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        健脾化瘀方的HPLC指紋圖譜建立及8種成分含量測(cè)定Δ

        2023-12-13 03:45:52陳小凱余榕鍵黃建江劉芷欣林舉擇王昌俊南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥學(xué)部廣州10080廣東藥科大學(xué)廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心廣州10006南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院中醫(yī)科廣州10080廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所中醫(yī)科廣州10080南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院病理科廣州10080
        中國(guó)藥房 2023年23期
        關(guān)鍵詞:舌草苦參堿化瘀

        陳小凱 ,李 勇 ,譚 為 ,余榕鍵 ,黃建江 ,劉芷欣 ,林舉擇 ,王昌俊 [1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)藥學(xué)部,廣州 10080;.廣東藥科大學(xué)廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心,廣州 10006;3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)中醫(yī)科,廣州 10080;4.廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所中醫(yī)科,廣州 10080;.南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)病理科,廣州 10080]

        健脾化瘀方是由名老中醫(yī)、上海中醫(yī)藥大學(xué)錢伯文教授創(chuàng)制,并結(jié)合廣東省人民醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科王昌俊教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步調(diào)整而成,用于肝癌術(shù)后治療的經(jīng)驗(yàn)方劑。該方由莪術(shù)、苦參、白花蛇舌草、茯苓、白術(shù)、佛手6味藥材組成,具有化瘀散結(jié)、健脾理氣、清熱解毒化濕的功效。除了肝癌,該方還常用于胃癌、大腸癌等消化道腫瘤患者的治療,癥見脘腹疼痛、脅下痞塊、口淡乏味、食欲不振、體倦乏力等。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),健脾化瘀方能有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖,并預(yù)防手術(shù)后肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。臨床研究表明,該方可明顯提高患者的生活質(zhì)量指數(shù),避免肝功能惡化,改善血清肝纖維化指標(biāo),提高患者術(shù)后1、3、5年的生存率,尤其對(duì)肝癌患者術(shù)后早期生活質(zhì)量有明顯改善,如能明顯緩解術(shù)后便秘、腹瀉等癥狀[2]。

        鑒于中藥復(fù)方制劑有效成分的多樣性及復(fù)雜性,如何以更全面的方式表述制劑中的化學(xué)成分種類和數(shù)量,以確保制劑質(zhì)量的相對(duì)一致,是學(xué)者們研究的重點(diǎn)問(wèn)題。目前的研究認(rèn)為,指紋圖譜是一種靈敏而專一性強(qiáng)的質(zhì)量控制方法,廣泛用于中藥制劑的質(zhì)量控制[3]。當(dāng)前,有關(guān)健脾化瘀方質(zhì)量控制的研究仍顯薄弱,基于此,本研究采用高效液相色譜(HPLC)法建立了該方的指紋圖譜,并測(cè)定了方中綠原酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑內(nèi)酯、苦參堿的含量,從定性和定量?jī)煞矫鏋樵摲降馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ),同時(shí)為該方后續(xù)的制劑研究提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考。

        1 材料

        1.1 主要儀器

        本研究的主要儀器有Dionex UltiMate 3000 型HPLC儀[配DGP-3600SD型泵、TCC-3000RS型柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Chromeleon 色譜工作站(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司)],CP225D 型十萬(wàn)分之一電子天平、BS224S型萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)等。

