朱 琳 蒯 錚 宋 樂(lè) 胡 予 沈錫中 張丹瑛△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院老年病科， 2消化科 上海 200032）

微生物在宿主動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。研究顯示不同的病原微生物，如牙周病細(xì)菌、肺炎衣原體、幽門(mén)螺桿菌等，均與冠心病有一定的相關(guān)性［1-2］。一些動(dòng)脈粥樣硬化的患者盡管沒(méi)有任何常見(jiàn)的高危因素，卻仍然有高水平的斑塊負(fù)擔(dān)，而腸道菌群組成的差異或能解釋其中的關(guān)聯(lián)［3］。將促炎性腸道菌群引入具有類(lèi)人脂蛋白特征的小鼠模型會(huì)增加全身炎癥并加速動(dòng)脈粥樣硬化的形成，提示腸道菌群的組成、炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化之間存在因果關(guān)系［4］。

抗生素，尤其是腸道不可吸收的抗生素，可以改善慢性系統(tǒng)性炎癥，但對(duì)冠心病人群進(jìn)行抗生素治療的研究均未獲得臨床有益結(jié)果［5-7］。益生菌是一種活性微生物補(bǔ)充劑，可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡對(duì)宿主產(chǎn)生有益的作用。研究顯示益生菌可改善宿主脂代謝，調(diào)節(jié)炎癥，減輕高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化［8-10］。益生菌也是腸道共生菌群的成員，外源性補(bǔ)充益生菌能調(diào)節(jié)宿主腸道微環(huán)境，改善動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。目前尚不清楚龐大的腸道共生菌群對(duì)宿主動(dòng)脈粥樣硬化的影響?？紤]到動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性系統(tǒng)性炎癥性疾病，在全面清除宿主腸道菌群的情況下，是否會(huì)影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，還需進(jìn)一步研究和探討。

研究顯示，采用雞尾酒式聯(lián)合口服萬(wàn)古霉素、甲硝唑、硫酸新霉素及氨芐青霉素，可以清除宿主腸道內(nèi)90%以上的共生微生物群［11-12］。本研究利用該四聯(lián)抗生素分別對(duì)普通飼料及高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠進(jìn)行干預(yù)，評(píng)估小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊情況、炎癥水平和腸道機(jī)械屏障功能的變化，以探索腸道共生菌對(duì)宿主動(dòng)脈粥樣硬化的影響，有助于未來(lái)建立腸道微生物-心血管軸通路，為代謝性及炎癥性疾病的防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)ApoE-/-雌性小鼠（C57BL/6），SPF級(jí)，5 周齡，體質(zhì)量16～20 g，購(gòu)買(mǎi)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［批準(zhǔn)號(hào)：SYXK（京）2022-0052］，于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部SPF 級(jí)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由進(jìn)食和飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查的規(guī)定和指導(dǎo)原則。

小鼠進(jìn)入動(dòng)物房后適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，然后隨機(jī)分為普通飼料組（NC 組）、普通飼料+四聯(lián)抗生素組（NC-Abx 組）、高脂高膽固醇飼料（HF 組）和高脂高膽固醇飼料+四聯(lián)抗生素組（HF-Abx 組）。每組分2 籠，每籠飼養(yǎng)5 只小鼠。飼料由南通特洛菲飼料科技有限公司提供，經(jīng)過(guò)輻照滅菌。普通飼料（TP26338）營(yíng)養(yǎng)素比例：蛋白質(zhì)19.4%，碳水化合物63.6%，脂肪17%，總熱量3 724.7 kcal/kg。高脂高膽固醇飼料（TP26303）配方成分增加了無(wú)水奶油及膽固醇，膽固醇總含量為0.2%。高脂高膽固醇飼料營(yíng)養(yǎng)素比例：蛋白質(zhì)15.5%，碳水化合物42.5%，脂肪42%，總熱量4 495 kcal/kg?？股鼐?gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，混合溶液的制備：萬(wàn)古霉素0.5 g/L，硫酸新霉素1 g/L，氨芐青霉素1 g/L，甲硝唑1 g/L，作為飲水干預(yù)，每2 天配置新鮮溶液。定期記錄小鼠的進(jìn)食量并計(jì)算每周小鼠的平均進(jìn)食量，每2 周記錄一次小鼠體重。干預(yù)周期為14 周，采集標(biāo)本前一天晚上開(kāi)始禁食，自由飲水。

