俞祿珍，宋紹祎，李 帥

（上海海關(guān), 上海 200135）

致死粒線蟲(Anguina funesta)隸屬于粒線蟲屬，主要為害一年生硬直黑麥草(Lolium rigidum)和多花黑麥草(L.multiflorum)[1]。兩種黑麥草均可作為優(yōu)質(zhì)飼草，特別是多花黑麥草在我國(guó)被廣泛栽培[2]。致死粒線蟲可造成寄主飼草的產(chǎn)量下降，而且還是產(chǎn)毒拉塞氏桿菌(Rathayibacter toxicus)的傳播介體，被國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注[3-5]。產(chǎn)毒拉塞氏桿菌可侵染植物產(chǎn)生棒狀毒素，棒狀毒素是自然界產(chǎn)生的致命的毒素之一，該毒素?zé)岱€(wěn)定性強(qiáng)、可不斷富集，可引致牛、馬、羊、豬、雞等多種動(dòng)物中毒致死[6-7]。1978年，澳大利亞報(bào)道昆士蘭州5 591 頭羊、232 頭牛因取食了感染該細(xì)菌的黑麥草而中毒死亡[1,6]。該細(xì)菌侵染寄主植物時(shí)，需要傳播媒介線蟲在寄主上先產(chǎn)生傷口，才能從傷口侵染植物，而致死粒線蟲則是該細(xì)菌的重要媒介線蟲[1]。

鑒于致死粒線蟲對(duì)草業(yè)、畜牧業(yè)危害極大，美國(guó)、智利、阿根廷、澳大利亞、納米比亞、瑙魯、南非已將其列入檢疫性有害生物名錄，嚴(yán)防該線蟲擴(kuò)散傳播[1]。致死粒線蟲可侵染寄主花序形成蟲癭，受侵染的植物不能正常結(jié)籽，其籽粒變?yōu)橄x癭；收獲植物種子時(shí)，蟲癭混入健康植物種子，隨健康種子的調(diào)運(yùn)而遠(yuǎn)距離傳播擴(kuò)散[6-8]。目前，該線蟲在美國(guó)(俄勒岡州)、澳大利亞均有分布，在我國(guó)尚未見分布[7]。

我國(guó)是草原大國(guó)但卻是草坪業(yè)弱國(guó)。2020年，我國(guó)草坪草種年需求量約15 萬(wàn)t，國(guó)產(chǎn)草坪草種生產(chǎn)能力不足，故羊茅屬(Festuca)、草地早熟禾(Poa pratensis)和黑麥草屬(Lolium)等生態(tài)草種、草坪草種90%以上依賴進(jìn)口[9]。致死粒線蟲的寄主是黑麥草屬草種，故其隨進(jìn)口草種傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)很高。同時(shí)，種子入境后直接播種用于綠化或生產(chǎn)青飼料，很少進(jìn)行去除蟲癭的操作。加強(qiáng)來(lái)自疫區(qū)的進(jìn)境草種的檢疫工作，嚴(yán)防該線蟲傳入我國(guó)刻不容緩。

2021 年，上?？诎队谌珖?guó)首次在進(jìn)境多花黑麥草種子中截獲致死粒線蟲。由于在進(jìn)境多花黑麥草種子中僅截獲幼蟲，而僅根據(jù)幼蟲形態(tài)很難準(zhǔn)確鑒定。本研究采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)所截獲的粒線蟲屬幼蟲進(jìn)行鑒定，以期為口岸檢疫部門準(zhǔn)確鑒定該線蟲提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 線蟲分離

進(jìn)境草種子樣品中粒線蟲屬線蟲活動(dòng)性不強(qiáng)，采用傳統(tǒng)的淺盤法分離得到線蟲較少。上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心植物檢疫實(shí)驗(yàn)室參考Meng 等[4]的方法并進(jìn)行了改良，具體如下：1)稱取黑麥草種子約100 g 倒入1 L 燒杯中(約至300 mL刻度線)，加水至約800 mL，用玻璃棒攪拌至草種子完全濕潤(rùn)，室溫靜置1～2 d；2)用玻璃棒快速攪拌30 s 使燒杯底部的草種子懸浮起來(lái)，靜置片刻(等待大部分草種子沉底)，將上懸液(水及浮于水中未沉底的草種子)一起倒入套篩(上篩孔徑為0.85 mm，下篩孔徑為0.038 5 mm)中，并用水連續(xù)沖洗套篩后，將下篩網(wǎng)篩中的篩上物沖洗至培養(yǎng)皿中，待鏡檢；3)向燒杯中重新加水至約800 mL 之后重復(fù)第2 步驟，重復(fù)1～3 次。將獲得的所有分離液鏡檢。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