        1.2 主要藥材與試劑

        健脾化瘀方中各單味飲片的來(lái)源信息見表1,經(jīng)廣東省人民醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科王昌俊教授鑒定均為真品,且符合2020年版《中國(guó)藥典》相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定,10 批健脾化瘀方樣品由上述飲片隨機(jī)組合而成。對(duì)照品對(duì)香豆酸(批號(hào)DSTDD005701,純度≥98%)、佛手柑內(nèi)酯(批號(hào)OK20221215F,純度≥98%)、橙皮苷(批號(hào)DST220704-038,純度≥98%)、阿魏酸(批號(hào)DSTDF008102,純度≥98%)、槲皮素(批號(hào)DSTDH002802,純度≥98%)、苦參堿(批號(hào)OK20221212K,純度≥98%)均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司;綠原酸對(duì)照品(批號(hào)Y20A11K111541,純度≥98%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;香草酸對(duì)照品(批號(hào)BCBS1036V,純度≥98%)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;對(duì)照藥材莪術(shù)(批號(hào)120973-202205)、白花蛇舌草(批號(hào)121183-201605)、苦參(批號(hào)121019-201708)、白術(shù)(批號(hào)120925-202114)、茯苓(批號(hào)121117-201910)、佛手(批號(hào)120933-201706)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇為色譜純(美國(guó)BCR 有限公司),其他試劑均為分析純,水為超純水。

        表1 10批健脾化瘀方中各單味飲片的來(lái)源信息

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱為Thermo Hypersil Gold C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇(A)-0.05%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0~10 min,5%A;10~15 min,5%A→12%A;15~30 min,12%A→29%A;30~41 min,29%A;41~80 min,29%A→88%A;80~90 min,88%A;90~92 min,88%A→5%A;92~102 min,5%A);苦參堿的檢測(cè)波長(zhǎng)為211 nm,其他成分的檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為5 μL。

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 健脾化瘀方樣品濃縮液的制備

        健脾化瘀方由白術(shù)12 g、莪術(shù)12 g、佛手12 g、茯苓20 g、苦參20 g、白花蛇舌草20 g組成。按組方配比分別稱取白術(shù)、莪術(shù)、佛手飲片各6 g,茯苓、苦參、白花蛇舌草飲片各10 g。先用揮發(fā)油提取器提取白術(shù)、莪術(shù)、佛手的揮發(fā)油,備用;其藥渣與上述稱好的茯苓、苦參、白花蛇舌草混合,以1∶10的料液比加水浸泡30 min,提取3次,每次1.5 h,合并提取液,濾過(guò)、減壓濃縮,再與揮發(fā)油混合后定容至100 mL容量瓶中,得健脾化瘀方樣品濃縮液。

        2.2.2 健脾化瘀方供試品溶液的制備

        精密吸取健脾化瘀方樣品濃縮液1.5 mL,置2 mL容量瓶中,以水定容,過(guò)0.45 μm 微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

        2.2.3 對(duì)照品溶液的制備

        分別精密稱取綠原酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑內(nèi)酯、苦參堿對(duì)照品0.820 0、1.980 0、9.990 0、10.040 0、1.166 0、10.040 0、9.980 0、10.130 0 mg,加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,得上述8 種成分質(zhì)量濃度依次為0.082 0、0.198 0、0.999 0、1.004 0、0.116 6、1.004 0、0.998 0、1.013 0 mg/mL的單一對(duì)照品溶液;分別精密移取綠原酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑內(nèi)酯單一對(duì)照品溶液適量,用甲醇稀釋并定容至同一5 mL 容量瓶中,得上述7種成分質(zhì)量濃度分別為0.020 5、0.039 6、0.059 9、0.020 1、0.023 3、0.020 1、0.020 0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

        2.2.4 對(duì)照藥材溶液的制備

        按處方比例,分別稱取白花蛇舌草、茯苓、苦參對(duì)照藥材適量,分別以1∶10的料液比加水浸泡30 min,提取3次,每次1.5 h,合并提取液,濾過(guò)、減壓濃縮,并定容至100 mL容量瓶中,即得對(duì)照藥材濃縮液。分別精密移取上述3種對(duì)照藥材濃縮液1.0 mL至2 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容,搖勻,過(guò)0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得白花蛇舌草、茯苓、苦參的對(duì)照藥材溶液。