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊分析小鼠主動(dòng)脈全長(zhǎng)及心臟一并取下，置于4%多聚甲醛中固定6 h，轉(zhuǎn)移至20%蔗糖溶液中過(guò)夜，再轉(zhuǎn)移到30%蔗糖溶液中長(zhǎng)期保存。小鼠主動(dòng)脈縱向剪開(kāi)并清除周?chē)竞筮M(jìn)行油紅O 染色。主動(dòng)脈面積及斑塊面積為主動(dòng)脈弓至髂動(dòng)脈分支處，不計(jì)入頭臂干動(dòng)脈、左頸總動(dòng)脈、左鎖骨下動(dòng)脈及其分支血管。主動(dòng)脈弓定義為從主動(dòng)脈弓起始處至左鎖骨下動(dòng)脈以下3 mm。用Image J 軟件分析斑塊面積占主動(dòng)脈面積的比值。

血清生化及炎癥指標(biāo)檢測(cè)摘除眼球取血，血液靜置2 h，4 ℃下3 000×g離心15 min，分離血清。使用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測(cè)小鼠血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。通過(guò)ELISA 方法檢測(cè)小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（加拿大Anogen 公司）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（德國(guó)Hyglos 公司）及IL-1β（美國(guó)R&D 公司）的水平。操作流程及質(zhì)控均按照各試劑盒操作步驟進(jìn)行。

實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)從小鼠回腸、結(jié)腸組織中提取總RNA，測(cè)定濃度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR 方法分別測(cè)定腸上皮細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、ZO-1及Occludin 的mRNA 表達(dá)水平，內(nèi)參為β-actin。使用動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，DP431）提取各組織中的總RNA。使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司，RR047A）對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用TB Green ?Premix Ex Taq? Ⅱ（日本TaKaRa 公司，RR820A）進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)。使用ABI 7500 實(shí)時(shí)PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，采用兩步法進(jìn)行PCR 反應(yīng)：預(yù)變性95 ℃30 s，PCR 反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，循環(huán)40 次；溶解曲線(xiàn)程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 定量PCR 引物序列Tab 1 Sequences of the primers for quantitative real-time PCR

Western blot 檢測(cè)從小鼠回腸及結(jié)腸組織中提取總蛋白，測(cè)定濃度后通過(guò)Western blot 方法分別測(cè)定緊密連接蛋白ZO-1 和閉合蛋白（occludin）的蛋白表達(dá)，內(nèi)參為肌動(dòng)蛋白（actin）。閉合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量＜90 000，轉(zhuǎn)膜條件為4 ℃下60 V 持續(xù)1.5 h，ZO-1 （相對(duì)分子質(zhì)量＞90 000）轉(zhuǎn)膜條件為4 ℃下120 V 持續(xù)2 h。

免疫組化染色將小鼠回腸組織蠟塊切成厚度為5 μm 石蠟切片，脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)并阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。滴加PBS 稀釋的一抗，陰性對(duì)照組織上滴加PBS，于4 ℃濕盒中孵育過(guò)夜（15 h）。ZO-1 稀釋比為1∶250，閉合蛋白稀釋比為1∶100。滴加二抗-過(guò)氧化物酶，37 ℃孵育30 min。PBS 沖洗后每張切片滴加新鮮配制的DAB 顯色液，顯微鏡下觀察，陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色或棕褐色。切片置于10×40 倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，Image-Pro Plus 6 圖像分析軟件檢測(cè)陽(yáng)性染色部位的積分光密度（integrated optical density，IOD）值，結(jié)果表示為IOD/目標(biāo)分布區(qū)域面積（area）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析近似正態(tài)分布的定量資料用±s表示。多組間樣本均數(shù)比較采用ANOVA 進(jìn)行檢驗(yàn)。組間兩兩比較：符合方差齊性，采用Bonferroni法進(jìn)行檢驗(yàn)；方差不齊，采用Tamhane 法進(jìn)行檢驗(yàn)。應(yīng)用IBM SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

