耐藥。其中，最主要的耐藥模式為：紅霉素+克林霉素+四環(huán)素+復(fù)方新諾明+喹奴普汀+β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，占所有分離株的28.4%。

相比腦膜炎分離株，血流感染分離株對頭孢噻肟（39.4%vs.67.4%）和青霉素（28.2%vs.58.5%）的不敏感率更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＜0.001）。而血流感染分離株對喹奴普汀的不敏感率高于腦膜炎分離株（74.0%vs.63.0%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.4，P=0.123）。

與2010—2016 年分離株相比，2017—2020 年分離株對復(fù)方新諾明和頭孢噻肟的不敏感率顯著下降（76.3%vs.88.9%；35.0%vs.53.3%），且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.0，P=0.014；χ2=6.8，P=0.009）；而對喹奴普丁/達福普汀的不敏感率有所上升（75.6%vs.68.5%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.2，P=0.269），詳見圖1。

圖1 2010—2016 年與2017—2020 年肺炎鏈球菌分離株的耐藥情況Fig 1 Results of antimicrobial susceptibility testing for invasive Streptococcus pneumoniae between 2010-2016 and 2017-2020

血清型分布由于部分菌株丟失等原因，本研究成功復(fù)蘇并檢測了133 株（61.9%）菌株的血清型，其中包括85.5%腦膜炎病例分離株和53.8%的血流感染分離株。共檢出11 種血清型，其中最常見血清型為6B（21.8%），其次為14（21.1%）、19F（16.5%）、19A（15.8%）和23F（11.3%）。PCV7、PCV13 疫苗血清型覆蓋率分別為75.9%和93.2%。

血流感染病例分離株與腦膜炎病例分離株的血清型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=33.1，P＜0.001），腦膜炎病例分離株中血清型6B（29.8%vs.17.4%，χ2=2.04，P=0.153）和14（25.5%vs.18.6%，χ2=0.51，P=0.475）占比高于血流感染病例分離株，而血清型19F占比低于血流感染病例分離株（8.5%vs.20.9%，χ2=2.56，P=0.110），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 2010—2020 年蘇州地區(qū)兒童侵襲性肺炎鏈球菌血清型分布Tab 2 Serotype distribution of invasive Streptococcus pneumoniae isolated from children in Suzhou from 2010 to 2020 ［n（%）］

不同年份分離株的血清型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=37.8，P＜0.001），與2010—2016 年分離株相比，血清型6B（25.9%vs.0，χ2=5.52，P=0.019）和14（24.1%vs.4.8%，χ2=2.90，P=0.088）的占比在2017 年后顯著下降，而19F（13.4%vs.33.3%，χ2=3.75，P=0.053）和23F（7.1%vs.33.3%，χ2=9.65，P=0.002）卻顯著上升，且在2017 年后出現(xiàn)了非疫苗血清型6D（表2）。

菌株對青霉素的敏感性及其與血清型的關(guān)聯(lián)本研究的肺炎鏈球菌分離株對青霉素G 的總體不敏感率為35.9%，其中腦膜炎分離株的不敏感率為58.5%，血流感染分離株的不敏感率為28.2%。青霉素不敏感菌株對其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的不敏感率顯著高于青霉素敏感菌株，如阿莫西林（PNSPvs.PSSP：52.5%vs.16.7%，χ2=36.4，P＜0.001）和頭孢噻肟（PNSPvs.PSSP：88.0%vs.23.9%，χ2=92.9，P＜0.001）。

此外，PNSP 菌株中血清型19A、19F 和23F 的比例均高于PSSP 菌株，分別為24.5%vs.10.8%、20.4%vs.14.5% 和12.2%vs.10.8%。而PSSP 菌株中血清型6B 菌株所占的比例（25.3%）高于PNSP菌株（16.3%）。在PNSP 和PSSP 菌株中PCV13 疫苗血清型菌株所占比例分別為95.9%和91.6%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

侵襲性肺炎鏈球菌性疾病一般可分為肺炎鏈球菌血流感染及肺炎鏈球菌腦膜炎，常見于兒童、老年人及免疫缺陷患者［1］。本研究分析了蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2010 年1 月—2020 年12 月分離的215株侵襲性肺炎鏈球菌，發(fā)現(xiàn)PNSP 菌株檢出率為35.9%，常見血清型為6B、14、19F、19A 和23F，PCV13 疫苗血清型覆蓋率為93.2%。本研究中IPD患兒多為5 歲以下兒童（83.3%），以血流感染為主（74.4%），與國內(nèi)外報道一致［8-9］。

本研究發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌侵襲株對紅霉素、克林霉素耐藥率高達97%以上，而對萬古霉素、左氧氟沙星和利奈唑胺全部敏感，對氯霉素和利福平也高度敏感，與國內(nèi)研究相似［10］。這可能與大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物在國內(nèi)兒科中的大量使用有關(guān)，而萬古霉素并非臨床治療社區(qū)獲得性感染一線藥物，所受抗菌藥物壓力較小而較少發(fā)生耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)2017 年后分離株對多種抗菌藥物不敏感率較前有所下降，其中對復(fù)方新諾明、頭孢噻肟的不敏感率下降顯著，可能與近年來抗菌藥物的規(guī)范使用有關(guān)。同時，國外研究顯示，PCV 疫苗的廣泛接種在解決肺炎鏈球菌抗菌藥物耐藥性方面可能發(fā)揮重要作用［11］，但由于蘇州地區(qū)疫苗接種率較低，尚不清楚是否是由于PCV 疫苗的接種而引起抗菌藥物耐藥性的變化。