        按處方比例,分別稱取白術(shù)、莪術(shù)、佛手對(duì)照藥材適量,先用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油,備用;藥渣再分別以1∶10的料液比加水浸泡30 min,提取3次,每次1.5 h,合并提取液,濾過(guò)、減壓濃縮;將所得揮發(fā)油與相應(yīng)對(duì)照藥材的濃縮液混合,并定容至100 mL容量瓶中,即得對(duì)照藥材濃縮液。分別精密移取上述3 種對(duì)照藥材濃縮液1.0 mL 至2 mL 容量瓶中,加甲醇溶解并定容,搖勻,過(guò)0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得白術(shù)、莪術(shù)、佛手的對(duì)照藥材溶液。

        2.2.5 陰性供試品溶液的制備

        按處方比例和“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下方法,分別制備缺白花蛇舌草及白術(shù)(不含綠原酸和香草酸),缺白花蛇舌草、佛手及莪術(shù)(不含對(duì)香豆酸和阿魏酸),缺佛手(不含橙皮苷),缺白花蛇舌草、佛手及苦參(不含槲皮素和佛手柑內(nèi)酯),缺苦參(不含苦參堿)的陰性供試品溶液。

        2.3 指紋圖譜研究

        2.3.1 精密度試驗(yàn)

        取健脾化瘀方樣品濃縮液(編號(hào)S1),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,以12號(hào)對(duì)香豆酸色譜峰為參照峰(S),計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0.01%~0.70%(n=6),相對(duì)峰面積的RSD為0.21%~2.26%(n=6),表明該方法精密度良好。

        2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

        取健脾化瘀方樣品濃縮液(編號(hào)S1),按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以12 號(hào)對(duì)香豆酸色譜峰為參照峰(S),計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%~0.29%(n=6),相對(duì)峰面積的RSD為0.33%~2.11%(n=6),表明該方法重復(fù)性良好。

        2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取健脾化瘀方樣品濃縮液(編號(hào)S1),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于制備后0、3、6、9、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以12號(hào)對(duì)香豆酸色譜峰為參照峰(S),計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%~0.30%(n=6),相對(duì)峰面積的RSD為0.20%~2.41%(n=6),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

        2.3.4 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

        取10 批健脾化瘀方供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》,以編號(hào)S1樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜,采用平均數(shù)法,時(shí)間窗設(shè)為0.2 min,進(jìn)行多點(diǎn)校正、全譜峰匹配,建立樣品(編號(hào)S1~S10)疊加指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜(R),共確定了27 個(gè)共有峰,詳見圖1;通過(guò)與混合對(duì)照品溶液色譜圖(圖2)比對(duì),指認(rèn)出7個(gè)成分,分別為8號(hào)綠原酸、9號(hào)香草酸、12號(hào)對(duì)香豆酸、15號(hào)阿魏酸、19號(hào)橙皮苷、22號(hào)槲皮素、24號(hào)佛手柑內(nèi)酯。以《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2012版)》計(jì)算相似度,可得10批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.942~0.999。此外,在211 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)下,通過(guò)苦參堿對(duì)照品溶液色譜圖指認(rèn)出健脾化瘀方中的苦參堿成分,詳見圖3。

        圖1 10批健脾化瘀方的HPLC疊加指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜

        圖2 健脾化瘀方供試品溶液與混合對(duì)照品溶液的HPLC圖

        圖3 健脾化瘀方供試品溶液在211 nm 波長(zhǎng)下的HPLC圖

        2.3.5 色譜峰歸屬

        將白術(shù)、莪術(shù)、茯苓、佛手、苦參、白花蛇舌草對(duì)照藥材溶液,健脾化瘀方供試品溶液(編號(hào)S1)與混合對(duì)照品溶液的HPLC圖進(jìn)行比對(duì),以確定共有峰來(lái)源。結(jié)果發(fā)現(xiàn),峰1、2、4、6、8、9、10、11 歸屬于白術(shù)藥材,峰7、12、15、20、21、25 歸屬于莪術(shù)藥材,峰1、27 歸屬于茯苓藥材,峰1、2、4、12、13、15、19、22、24 歸屬于佛手藥材,峰1、2、3、4、5、7、11、13、16、18、20、21、22、23、24、27歸屬于苦參藥材,峰1、4、7、8、9、10、11、12、14、15、17、22、23、24、26歸屬于白花蛇舌草藥材,詳見圖4。