抗生素干預(yù)下小鼠攝食量和體質(zhì)量的變化定期記錄每組小鼠的攝食量和體質(zhì)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HFAbx 組小鼠攝食量逐漸升高，從第8 周起與其他3 組小鼠的攝食量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1A）。NC 組與NC-Abx 組小鼠相比，在整個(gè)干預(yù)過(guò)程中攝食量無(wú)明顯差異（圖1A）。HF-Abx 組小鼠雖然攝食量明顯增多，但體質(zhì)量無(wú)明顯增加；從第12 周起HF-Abx 組小鼠體質(zhì)量明顯低于HF 組（P＜0.05，圖1B）。NC 組與NC-Abx 組小鼠相比，在整個(gè)干預(yù)過(guò)程中體質(zhì)量無(wú)明顯差異（圖1B）。

圖1 各組小鼠攝食量及體重Fig 1 Food intake and body weight of the mice in different groups

抗生素干預(yù)下小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成應(yīng)用油紅O 染色在小鼠主動(dòng)脈大體標(biāo)本中反映動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成情況（圖2A、2B）。與NC 組相比，NC-Abx 組小鼠在主動(dòng)脈弓處形成明顯的動(dòng)脈粥樣硬化病變（圖2A），且斑塊面積占主動(dòng)脈面積的百分比顯著升高（NC 組：1.375%±0.225%，NCAbx 組：2.406%±0.187%，P=0.016）（圖2B）。另一方面，HF-Abx 組小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變比HF 組明顯減少（HF 組：8.906%±0.901%，HF-Abx 組：5.976%±0.650%，P=0.040）（圖2A、2B）。

圖2 小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的油紅O 染色結(jié)果Fig 2 Oil-red-O staining results of atherosclerotic plaque in the mice

抗生素干預(yù)下小鼠脂代謝水平NC-Abx 小鼠的血清HDL-c 水平較NC 組明顯升高［NC 組（0.718±0.148）mmol/L，NC-Abx 組（1.496±0.173）mmol/L，P＜0.001］（圖3B），而在血清總膽固醇及甘油三酯水平上，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A、3C）。

圖3 抗生素對(duì)各組小鼠脂代謝的影響Fig 3 The effect of antibiotics on lipid metabolism in the mice from different groups

HF-Abx 組小鼠的血清總膽固醇水平較HF 組明顯下降［HF 組（34.20±4.17）mmol/L，HF-Abx 組（18.76±1.52）mmol/L，P＜0.001］（圖3A），而在血清HDL-c 及甘油三酯水平上，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B、3C）。

抗生素干預(yù)下小鼠血清炎癥因子水平NCAbx 組小鼠血清IL-1β 明顯高于NC 組小鼠［NC 組（4.444±0.356）pg/mL，NC-Abx 組（11.42±1.079）pg/mL，P=0.005］及TNF-α 水平［NC 組（8.668±2.893）pg/mL，NC-Abx 組（20.69±1.15）pg/mL，P=0.021］（圖4B、4C），但兩組小鼠血清LPS 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.560，圖4A）。HF-Abx 小鼠血清LPS 水平［HF 組（2.943±0.133）EU/mL，HFAbx 組（2.175±0.136）EU/mL，P=0.0026］（圖4A）和血清TNF-α 水平［HF 組（23.86±2.184 pg/mL，HF-Abx 組（13.52±2.895）pg/mL，P=0.029］（圖4C）均顯著低于HF 組，但兩組血清IL-1β 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.819，圖4B）。

圖4 抗生素對(duì)各組小鼠血清炎癥水平的影響Fig 4 The effects of antibiotics on serum inflammation levels in the mice from different groups

抗生素干預(yù)下小鼠腸道組織炎癥水平不同飼料喂養(yǎng)下，用四聯(lián)抗生素清除腸道菌群，宿主的腸道炎癥狀態(tài)表現(xiàn)出不同的結(jié)果。普通飼料喂養(yǎng)下，清除腸道微生物后小鼠腸道組織表現(xiàn)出更高的炎癥水平：與NC 組相比，NC-Abx 組小鼠回腸上皮IL-1β mRNA（P=0.003）和TNF- α mRNA（P=0.007）表達(dá)顯著升高（圖5A），IL-6 mRNA 表達(dá)略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5A）；NC-Abx 組小鼠結(jié)腸上皮TNF-α mRNA 表達(dá)顯著升高（P=0.029，圖5B），IL-6 mRNA 及IL-1β mRNA 表達(dá)有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5B）。

