戚 宇 王 杭 郭劍明 姜 帥，2△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科 上海 200032； 2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院吳淞醫(yī)院泌尿外科 上海 200940）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有57.3 萬新發(fā)病例，新增死亡人數(shù)約21.3萬人［1］。2022 年我國預(yù)估新發(fā)膀胱癌患者約9.2 萬人，預(yù)估新增死亡人數(shù)約4.3 萬人［2］。膀胱癌具有多次復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，極大增加了我國社會醫(yī)療體系的負(fù)擔(dān)。

膀胱癌根據(jù)腫瘤浸潤深度分為非肌層浸潤性膀 胱 癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC），75%～80% 的患者為NMIBC［3］。NMIBC 病變包括局限于黏膜（Ta，Tis）和黏膜下層（T1）的病變，指南推薦的治療方式包括經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)（transurethral resection of bladder tumour，TURBT），術(shù)后膀胱灌注治療等［4］。根據(jù)AUA 膀胱癌復(fù)發(fā)危險(xiǎn)分層［5］，NMIBC 可以分為低中高危3 個(gè)級別，中高危組患者TURBT 術(shù)后接受卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）膀胱灌注治療可有效降低腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展。臨床實(shí)踐中行卡介苗治療的中高危NMIBC 患者中仍有20%～50%在1 年內(nèi)復(fù)發(fā)進(jìn)展［6］。如何篩選出合適的患者進(jìn)行卡介苗膀胱灌注治療，最大程度地使患者獲益是NMIBC 患者治療的瓶頸。本研究通過回顧性分析NMIBC 患者于TURBT 術(shù)后行卡介苗膀胱灌注治療的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，旨在建立中高危NMIBC 患者行卡介苗膀胱灌注的療效預(yù)測模型并驗(yàn)證其可行性。

資 料 和 方 法

一般情況本研究為回顧性分析，收集2014 年1 月至2019 年1 月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科就診、TURBT 術(shù)后采用卡介苗膀胱灌注治療的268 例NMIBC 患者的相關(guān)數(shù)據(jù)。隨訪周期：術(shù)后2 年內(nèi)每3 個(gè)月1 次，術(shù)后2～5 年每6 個(gè)月1 次，術(shù)后5 年后每年1 次，末次隨訪時(shí)間為2022 年1 月31 日。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理診斷為NMIBC；（2）隨訪數(shù)據(jù)完整；（3）臨床數(shù)據(jù)完整（包括血常規(guī)、病理類型和病理分級等）；（4）尚無證據(jù)證明患者在TURBT 之前已有淋巴結(jié)或腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（5）AUA 膀胱癌復(fù)發(fā)危險(xiǎn)分級為中高危。最終共納入258 例患者，篩選流程如圖1 所示。所有入組患者均簽署知情同意書，并于TURBT 術(shù)前行血液學(xué)指標(biāo)檢測。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（編號：B2021-198）。

圖1 臨床試驗(yàn)流程圖Fig 1 Flow diagram of the clinical trial

通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病案系統(tǒng)查詢患者臨床信息（表1），包括性別、年齡、分期、病理級別、腫瘤大小、膀胱癌初/復(fù)史、腫瘤數(shù)目、化療灌注史、既往其他腫瘤病史、二次經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除（re-TURBT）病史和血常規(guī)指標(biāo)，包括血紅蛋白、血小板、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）。病理分期根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）第7 版TNM 分期［7］。

表1 中高危NMIBC 患者的臨床基線數(shù)據(jù)Tab 1 Clinical data of medium- and high-risk NMIBC patients［n（%）］

膀胱灌注卡介苗方案及不良反應(yīng)取120 mg卡介苗（成都生物制品研究所有限責(zé)任公司）溶于生理鹽水50 mL，患者灌注前排空膀胱，卡介苗經(jīng)一次性導(dǎo)尿管注入膀胱，保留2 h 后排出體外，排出尿液經(jīng)消毒后丟棄。術(shù)后第3 周開始卡介苗膀胱灌注療程，共計(jì)3 年：誘導(dǎo)周期為6 周，每周灌注1 次，共6 次；隨后每2 周膀胱灌注1 次，共3 次；以后每月1次；后續(xù)1～2 個(gè)月膀胱灌注1 次?；颊咝g(shù)后2 年內(nèi)每3 個(gè)月復(fù)查膀胱鏡，術(shù)后2～5 年每6 個(gè)月復(fù)查膀胱鏡，術(shù)后5 年每年復(fù)查膀胱鏡。隨訪記錄患者療效及不良反應(yīng)，采用1 年和3 年無復(fù)發(fā)生存率評估卡介苗膀胱灌注療效。觀察終點(diǎn)為腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間及患者生存時(shí)間。