將分離得到的2 齡幼蟲制片，在光學(xué)顯微鏡(ZEISS Imager.Z1)下進(jìn)行形態(tài)觀察、拍照測(cè)量(AxioVision Rel.4.8)，并采用De Man 公式對(duì)線蟲進(jìn)行測(cè)計(jì)。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 線蟲DNA 提取

用挑針挑取幼蟲若干條, 放入去離子水中洗滌3 次，備用。挑取單條經(jīng)過(guò)洗滌的線蟲，用挑針捅破或割成多段，采用DNeasy Blood&Tissue Kits (Qiagen)試劑盒提取線蟲DNA。

1.3.2 通用引物PCR 擴(kuò)增

采用28S 通用引物對(duì)線蟲DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：引物為D2A (5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAA GTTG-3′)，D3B (5′-TCGGAAGGAACCAGCTAC TA-3′)[10]。采用線蟲ITS 通用引物對(duì)線蟲DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：引物為F194 (5′- CGTAACAAGGTA GCTGTAG-3′)，5368r (5′-TTTCACTCGCCGTTAC TAAGG-3′)[11-12]。

PCR 反應(yīng)體系包括：10 × PCR Buffer (Mg2+free)(TIANGEN) 2.5 μL，Mg2+(25 mmol·L-1) (TIANGEN) 2 μL，dNTP Mix (2.5 mmol·L-1) (TIANGEN) 2 μL，引物(5 μmol·L-1) (上海生物工程有公司合成)各0.5 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1) (TIANGEN)0.4 μL，ddH2O 15.1 μL，總體積25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠1 ×TAE 緩沖液中電泳，EB 染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。

將所得PCR 產(chǎn)物送上海華大基因生物公司測(cè)序，測(cè)得的序列用Seqman 軟件比對(duì)后進(jìn)行校對(duì)和拼接，并在GenBank 中BLAST，進(jìn)行序列分析，進(jìn)一步利用MEGA 6.0 軟件以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述與測(cè)計(jì)值

2.1.1 形態(tài)描述

幼蟲：線蟲熱殺死后呈蠕蟲形；唇區(qū)平，略縊縮，口針弱，口針基部球?。皇车缐|刃型，食道前體部圓柱體狀，中食道球較小，紡錘形；后食道腺梨形，不覆蓋或略覆蓋腸。尾部尖削，肛門不明顯(圖1)。

2.1.2 測(cè)計(jì)值

本研究致死粒線蟲種群幼蟲的形態(tài)測(cè)計(jì)值和美國(guó)種群比較顯示：與Meng 等[4]描述的種群相比，a、b、c、口針長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、中食道球長(zhǎng)及寬、體寬等值基本吻合；體長(zhǎng)、食道較長(zhǎng)一些，但其數(shù)值范圍部分重疊(表1)。

表1 截獲的致死粒線蟲幼蟲與其他致死粒線蟲種群的測(cè)計(jì)值比較Table 1 Comparison of measured values between different populations of juvenile Anguina funesta

2.2 28S 及ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 28S 序列分析

多花黑麥草種子中截獲的粒線蟲幼蟲，測(cè)序獲得742 bp 的DNA 序列(系統(tǒng)登錄號(hào)MH OM403184)，與GenBank 中登錄的A.funesta的序列相似性達(dá)100.00% (登陸號(hào)MG321209) (圖2)?；?8S 區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，截獲的粒線蟲與GenBank中登錄的致死粒粒線蟲A.funesta位于同一進(jìn)化枝上(圖2)。

圖2 基于粒線蟲屬線蟲28S 區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 2 Phylogenetic tree of Anguina sp.based on 28S sequences (maximum likelihood, ML)

2.2.2 ITS 序列分析

多花黑麥草種子中截獲的粒線蟲屬幼蟲，經(jīng)ITS 測(cè)序獲得長(zhǎng)度為778 bp 的序列(系統(tǒng)登錄號(hào)OM403183)，與GenBank 中登錄的A.funesta的相似性達(dá)99.86% (登陸號(hào)KM114435)～100.00% (登陸號(hào)KM114438、KM114439、AF396347) (圖3)。基于rDNA-ITS 區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可見，測(cè)序獲得序列與A.funesta位于同一進(jìn)化枝上(圖3)。