圖5 抗生素對(duì)各組小鼠腸道組織炎癥水平的影響Fig 5 Effects of antibiotics on inflammation levels in the intestinal tissues of mice from different groups

高脂飼料喂養(yǎng)下，小鼠腸上皮炎癥因子表達(dá)水平高于普通飼料組：HF 組小鼠回腸上皮TNF-α mRNA（P=0.038）、IL-6 mRNA（P=0.04）和IL-1β mRNA（P=0.014）表達(dá)顯著高于NC 組（圖5A）。HF 組小鼠結(jié)腸上皮TNF-α mRNA（P=0.024）及IL-6 mRNA（P=0.001）表達(dá)顯著高于NC 組，IL-1β mRNA 表達(dá)高于NC 組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5B）。四聯(lián)抗生素清除腸道微生物后，小鼠腸道組織的炎癥水平明顯下降：HF-Abx 組小鼠回腸及結(jié)腸上皮TNF-α mRNA（回腸：P=0.030，結(jié)腸：P=0.029）、IL-6 mRNA（回腸：P=0.04，結(jié)腸：P=0.001）和IL-1β mRNA（回腸：P=0.004，結(jié)腸：P=0.017）表達(dá)均明顯低于HF 組（圖5A、5B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

抗生素干預(yù)下小鼠腸道組織緊密連接蛋白的表達(dá)普通飼料喂養(yǎng)下，用四聯(lián)抗生素清除腸道微生物后小鼠腸道組織閉合蛋白和ZO-1 的mRNA 表達(dá)明顯下降：與NC 組相比，NC-Abx 組小鼠回腸及結(jié)腸組織閉合蛋白mRNA（回腸：P=0.001，結(jié)腸：P=0.013）和ZO-1 mRNA（回腸：P=0.020，結(jié)腸：P=0.016）表達(dá)均明顯下降（圖6A、6B）；NC-Abx 組小鼠回腸及結(jié)腸組織閉合蛋白及ZO-1 的蛋白表達(dá)均明顯下降（P＜0.001，圖6C、6D）。

圖6 抗生素對(duì)各組小鼠腸道組織緊密連接蛋白表達(dá)的影響Fig 6 Effects of antibiotics on the expression of tight-junction proteins in the intestinal tissues of mice from different groups

高脂飼料喂養(yǎng)下，小鼠腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)明顯低于普通飼料組。HF 組小鼠回腸組織閉合蛋白mRNA（P=0.004）和ZO-1 mRNA（P=0.034）表達(dá)顯著低于NC 組（圖6A）；HF 組小鼠回腸組織的ZO-1 和閉合蛋白蛋白表達(dá)均顯著低于NC組（P＜0.001，圖6C）。HF 組小鼠結(jié)腸組織閉合蛋白mRNA 表達(dá)顯著低于NC 組（P＜0.001，圖6B），ZO-1 mRNA 表達(dá)低于NC 組小鼠，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.446，圖6B）；HF 組小鼠結(jié)腸組織的ZO-1和閉合蛋白蛋白表達(dá)均顯著低于NC 組（P＜0.001，圖6D）。高脂飲食下四聯(lián)抗生素清除腸道微生物后，小鼠腸道組織的緊密連接蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化：HF-Abx 組小鼠回腸及結(jié)腸組織閉合蛋白及ZO-1 的mRNA 表達(dá)與HF 組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6A、6B）；兩組腸道組織閉合蛋白及ZO-1的蛋白表達(dá)差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6C、6D）。

免疫組化結(jié)果也顯示，NC-Abx 組及HF-Abx組小鼠回腸上皮緊密連接蛋白陽(yáng)性表達(dá)減少且染色強(qiáng)度減弱，細(xì)胞間陽(yáng)性表達(dá)不連續(xù)，較稀疏（圖7A、7B）。Image-Pro 圖像軟件半定量分析顯示，NC-Abx 組小鼠與NC 組相比，閉合蛋白（P＜0.001）和ZO-1（P=0.032）陽(yáng)性表達(dá)顯著下降（圖7C、7D）；HF 組小鼠與NC 組相比，閉合蛋白（P＜0.001）和ZO-1（P=0.005）陽(yáng)性表達(dá)顯著下降（圖7C、7D）；而HF 組與HF-Abx 組小鼠回腸上皮緊密連接蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7C、7D）。