歐洲泌尿外科學(xué)會將卡介苗灌注后不良反應(yīng)分為局部不良反應(yīng)和全身不良反應(yīng)。局部不良反應(yīng)有膀胱炎、有癥狀的肉芽腫性前列腺炎和睪丸附睪炎等；全身不良反應(yīng)有乏力、發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎、持續(xù)高熱（＞38.5 ℃，持續(xù)48 h 以上）等［8］。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本隊(duì)列根據(jù)隨機(jī)數(shù)字分組法按照7：3 分為訓(xùn)練集（n=180）和驗(yàn)證集（n=78），兩組臨床基線數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。采用χ2檢驗(yàn)，葉氏連續(xù)性校正檢驗(yàn)（Yates’ continuity correction）以及Logrank 檢驗(yàn)。

血常規(guī)指標(biāo)采用LASSO 回歸模型（R 包：glmnet）篩選獨(dú)立預(yù)后因子。將預(yù)測因子與患者臨床信息結(jié)合，通過單/多因素Cox 回歸模型建立療效預(yù)測模型，預(yù)測患者經(jīng)卡介苗治療后腫瘤無復(fù)發(fā)生存時(shí)間（recurrence-free survival，RFS）。每項(xiàng)指標(biāo)的臨界值采用本醫(yī)院臨床檢驗(yàn)臨界值進(jìn)行確認(rèn)：血紅蛋白130 g/L，中性粒細(xì)胞6.3×109/L，嗜酸性粒細(xì)胞0.52×109/L，嗜堿性粒細(xì)胞0.06×109/L，血小板125×109/L，單核細(xì)胞0.6×109/L，淋巴細(xì)胞3.2×109/L，CRP 3.0 mg/L。

使用SPSS、GraphPad Prism 8 和R3.6.2 等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Logrank 檢驗(yàn)、LASSO 回歸分析和單多因素Cox 回歸分析用于患者生存相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

本研究共納入258 例NMIBC 患者，中位隨訪時(shí)間53.0（12.0～98.2）個(gè)月，其中高齡患者（＞70 歲）96 例（37.2%），男性患者175 例（67.8%），女性患者83 例（32.2%）。根據(jù)AUA 膀胱癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分層［5］，中?；颊?3 例（12.8%），高?；颊?25 例（87.2%）。258 例患者中共有80 例（31.0%）腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，219 例（84.9%）1 年無復(fù)發(fā)生存，192 例（74.4%）3 年無復(fù)發(fā)生存，隨訪期間共有11 人因腫瘤進(jìn)展死亡，總體生存率為95.7%。灌注期間有181 例（70.2%）出現(xiàn)不良反應(yīng)，包括乏力5 例（1.9%）、發(fā)熱101 例（39.1%）、持續(xù)高熱5 例（1.9%）、尿頻尿急161 例（62.4%）、血尿11 例（4.3%），對癥治療后均緩解，可耐受整個(gè)療程。

檢測患者術(shù)前血常規(guī)結(jié)果，包括血紅蛋白、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、CRP 及隨訪患者腫瘤復(fù)發(fā)情況。訓(xùn)練集和驗(yàn)證集患者在性別、年齡、腫瘤分期、病理類型、病理分級、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、re-TURBT、血常規(guī)檢測指標(biāo)等臨床數(shù)據(jù)基線上的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

在訓(xùn)練集（n=180）中用LASSO 回歸模型篩選血常規(guī)結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），中性粒細(xì)胞和CRP 可作為卡介苗膀胱灌注療效的預(yù)測因子。同時(shí)將以上兩個(gè)因素和性別、年齡、分期、病理級別、腫瘤大小、膀胱癌初/復(fù)史、腫瘤數(shù)目、化療灌注史、既往其他腫瘤病史和re-TURBT 納入單因素Cox 回歸分析（表2），結(jié)果顯示高齡（P＜0.001）、卡介苗灌注前未行re-TURBT（P=0.004）、中性粒細(xì)胞高水平（P=0.001）、CRP 高水平（P＜0.001）是中高危NMIBC患者卡介苗灌注后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。多因素Cox 回歸模型顯示，NMIBC 患者經(jīng)卡介苗治療前行re-TURBT 可顯著降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（HR=0.409，95%CI：0.241～0.693，P=0.001），高齡（年齡＞70 歲）患者行卡介苗灌注治療后復(fù)發(fā)率較年輕患者更高（HR=2.040，95%CI：1.208～3.446，P=0.008），中性粒細(xì)胞增高（HR=1.827，95%CI：1.018～3.280，P=0.044）和CRP 升高（HR=2.462，95%CI：1.374～4.412，P=0.002）是NMIBC 患者卡介苗治療后復(fù)發(fā)的高危因素（表2）。病理類型、病理分級、腫瘤大小、膀胱癌病史、腫瘤數(shù)目、化療灌注史并不是獨(dú)立預(yù)測因子（P＞0.05）。用re-TURBT、高齡、CRP 和中性粒細(xì)胞建立新的療效預(yù)測模型Nomogram 圖（圖3），校準(zhǔn)圖評價(jià)模型顯示，訓(xùn)練集中3 年和5 年RFS 均具有較高擬合度，驗(yàn)證集中3 年RFS 具有較高擬合度（圖4）。用C-index 校驗(yàn)療效預(yù)測模型的預(yù)測效能，訓(xùn)練集C-index 為0.744（95%CI：0.682～0.806），驗(yàn)證集C-index 為0.847（95%CI：0.770～0.924），表明該預(yù)測模型具有較好的預(yù)測效能。