圖3 基于粒線蟲屬線蟲ITS 區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic tree of Anguina sp.based on ITS sequences (maximum likelihood, ML)

3 討論與結(jié)論

由于國(guó)產(chǎn)草種供給不足，我國(guó)長(zhǎng)期進(jìn)口大量草種，特別是禾本科草種子[1]。粒線蟲屬線蟲是禾本科草種的重要寄生線蟲，我國(guó)口岸多次在進(jìn)境草種中截獲粒屬線蟲，如剪股穎粒線蟲(Anguina agrostis)、維氏粒線蟲(Anguina wevelli)[13-14]，傳入我國(guó)將對(duì)草產(chǎn)業(yè)、畜牧業(yè)產(chǎn)生重大威脅，我國(guó)口岸部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)進(jìn)境草種的檢疫力度，防止該類線蟲傳入為害。

粒線蟲屬是一類最早被描述的植物寄生線蟲，歷史悠久，但該屬的分類鑒定卻較復(fù)雜。至今，該屬的有效種個(gè)數(shù)仍存在較大爭(zhēng)議：Siddiqi 認(rèn)為該屬有11 個(gè)有效種，Andrassy 認(rèn)為有13 個(gè)，而Subbotin和Riley 認(rèn)為該屬的有效種將近21 個(gè)[15]。由于粒線蟲屬的雌蟲和雄蟲形態(tài)特征較相似，且部分形態(tài)測(cè)計(jì)值范圍跨度較大，因此經(jīng)典的形態(tài)分類鑒定較困難[15]。歷史上存在多個(gè)同物異名現(xiàn)象，如剪股穎粒線蟲和維氏粒線蟲(Anguina wevelli)、致死粒線蟲曾為同物異名，這些線蟲是否為獨(dú)立有效種曾引發(fā)廣泛討論[16]。本研究截獲的致死粒線蟲與近似種剪股穎粒線蟲的主要形態(tài)區(qū)別為致死粒線蟲的雌蟲后陰子宮囊與肛陰距比(64%～72%)大于剪股穎粒線蟲(常小于50%，偶有達(dá)60%)；致死粒線蟲雄蟲交合刺(長(zhǎng)16～28 μm)短于剪股穎粒線蟲(長(zhǎng)25～40 μm)[16]。由于上述兩種線蟲形態(tài)測(cè)計(jì)值存在部分重疊，準(zhǔn)確的形態(tài)鑒定非常困難。

一段時(shí)期內(nèi)，粒線蟲屬線蟲在寄主植物地上部分產(chǎn)生的癥狀、寄主范圍、寄主專化性也曾作為該屬線蟲鑒定的依據(jù)之一[15]。進(jìn)入新世紀(jì)以來(lái)，分子生物學(xué)的興起與應(yīng)用，為線蟲的分類鑒定提供了新的手段。關(guān)于粒線蟲屬線蟲的分子鑒定，Powers 等[16]于2001 年最早開展研究，其基于ITS1 的PCR-RFLP圖譜顯示，曾經(jīng)同物異名的剪股穎粒線蟲、維氏粒線蟲(Anguina wevelli)和致死粒線蟲酶切圖譜均不同，系統(tǒng)進(jìn)化樹也顯示上述3 種線蟲聚于不同進(jìn)化枝，故認(rèn)為分子特征支持上述3 種線蟲為獨(dú)立有效種，并認(rèn)為ITS1 區(qū)可用于粒線蟲屬線蟲鑒定。近年來(lái)，多位學(xué)者基于該屬線蟲的ITS 區(qū)序列開發(fā)了分子檢測(cè)方法[15,17]，特異引物PCR 法[18]、實(shí)時(shí)熒光PCR法[19]。由于在檢測(cè)種子或植物組織樣品時(shí)，分離得到的粒線蟲屬線蟲常為幼蟲[20]，難以進(jìn)行鑒定，采用分子生物學(xué)手段進(jìn)行輔助鑒定可一定程度上彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定方法的不足。2012 年，Meng 等[4]首次報(bào)道美國(guó)發(fā)生致死粒線蟲，但在田間調(diào)查樣本中未發(fā)現(xiàn)成蟲，其針對(duì)分離得到的幼蟲采用了形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)(PCR-RFLP)相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定。

本研究綜合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，確認(rèn)從美國(guó)多花黑麥草種子中截獲的粒線蟲屬線蟲為致死粒線蟲，這是我國(guó)口岸首次報(bào)道截獲鑒定該線蟲，為口岸檢疫部門準(zhǔn)確鑒定提供技術(shù)支持和決策參考。