圖7 各組小鼠回腸上皮緊密連接蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果Fig 7 Immunohistochemistry of tight-junction protein expression in the ileal epithelium of mice from different groups

討 論

本研究通過(guò)四聯(lián)廣譜抗生素（萬(wàn)古霉素+甲硝唑+硫酸新霉素+氨芐青霉素）清除小鼠腸道內(nèi)90%以上的微生物［12］，從而建立一個(gè)“無(wú)菌”的腸道環(huán)境。王亞濤等［13］也曾用口服混合非吸收性抗生素飲用水（慶大霉素、磺卞青霉素、頭孢硫脒、兩性霉素B），建立偽腸道無(wú)菌動(dòng)物模型。本研究發(fā)現(xiàn)在不同飼料（飲食）環(huán)境下，缺少腸道菌群對(duì)宿主動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥水平有著截然不同的影響。

在高脂飼料喂養(yǎng)下，清除腸道微生物的小鼠攝食量明顯增多，但與之相反的是體質(zhì)量卻沒(méi)有明顯增長(zhǎng)：四聯(lián)抗生素干預(yù)的高脂飼料組小鼠體質(zhì)量在干預(yù)后期顯著低于高脂飼料組，且與普通飼料喂養(yǎng)的小鼠相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果與Gordon 實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)典研究結(jié)果類(lèi)似：無(wú)菌小鼠比悉生小鼠攝入更多的飼料，但前者體質(zhì)量及體內(nèi)脂肪含量卻更低［14］。腸道菌群能夠分解代謝食物中的膳食纖維，產(chǎn)生短鏈脂肪酸。短鏈脂肪酸能被小腸上皮細(xì)胞吸收進(jìn)入血液循環(huán)，運(yùn)往機(jī)體其他組織細(xì)胞的線(xiàn)粒體內(nèi)進(jìn)行β 氧化供能，從而增加從食物中的能量獲取，提高食物利用率。此外，腸道菌群能夠抑制腸道內(nèi)禁食誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞因子（fastinginduced adipocyte factor，F(xiàn)iaf）的表達(dá)，使得脂肪細(xì)胞肥大；還可以上調(diào)脂肪合成基因的表達(dá)，使甘油三酯在肝臟和脂肪組織中堆積［15］。無(wú)菌小鼠因?yàn)槿狈δc道菌群作用，雖然攝食比正常小鼠多，但是體質(zhì)量和脂肪卻反而更少。

本研究還觀察到高脂飼料喂養(yǎng)，清除腸道菌群的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積明顯下降，血清總膽固醇水平明顯降低，且血清LPS 水平及腸道炎癥因子表達(dá)顯著下降。這說(shuō)明在高脂飲食誘導(dǎo)的系統(tǒng)性慢性炎癥狀態(tài)下，清除腸道微生物群能夠減輕宿主炎癥狀態(tài)。曾有學(xué)者嘗試用抗生素對(duì)冠心病患者進(jìn)行干預(yù)，但最新的綜述顯示抗生素用于冠心病的二級(jí)預(yù)防似乎是有害而無(wú)益的［2］。

Rakoff-Nahoum 等［12］研究顯示腸道共生菌在穩(wěn)態(tài)條件下被TLRs 識(shí)別，它們的相互作用在維持宿主腸上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及預(yù)防腸道損傷中起重要作用，由此認(rèn)為腸道共生菌對(duì)防止腸上皮損傷是必需的。此外，膳食纖維只能通過(guò)腸道菌群在結(jié)腸中發(fā)酵，膳食纖維發(fā)酵的終產(chǎn)物是短鏈脂肪酸，其中丁酸是結(jié)腸上皮的能量底物，并且在免疫功能和腸道屏障完整性方面也有作用［16-18］。因此，缺乏腸道菌群對(duì)宿主腸上皮功能影響顯著。本研究結(jié)果也顯示無(wú)論是普通飼料還是高脂飼料喂養(yǎng)，清除腸道微生物群后小鼠腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)均明顯下降，腸道通透性因緊密連接蛋白的表達(dá)減少而受損，并在腸上皮細(xì)胞死亡和再生之間造成不平衡［19］，腸道機(jī)械屏障功能受損，而腸道屏障的完整性對(duì)于維持宿主的健康以及預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

