張立平,丁風琴,鄧 麗, 樊瑞軍

近年來,隨著廣譜抗生素、糖皮質激素以及免疫抑制劑等藥物的大量使用,各種介入治療、侵襲性操作、胃腸外營養(yǎng)等技術的廣泛開展以及外傷的發(fā)生,臨床侵襲性真菌感染的發(fā)生率逐年上升,并且產(chǎn)生了不同的耐藥菌株,念珠菌是最常見的引起侵襲性真菌感染的病原菌,占85.6%[1],絲狀真菌是引起嚴重感染性、致盲性眼病的重要病原菌[2]。真菌分布及耐藥性特點與當?shù)貧夂?、用藥習慣及醫(yī)療技術等因素相關,侵襲性真菌感染存在明顯的地域性特點。本研究對本院2012年1月至2021年12月無菌組織、深部體液標本中分離的真菌分布及藥敏結果進行了分析,以期為臨床侵襲性真菌感染的診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料:收集寧夏人民醫(yī)院四個院區(qū)2012年1月至2021年12月臨床送檢的無菌樣本,包括角膜、血液、膽汁、胸腔積液、腹水、穿刺液、導管尖端、腦脊液、組織標本等,共分離到355株真菌(剔除同一患者連續(xù)多次分離的重復菌株)。

1.2 儀器與試劑:哥倫比亞血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、巧克力瓊脂平板均購自英國Oxoid公司,沙保羅培養(yǎng)基購自杭州濱河微生物試劑公司,科瑪嘉念珠菌顯色瓊脂平板購自人福博賽生物技術公司,Bact/Alert 3D 全自動血培養(yǎng)儀及配套血培養(yǎng)瓶、VITEK2-compact 全自動細菌鑒定儀、酵母菌鑒定卡、ATB-FUNGUS-3酵母樣真菌藥敏試劑均購自法國生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離、培養(yǎng)與鑒定:按照《國家臨床實驗室操作規(guī)程》接收及接種標本,血液、胸腔積液、腹水、腦脊液、穿刺液等標本分別打入需氧、厭氧血培養(yǎng)瓶中,用 Bact/Alert 3D全自動血培養(yǎng)儀進行培養(yǎng)。將陽性瓶轉種到哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、中國藍平板,同時涂片革蘭染色,發(fā)現(xiàn)革蘭陽性孢子或菌絲,加種沙保羅培養(yǎng)基,置35 ℃孵箱培養(yǎng)24～72 h,分離得到的念珠菌采用科瑪嘉顯色瓊脂板顯色后判定結果,同時采用VITEK2-compact 進行鑒定。將角膜潰瘍組織切種于沙保羅培養(yǎng)基上,分別放入35 ℃和27 ℃培養(yǎng)箱2～3周。根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、生長速度及有無液體滲出,以及菌落粘片鏡下菌絲顏色、形態(tài)和分生孢子的形態(tài)、結構及產(chǎn)孢方式等特點進行菌種鑒定。

1.3.2 藥敏試驗:采用ATB-Fungus3試劑條對念珠菌進行藥敏試驗。藥物包括5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑,根據(jù)2017 年美國臨床和實驗室標準化協(xié)會CLSI M27-A4(Clinical and Laboratory Standards Institute)文件和流行病學界值 ECV(Epidemiological Cutoff Value )判斷藥敏情況按ATB FUNGS-3建立的折點判讀標準將受試菌分為敏感、中介、耐藥、劑量依賴敏感 SDD(Susceptible-dosedependent)、野生型WT(Wild-type)和非野生型NWT(Non-wild-type)。我院尚未對絲狀真菌藥敏做MIC檢測,因此只向臨床做建議性報告。

1.4 質控菌株:標準菌株為白念珠ATCC90028、光滑念珠菌ATCC90098、熱帶念珠菌ATCC750,均由我國衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心提供。

1.5 統(tǒng)計學方法:采用Whonet 5.6軟件分析統(tǒng)計數(shù)據(jù),統(tǒng)計資料以%表示。

2 結果

2.1 真菌菌種分布:355株真菌中以白念珠菌占比最高(34.37%),其次為鐮刀菌(21.97%)、光滑念珠菌(10.71%)、鏈格孢菌(9.58%)、近平滑念珠菌(9.01%)、熱帶念珠菌(6.76%),見表1。

表1 侵襲性真菌菌株分布(%)

2.2 真菌臨床科室分布和樣本來源:355株真菌臨床科室分布依次為眼科(31.55%)、重癥醫(yī)學科(22.53%)、肝膽外科(13.80%)、胃腸外科(5.63%)、骨科(4.79%)、兒科(4.51%)等。菌株主要分離自角膜標本(31.55%)和全血(23.7%),其次為引流液(9.57%)、腹水(9.58%)和導管(8.72%),見表2。

表2 侵襲性真菌感染臨床科室分布及標本來源(%)

2.3 念珠菌的藥敏結果:對檢出率較高的4種念珠菌進行了針對五種抗菌藥物的耐藥性分析,所有菌株對兩性霉素B均為WT,白念珠菌、近平滑念珠菌對五種抗真菌藥物無耐藥,光滑念珠菌、熱帶念珠菌對氟康唑的耐藥率分別為11.1%和14.3%,光滑念珠菌對氟康唑63.9%為NWT,熱帶念珠菌對伏立康唑88%為NWT,見表3。