        圖4 健脾化瘀方供試品、混合對(duì)照品及各對(duì)照藥材溶液的HPLC圖

        分別取健脾化瘀方供試品溶液(編號(hào)S1)、混合對(duì)照品溶液及各陰性供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,得綠原酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑內(nèi)酯、苦參堿的陰性對(duì)照?qǐng)D譜,詳見圖5、圖6。根據(jù)圖5、圖6,可確定綠原酸(峰8)和香草酸(峰9)來(lái)自白花蛇舌草和白術(shù);對(duì)香豆酸(峰12)和阿魏酸(峰15)來(lái)自白花蛇舌草、佛手和莪術(shù);橙皮苷(峰19)來(lái)自佛手;槲皮素(峰22)和佛手柑內(nèi)酯(峰24)來(lái)自白花蛇舌草、佛手和苦參;苦參堿來(lái)自苦參。

        圖5 健脾化瘀方供試品、混合對(duì)照品及部分陰性供試品溶液的HPLC圖

        圖6 健脾化瘀方供試品、苦參堿對(duì)照品及缺苦參陰性供試品溶液的HPLC圖

        2.4 含量測(cè)定

        2.4.1 線性關(guān)系考察

        取“2.2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和苦參堿對(duì)照品溶液各適量,分別用甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以對(duì)照品實(shí)際進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y),進(jìn)行線性回歸分析,結(jié)果見表2。

        表2 健脾化瘀方中8種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

        2.4.2 精密度試驗(yàn)

        取“2.2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和苦參堿對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次,記錄峰面積。結(jié)果顯示,綠原酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑內(nèi)酯、苦參堿峰面積的RSD分別為0.85%、1.43%、1.03%、1.02%、1.08%、1.72%、0.66%、0.36%(n=6),表明儀器精密度良好。

        2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

        取健脾化瘀方樣品濃縮液(編號(hào)S1),按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積,以外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示,綠原酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑內(nèi)酯、苦參堿的平均含量分別為0.048、0.030、0.158、0.025、0.024、0.019、0.015、14.00 mg/g,RSD 分別為0.59%、0.39%、1.81%、1.36%、2.21%、2.01%、1.14%、1.18%(n=6),表明該方法重復(fù)性良好。

        2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取健脾化瘀方樣品濃縮液(編號(hào)S1),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。結(jié)果顯示,綠原酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑內(nèi)酯、苦參堿峰面積的RSD 分別為0.88%、0.92%、0.50%、1.93%、0.40%、1.15%、1.17%、1.34%(n=6),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

        取已知成分含量的健脾化瘀方樣品濃縮液(編號(hào)S1),共6份,每份精密移取0.75 mL,按1∶1(m/m)加入各單一對(duì)照品溶液,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示,綠原酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑內(nèi)酯、苦參堿的平均加樣回收率分別為99.48%、101.32%、101.18%、100.79%、101.12%、99.19%、99.81%、102.46%,RSD 分別為1.34%、0.93%、1.90%、1.84%、0.54%、1.53%、1.33%、1.01%(n=6),表明該方法準(zhǔn)確度良好。

        2.4.6 樣品含量測(cè)定

        按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備10 批健脾化瘀方樣品濃縮液,再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備健脾化瘀方供試品溶液,然后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄各成分的峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中8種成分的含量。每批樣品平行測(cè)定3次,取平均值,結(jié)果見表3。