表2 訓(xùn)練集NMIBC 患者行卡介苗療效單/多因素Cox 回歸分析Tab 2 Efficacy of BCG in NMIBC patients analyzed by univariate/multivariate Cox regression analysis in the training set

圖2 LASSO 回歸模型篩選血液學(xué)指標(biāo)中預(yù)測因子Fig 2 LASSO regression model used to screen predictors of hematological indicators

圖3 預(yù)測NMIBC 患者行卡介苗治療后RFS 的Nomogram 圖Fig 3 Prediction of RFS in NMIBC patients after BCG treatment by Nomogram

圖4 NMIBC 患者行卡介苗治療后RFS 預(yù)測Fig 4 Prediction of RFS in NMIBC patients after BCG treatment

根據(jù)新療效預(yù)測模型，將NMIBC 患者劃分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，并分別在訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和總集行K-M 生存曲線分析。在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中高風(fēng)險(xiǎn)組患者RFS 明顯縮短（P＜0.001，圖5A、5B）?？偧瘍?nèi)高風(fēng)險(xiǎn)組1 年無復(fù)發(fā)生存率為76.7%，顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組的95.5%；總集內(nèi)高風(fēng)險(xiǎn)組3 年無復(fù)發(fā)生存率顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組（62.3%vs.90.2%，圖5C）。總集內(nèi)高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，總體生存時(shí)間縮短（圖5D）。因此，該療效預(yù)測模型可以較好地對中高危NMIBC 患者行卡介苗治療的療效進(jìn)行預(yù)測。

圖5 不同風(fēng)險(xiǎn)分層的NMIBC 患者行卡介苗治療后RFS 和OS 的K-M 曲線Fig 5 RFS and OS of NMIBC patients after BCG treatment in different risk stratifications analyzed by K-M curve

討 論

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與患者免疫狀態(tài)以及腫瘤的生物學(xué)狀態(tài)息息相關(guān)，同時(shí)考慮患者身體狀態(tài)及腫瘤病理信息可更準(zhǔn)確地預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。NMIBC 患者占膀胱癌患者75%以上［3］，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，目前國際指南推薦對于TURBT 術(shù)后中高危NMIBC 患者采用膀胱灌注卡介苗治療1～3 年，但缺乏行之有效的復(fù)發(fā)預(yù)測模型。明確卡介苗療效，篩選適宜人群，可極大提高我國NMIBC 患者的治療效果。一項(xiàng)國外研究納入9 項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)進(jìn)行Meta 分析，2 820 名NMIBC 患者行卡介苗灌注后腫瘤總體復(fù)發(fā)率為42.9%［9］，另一項(xiàng)臨床研究顯示1 年復(fù)發(fā)率達(dá)到27%［10］。本中心NMIBC 患者膀胱灌注卡介苗后總體復(fù)發(fā)率為31.0%，1 年復(fù)發(fā)率為15.1%，3 年復(fù)發(fā)率為25.6%，優(yōu)于國外研究，可能是由于我國將卡介苗列入一類疫苗，在嬰幼兒時(shí)期普遍接種，體內(nèi)已具有一定的特異性免疫反應(yīng)抗體，而國外大多未將卡介苗列入疫苗常規(guī)接種。

機(jī)器學(xué)習(xí)可以從更多復(fù)雜的預(yù)測因素中檢測更為有效的臨床預(yù)測因子，LASSO 回歸是一種對復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行變量篩選的算法，可以簡化模型的復(fù)雜性，并防止過度擬合。本研究嘗試采用LASSO回歸篩選血常規(guī)中多個(gè)相關(guān)因子，從血常規(guī)指標(biāo)中篩選出中性粒細(xì)胞及CRP 作為預(yù)測因子，并進(jìn)一步將以上指標(biāo)納入多因素回歸模型中［11］，這種方法可以更準(zhǔn)確地篩選出獨(dú)立預(yù)測因子，同時(shí)構(gòu)建的療效預(yù)測模型具有理想預(yù)測效能（C-index=0.719）。