青霉素曾是治療肺炎鏈球菌感染的標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物，但目前肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥情況日趨嚴(yán)重。本研究中，肺炎鏈球菌侵襲株對青霉素的不敏感率為35.9%，其中腦膜炎菌株不敏感率為58.5%，非腦膜炎菌株不敏感率為28.2%，遠高于蘇州地區(qū)2017—2019 年兒童NIPD 分離株10.0%的不敏感率［12］。而在一項全國多中心研究中，2012—2017 年兒童侵襲性肺炎鏈球菌中腦膜炎和非腦膜炎菌株對青霉素的不敏感率分別為69.5% 和35.9%［13］，高于本研究，可能與不同地區(qū)抗菌藥物使用情況及流行菌株差異有關(guān)。腦膜炎菌株對青霉素的不敏感率更高可能是由于兩種菌株判斷標(biāo)準(zhǔn)不同所致，對于PM 患者，采用青霉素治療時使用更大劑量，因此CLSI 判定標(biāo)準(zhǔn)中，非PM 菌株青霉素MIC≤2 μg/mL 即為敏感，而PM 菌株青霉素MIC≤0.06 μg/mL 方為敏感［7］。多項研究顯示，抗菌藥物耐藥性與肺炎鏈球菌菌株血清型間有一定相關(guān)性［14-15］，其中19A、19F 及23F 菌株與抗菌藥物高耐藥性密切相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。本研究中PNSP 對其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物不敏感率顯著高于PSSP，PNSP 相比PSSP 對復(fù)方新諾明的不敏感率也更高，且多重耐藥率高達98.6%，可見抗菌藥物間交叉耐藥及多重耐藥問題需加以重視。

研究顯示，有限數(shù)量的血清型導(dǎo)致了全球大部分5 歲以下兒童IPD 的發(fā)生，其中血清型1、5、6A、6B、14、19F 和23F 為最主要的7 種血清型，但不同地區(qū)間仍存在很大差異［16］。本研究最常見血清型為6B（21.8%）、14（21.1%）、19F（16.5%）、19A（15.8%）和23F（11.3%），與我國一項多中心研究［17］及深圳一項研究［18］中兒童IPD 血清型前五位一致，僅排序略有不同，但與國外常見血清型差異較大。如在印度，導(dǎo)致兒童IPD 的主要血清型為1、6B 和14［15］。研究顯示，歐洲多國引起兒童IPD 最常見的血清型為14、6B、19F 和23F，但PCV7 廣泛使用后，PCV7 血清型占比顯著下降，而非PCV7 血清型1、19A、3、6A/C 和7F 正逐漸增多［11］。由于蘇州地區(qū)疫苗接種率較低，本研究中未觀察到類似的血清型替代現(xiàn)象。值得關(guān)注的是，在2016 年底PCV13 引入后，疫苗血清型19F 和23F 的占比反呈上升趨勢，可能與這兩種血清型菌株耐藥率高，因而在疫苗接種率較低的情況下減少不明顯有關(guān)，而其他疫苗血清型如6B、14 的占比顯著下降，使得19F 和23F 的占比相對上升；此外，也可能是樣本量相對較少導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定所致。但自2017 起，我們觀察到了非疫苗血清型分離株（6D）的出現(xiàn)，提示今后應(yīng)持續(xù)開展監(jiān)測以了解菌株血清型的變化趨勢。本研究中PCV7、PCV13 疫苗分別可覆蓋檢出IPD 血清型的75.9% 和93.2%，高于蘇州地區(qū)NIPD 菌株的PCV13 疫苗血清型覆蓋率（73.1%）［9］，與國內(nèi)研究相似［19］。

本研究也存在一些局限性。首先，所有菌株僅來自一家醫(yī)院，樣本量相對較小，結(jié)果的代表性和穩(wěn)定性可能會受到影響，今后可繼續(xù)監(jiān)測并擴大研究范圍。其次，由于部分患兒非蘇州戶籍，難以獲得其免疫接種信息，因此本研究未能綜合考慮患兒肺炎球菌疫苗接種情況。為了更全面地了解疫苗的效果，未來可以納入患兒的疫苗接種情況進行分析。

綜上所述，蘇州地區(qū)兒童侵襲性肺炎鏈球菌血清型主要為6B、14、19F、19A 和23F，PCV13 疫苗可有效覆蓋?？咕幬锬退巻栴}仍不容忽視，有必要持續(xù)監(jiān)測，同時加強臨床合理用藥，以控制抗菌藥物耐藥情況。

作者貢獻聲明沈嘉銘 論文構(gòu)思和撰寫，數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，實驗操作。陶云珍，王運中，薛建，邵雪君 數(shù)據(jù)收集。劉長鵬，馮爽，張優(yōu)儀 實驗操作。趙根明 論文修訂。張濤 論文構(gòu)思、撰寫和修訂，數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。