        表3 不同批次健脾化瘀方中8種成分的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

        3 討論

        3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

        筆者前期在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí),取健脾化瘀方樣品分別在203、225、246、283、310 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行了掃描,通過(guò)觀察各波長(zhǎng)下的色譜峰數(shù)量、峰形以及響應(yīng)程度,發(fā)現(xiàn)樣品在283 nm波長(zhǎng)下的色譜峰形狀較好、易于觀察,色譜峰數(shù)量相比在其他波長(zhǎng)下更多,且基線比較穩(wěn)定,故最后確定以283 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。另外,苦參是健脾化瘀方治療肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的起主要藥效作用的中藥之一,但其活性成分苦參堿在283 nm波長(zhǎng)下的色譜峰響應(yīng)低,故本研究根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4],選擇211 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)單獨(dú)對(duì)苦參堿進(jìn)行了指紋圖譜鑒定和含量測(cè)定。

        3.2 流動(dòng)相及洗脫條件的確定

        筆者前期分別以甲醇-甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行考察,結(jié)果顯示以甲醇-0.05%磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí),各色譜峰的基線更穩(wěn)定、分離度更高,樣品出峰數(shù)量更多。同時(shí),通過(guò)對(duì)洗脫條件的不斷優(yōu)化,以調(diào)整成分出峰時(shí)間、提高色譜峰分離度,最后確定了文中的梯度洗脫條件。

        3.3 指紋圖譜結(jié)果分析

        本研究建立了健脾化瘀方的HPLC指紋圖譜,通過(guò)方法學(xué)考察,可知其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于3.00%,符合指紋圖譜建立要求。該指紋圖譜共確定了27 個(gè)共有峰,指認(rèn)了8 個(gè)化學(xué)成分,根據(jù)相似度評(píng)價(jià)結(jié)果,10 批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.942~0.999,表明10 批健脾化瘀方供試品溶液的主要化學(xué)成分具有較高的一致性;但有部分批次樣品之間的相似度低于0.900,如S4與S10、S7與S10、S8與S10間的相似度分別為0.865、0.896、0.855,表明不同產(chǎn)地、不同批次藥材間的質(zhì)量存在一定的差異。

        3.4 含量測(cè)定結(jié)果分析

        中藥的療效與其活性成分、含量等有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,對(duì)香豆酸是白花蛇舌草的活性成分之一,它可通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制其增殖與遷移以及抑制腫瘤血管生成而達(dá)到抗腫瘤的作用,并可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為綠原酸、阿魏酸[5]。橙皮苷可以較強(qiáng)地抑制各種類型的腫瘤細(xì)胞,改善肝、腎損傷[6],是佛手的指標(biāo)性成分。槲皮素和佛手柑內(nèi)酯為白花蛇舌草、佛手及苦參共有的有效成分,其中槲皮素可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡,從而發(fā)揮抗肝癌等作用[7];佛手柑內(nèi)酯可通過(guò)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B 信號(hào)通路誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2和Hep3B 凋亡[8]。香草酸是一種酚酸類化合物,為白花蛇舌草和白術(shù)共有的活性成分,可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來(lái)緩解棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪變性[9]??鄥A為苦參的指標(biāo)性成分,臨床上常用于肝癌的治療及預(yù)防復(fù)發(fā)[10]。上述成分的藥理活性與健脾化瘀方的功能主治存在相關(guān)性。因此,為保障健脾化瘀方的質(zhì)量和臨床療效,本研究在指紋圖譜的基礎(chǔ)上,采用HPLC 法對(duì)上述化學(xué)成分進(jìn)行了含量測(cè)定。結(jié)果顯示,在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下,供試品溶液中綠原酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、佛手柑內(nèi)酯、苦參堿的色譜峰與其他組分色譜峰均能達(dá)到基線分離;其含量分別為0.021~0.061、0.025~0.034、0.116~0.295、0.006~0.062、0.014~0.053、0.017~0.026、0.014~0.027、14.05~24.11 mg/g。10 批樣品中化學(xué)成分的含量存在差異,可能與藥材的不同產(chǎn)地、不同批次有關(guān)。

        綜上所述,本研究所建立的指紋圖譜和含量測(cè)定方法可為健脾化瘀方的質(zhì)量控制以及后續(xù)的制劑開發(fā)提供參考依據(jù)。

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