高脂飲食可引起小鼠腸道內(nèi)環(huán)境的紊亂，損害腸道屏障的完整性，使腸道屏障的通透性升高，引起代謝性?xún)?nèi)毒素血癥，增加系統(tǒng)性慢性炎癥［20-21］。我們發(fā)現(xiàn)廣譜四聯(lián)抗生素清除宿主腸道菌群后，雖然可以減輕高脂飲食誘導(dǎo)的代謝性?xún)?nèi)毒素血癥，減少腸上皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，但是腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)依舊下降，腸上皮機(jī)械屏障依舊處于受損狀態(tài)。因?yàn)榭股卣w抑制了高脂飲食誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)，所以雖然腸道機(jī)械屏障功能不全，但腸源性?xún)?nèi)毒素水平不高?？紤]到人類(lèi)的飲食種類(lèi)及結(jié)構(gòu)更豐富，生活環(huán)境比實(shí)驗(yàn)小鼠更復(fù)雜，應(yīng)用抗生素在清除腸道微生物減輕炎癥的同時(shí)，腸上皮屏障受損可能會(huì)帶來(lái)免疫和代謝方面更多不利的影響。研究顯示，腸道菌群的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸在維持急性心梗宿主心肌修復(fù)能力方面也發(fā)揮重要作用［18］。這些可能是抗生素治療冠心病的人群研究尚無(wú)臨床獲益的原因之一。

與高脂飼料喂養(yǎng)相反的是，普通飼料喂養(yǎng)的小鼠在清除腸道微生物后動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積明顯升高，這一結(jié)果與Stepankova 等［22］對(duì)無(wú)菌小鼠的研究結(jié)果是一致的。缺乏腸道共生菌的小鼠血清炎癥因子TNF-α 和IL-1β 水平均比對(duì)照小鼠明顯升高，且前者腸上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)也明顯增多。這樣看來(lái)，在普通飼料喂養(yǎng)的環(huán)境下，清除正常腸道共生菌引起ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展與宿主炎癥水平升高有關(guān)，后者又與宿主腸上皮屏障受損有關(guān)。我們認(rèn)為普通飼料喂養(yǎng)下，小鼠腸道建立了一個(gè)無(wú)致病菌的正常共生菌環(huán)境，而廣譜四聯(lián)抗生素清除了小鼠90%以上的腸道微生物群后，破壞了正常共生菌環(huán)境，腸上皮屏障受損，反而引起小鼠炎癥水平升高，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。因此，我們推測(cè)正常腸道共生菌對(duì)宿主動(dòng)脈粥樣硬化具有保護(hù)性作用，這一作用與腸道共生菌群在穩(wěn)態(tài)條件下維持宿主腸道屏障完整性及預(yù)防腸道損傷有關(guān)。

本研究存在一定不足和局限性：未進(jìn)行小鼠糖代謝方面的檢測(cè)，未探討腸道共生菌、糖代謝與動(dòng)脈粥樣硬化之間的相關(guān)性。雖然文獻(xiàn)支持四聯(lián)抗生素能夠清除宿主腸道90%以上的正常共生菌，但本研究未檢測(cè)小鼠腸道菌群的情況，今后研究中仍需進(jìn)行相關(guān)的探索。

本研究再次證實(shí)了炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展中起主要作用，明確了正常腸道共生菌對(duì)宿主動(dòng)脈粥樣硬化具有保護(hù)性作用。今后將進(jìn)一步深入研究調(diào)節(jié)炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化之間的具體機(jī)制，在不影響腸道屏障功能的情況下，特定的或靶向的抗炎治療手段有可能改變宿主動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。

作者貢獻(xiàn)聲明朱琳 論文構(gòu)思和撰寫(xiě)，數(shù)據(jù)整理，制圖。蒯錚 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。宋樂(lè) 數(shù)據(jù)分析。胡予，沈錫中 研究設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。張丹瑛 論文構(gòu)思、指導(dǎo)和修改。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。