表3 常見念珠菌對抗真菌藥物的藥敏結果(R/NWT%)

3 討論

真菌是一種機會致病菌,正常情況下定植于人體黏膜表面,如口腔、胃腸道、泌尿生殖道[3],會引起致病或造成如鵝口瘡、陰道炎等淺表感染。當人體免疫屏障和黏膜屏障破壞,使真菌侵入人體組織、血液并在其中生長繁殖,導致組織損害、器官功能障礙和炎癥反應,引起侵襲性真菌感染[4]。本研究所選擇的標本均來源于無菌體液和深部組織,剔除了痰液、氣管吸取物、尿液、糞便、淺表拭子等標本,對侵襲性真菌感染的診斷和治療更具有臨床意義。

本研究結果顯示,分離自無菌組織、體液的355個菌株真菌中以白念珠菌占比最高,為34.37%,其次為鐮刀菌(21.97%),光滑念珠菌(10.71%),鏈格孢菌(9.58%),近平滑念珠菌(9.01%),熱帶念珠菌(6.76%)。這表明白念珠菌感染占主要地位,與國內外的研究一致[5-7],白念珠菌在侵襲性念珠菌感染中占首位(40%～60%)[8]。鐮刀菌和鏈格孢菌是真菌性角膜炎的主要致病菌,與國內報道的引起真菌性角膜炎的致病性真菌的主要類別[9-10]一致。中國多中心侵襲性酵母菌感染研究顯示,我國非白念珠菌以近平滑念珠菌比例最高(20.00%),其次為熱帶念珠菌(17.20%)和光滑念珠菌(10.80%)[11],在楊靜嫻[12]的報道中,非白念珠菌的比例已高達61.90%,侯欣[13]報道的致病菌中非白念珠菌的感染率逐年增加,光滑念珠菌已成為第二大非白念珠的致病菌,與我們的結果不完全一致,可能與各地區(qū)各醫(yī)院用藥習慣以及收治患者病種的差異有關。近年來,隨著鑒定手段的不斷進步,季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌等少見念珠菌均有檢出。本研究中值得關注的是近平滑念珠菌感染率居念珠菌感染的第三位,可能與臨床導管使用量較大、插管時間長引起院內感染有關,提示院感科應給予重視。

本研究結果表明,從角膜中分離的真菌占比最高,達31.55%,其次為全血。侵襲性真菌感染以外科系統(tǒng)為主,眼科(31.55%)、重癥醫(yī)學科(22.53%)、肝膽外科(13.80%)、胃腸外科(5.63%)、骨科(4.79%)、兒科(4.51%)。侵襲性真菌感染的標本來源和科室分布說明,植物性外傷是引起真菌性角膜炎主要發(fā)病原因,眼科是我院的重點優(yōu)勢?？?收治患者較多?；颊卟∏槲Ｖ亍㈧o脈插管、手術、大量使用抗菌藥物、反復接受侵入性操作、長期胃腸外營養(yǎng)都是導致侵襲性念珠菌感染的高危因素[14]。本研究中兒科侵襲性念珠菌感染率較高,達4.5%,新生兒免疫力低下,缺乏獲得性母體IgG抗體,是侵襲性念珠菌感染的高發(fā)群體[15]。

雖然兩性霉B抗菌譜廣、起效快,但因其不良反應大,臨床上應用較少[16-17]。不同醫(yī)院唑類藥物的耐藥率數(shù)據(jù)有較大變化,與全國真菌監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)有顯著差異[18]。本研究中檢出率較高的四種念珠菌對兩性霉素B均為WT,白念珠菌、近平滑念珠菌對五種抗真菌藥物均無耐藥性,光滑念珠菌對唑類藥物的有一定的耐藥性或NWT,與李芳[19]報道的一致,對氟康唑的耐藥率為11.1%,對伏立康唑63.9%為NWT。新生隱球菌性腦膜炎作為一種急危重感染,一直是臨床診療中的難點,多項研究結果表明5-氟胞嘧啶和兩性霉素B聯(lián)用是治療新型隱球菌性腦膜炎的良好方案[20-21]。因此,臨床醫(yī)生應根據(jù)每個患者不同的病情,結合實驗室真菌培養(yǎng)和藥敏結果以及患者自身情況合理使用抗真菌藥物。

綜上所述,我院侵襲性真菌感染主要以鐮刀菌、鏈格孢菌角膜炎、念珠菌血流感染為主,白念珠菌感染率最高,除眼科外,重癥醫(yī)學科感染最為嚴重,光滑念珠菌對唑類藥物敏感率偏低。臨床應重視侵襲性真菌感染,提高真菌培養(yǎng)的送檢率。目前,本實驗室念珠菌藥敏采用ATB-Fungus3試條進行藥敏試驗,該方法檢測藥物種類少、結果不易判讀[18]。藥敏結果采用CLSI M27-A4文件的標準進行判讀,判斷標準和應用范圍存在一定的局限性。因此,微生物實驗室應加強真菌病原學檢查,規(guī)范和增加絲狀真菌藥敏實驗檢測方法,為臨床侵襲性真菌感染的診治提供有價值的參考依據(jù)。