TURBT 作為NMIBC 治療的金標(biāo)準(zhǔn)，存在首次切除不徹底、切除深度不夠等不利因素，故可能低估膀胱癌惡性程度及腫瘤分期。既往研究表明，首次TURBT 術(shù)后腫瘤殘余率為20%～78%［12］，re-TURBT 術(shù)后5 年RFS 較首次TURBT 明顯增高（63%vs.40%）［13］，推測re-TURBT 可更完整地切除膀胱腫瘤，降低腫瘤負(fù)荷，提高膀胱灌注卡介苗的療效，與本研究結(jié)論一致。

本研究發(fā)現(xiàn)高齡NMIBC 患者（＞70 歲）行卡介苗治療后復(fù)發(fā)率較高：高齡患者細(xì)胞免疫功能較年輕人差［14］；高齡患者可能伴有一定的基礎(chǔ)疾病，導(dǎo)致藥物耐受性不足，不能足量足程完成卡介苗治療。

卡介苗是牛型結(jié)核桿菌經(jīng)人工培養(yǎng)減毒活疫苗，仍保留有一定的免疫原性。1976 年Morales 首次將卡介苗用于膀胱癌的治療［15］?？ń槊缬糜诎螂装┲委煹脑砩形赐耆U明，但已有研究表明其可通過誘導(dǎo)患者機(jī)體產(chǎn)生炎性反應(yīng)而殺傷腫瘤細(xì)胞，包括促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 型極化，極化后巨噬細(xì)胞可以分泌大量促炎因子（如IL-1 和TNF-α），從而殺傷腫瘤細(xì)胞［16-17］。另外，在卡介苗灌注后不久膀胱壁及尿液中會出現(xiàn)中性粒細(xì)胞［18-19］，提示中性粒細(xì)胞參與早期抗腫瘤應(yīng)答。研究指出，血液中中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值＞2.5 時(shí)，NMIBC 患者行卡介苗膀胱灌注治療后復(fù)發(fā)率升高［20］，與本研究結(jié)論一致，血液中性粒細(xì)胞增高是NMIBC 患者TURBT術(shù)后行卡介苗膀胱灌注治療后復(fù)發(fā)的高危風(fēng)險(xiǎn)因素。中性粒細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞可發(fā)生表型和功能重塑，促進(jìn)血管生成及導(dǎo)致腫瘤免疫抑制。中性粒細(xì)胞可以通過分泌炎癥趨化因子，加劇腫瘤微環(huán)境的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［21］。因此，卡介苗膀胱灌注治療前血液中性粒細(xì)胞的升高可能對腫瘤復(fù)發(fā)具有一定的預(yù)測價(jià)值。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CRP 升高時(shí)（＞3.0 mg/L），NMIBC 患者接受卡介苗治療后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)升高。CRP于肝臟中合成，受多種促炎因子調(diào)控，人體正常條件下其表達(dá)水平較低（≤3.0 mg/L）。已有研究表明CRP升高與多種侵襲性腫瘤相關(guān)［22］。CRP增高提示患者體內(nèi)具有較高的炎癥水平，由此提示高水平炎癥反應(yīng)是NMIBC 患者卡介苗膀胱灌注后復(fù)發(fā)的高危因素。炎癥指標(biāo)（如白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值和CRP 等）升高被證實(shí)與多種腫瘤不良預(yù)后相關(guān)［23-25］。綜上所述，通過re-TURBT、高齡、中性粒細(xì)胞及CRP 所建立的療效預(yù)測模型具有一定的理論基礎(chǔ)。

本研究提出將血液學(xué)指標(biāo)與臨床病理信息相結(jié)合建立療效預(yù)測模型，對膀胱灌注卡介苗治療NMIBC 具有積極的臨床意義，同時(shí)臨床數(shù)據(jù)簡單易得。本研究屬于單中心回顧性分析，可能具有一定的選擇偏移和信息偏移，還需進(jìn)一步大樣本多中心前瞻性隨機(jī)對照研究進(jìn)行驗(yàn)證。綜上所述，TURBT 術(shù)后卡介苗膀胱灌注對于中高危NMIBC患者安全有效，建立療效預(yù)測模型可有效篩選中高危NMIBC 患者行卡介苗膀胱灌注的獲益人群。

作者貢獻(xiàn)聲明戚宇 論文構(gòu)思、撰寫和修訂，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，構(gòu)建模型，繪制圖表。王杭數(shù)據(jù)采集，論文修訂。郭劍明 研究設(shè)計(jì)，論文構(gòu)思和修訂。姜帥 論文構(gòu)思和修訂，數(shù)據(jù)搜集和整理。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。