雷 楊，白 潔，李智燕，姚 拓

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 / 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 / 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省草原技術(shù)推廣總站, 甘肅 蘭州 730070）

作為全球主要的陸地生態(tài)系統(tǒng)之一的高寒草地生態(tài)系統(tǒng)，在水土保持、涵養(yǎng)水源、生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要的作用[1]。近年來，由于高寒草地獨特的生境與人類活動，破壞了高寒草地生態(tài)平衡，使植被群落結(jié)構(gòu)和土壤的穩(wěn)定性降低，高寒草地面臨著嚴重退化的威脅。隨著高寒草地的退化，生長于高寒草地的優(yōu)勢植株從多年生禾本科逐步向一年生草本植物發(fā)生逆向演替，這為其他雜類草提供了更多的生長機會與空間[2-3]，不僅會影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變[4]，還可能引起病原微生物的增加從而導(dǎo)致植物土傳病害的發(fā)生[5]，加劇高寒草地的退化。根據(jù)仁青吉等[6]研究報道，短期內(nèi)在甘南高寒退化草地施用化肥，草地修復(fù)效果明顯提高。但化肥施用在調(diào)控修復(fù)退化高寒草地的生物多樣性上并不具有可持續(xù)性效果[7]，而林麗等[8]、任卓然等[9]和Zhao 等[10]研究發(fā)現(xiàn)在退化高寒草地施用微生物肥料能夠促進植被生長，土壤養(yǎng)分和植物根際微生物群落也相應(yīng)得到了改善，并且研究表明微生物肥料作為傳統(tǒng)肥料的替代品能夠?qū)崿F(xiàn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)[11]，表明修復(fù)退化高寒草地來維持生態(tài)平衡還需要著眼于微生物的調(diào)控[12]。

植物根際促生菌 (plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)是一類通過固氮、溶磷、分泌植物生長激素特性和拮抗病原微生物以促進植物生長的有益根際細菌[13-14]。研究表明PGPR 作為生物肥料在植被修復(fù)方面可促進植物生長，并增強植物抗逆性[15]。鐘松等[16]在黃河源區(qū)高寒草地施用不同PGPR 菌肥，發(fā)現(xiàn)其均能提高土壤速效養(yǎng)分，意味著PGPR 可在探索退化高寒草地的修復(fù)技術(shù)和可持續(xù)生態(tài)修復(fù)措施中發(fā)揮出至關(guān)重要的作用。市面上普通的PGPR 菌劑在修復(fù)高寒退化草地上面臨很大挑戰(zhàn)。研究表明在高寒地區(qū)低溫等惡劣的生存環(huán)境，來自高寒地區(qū)生長植物根際分離的PGPR 會發(fā)揮更好的作用[17]。因此，篩選出兼具多種優(yōu)良特性的耐低溫PGPR 對高寒退化草地生態(tài)恢復(fù)具有很好的應(yīng)用前景。因而，眾多研究學(xué)者對高寒草地PGPR 的研究關(guān)注越來越多，且有研究發(fā)現(xiàn)具有耐低溫特性的PGPR 在高寒退化草地中具有發(fā)揮修復(fù)功能的潛力[18-19]。目前，在我國適用于修復(fù)退化高寒草地微生物肥料的研發(fā)以及優(yōu)良耐低溫PGPR 菌株資源的篩選少見報道，鑒于高寒草地的獨特生境，篩選來自于該獨特生境的植物根際有益細菌，通過評價其促生特性，進而篩選獲得耐低溫且具有優(yōu)良特性的菌株，后期可用于增強土壤與植物的有益互作，有利于推動與維持高寒草地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和良性循環(huán)。

本研究從前期研究獲得的高寒草地功能微生物資源庫中，選取18 株菌株，在低溫條件下，測定其固氮、溶磷、分泌植物生長激素(indole acetic acid,IAA)和生防能力，從中篩選出綜合特性較優(yōu)的PGPR 菌株，并結(jié)合分子生物學(xué)方法將目的菌株進行鑒定，為后期開發(fā)可應(yīng)用于高寒退化植被修復(fù)的微生物菌劑提供優(yōu)良耐低溫菌株資源，為高寒草地生態(tài)恢復(fù)提供科學(xué)支撐和理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 試驗材料

1)供試培養(yǎng)基： LB (luria bertani, LB) 固體培養(yǎng)基[20]用于菌種的保藏與培養(yǎng)； NFM (nitrogen free medium)培養(yǎng)基用于固氮酶活性的測定[13]；NBRIP(national botanical research institute’s phosphate，NBRIP)培養(yǎng)基[20]用于溶無機磷特性測定，NBRIP 培養(yǎng)基中的相同質(zhì)量的植酸鈣來代替磷酸鈣用于溶有機磷特性測定[18]；King 氏液體培養(yǎng)基用于IAA 的測定[20]；PDA 培養(yǎng)基用于真菌培養(yǎng)[21]。

2)供試菌株和病原菌：前期在15 ℃條件下分離獲得的18 株候選菌株(表1)。

表1 供試菌株Table 1 Strains tested

病原菌為前期分離所得病原菌：茄病鐮刀菌(Fusarium solani)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、串珠鐮刀菌(Fusarium moniliformi)、銳頂鐮孢菌(Gibberella acuminata)[22]。

1.2 試驗方法

1.2.1 固氮酶活性測定

用接種環(huán)將菌株挑取一環(huán)接種于盛有10 mL 半固體NFM 培養(yǎng)基中(血清瓶，規(guī)格30 mL)，每株菌3 次重復(fù)，對照為不接菌處理，用棉花塞封口后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h (15 ℃)后采用乙炔還原法[23]測定菌株固氮酶活性。

1.2.2 溶磷特性及pH 測定

將供試菌株接種至盛有已滅菌的50 mL NBRIP(有機磷培養(yǎng)基用相同質(zhì)量植酸鈣代替NBRIP 培養(yǎng)基中的磷酸鈣)液體培養(yǎng)基[24]的150 mL 三角瓶中，菌株接種好以后培養(yǎng)12 d (15 ℃、180 r·min-1)，鉬藍比色法[24](molybdenum blues colorimetry, MBC)測定菌株溶磷量，用酸度計測定每株菌培養(yǎng)液的pH。

1.2.3 菌株分泌IAA 特性的測定

分別接種500 μL 菌懸液(108cfu·mL-1)于已滅菌裝有50 mL 液體king 培養(yǎng)基的150 mL 三角瓶中。置于15 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)12 d，后吸取以上各菌株培養(yǎng)液 10 mL 離心10 min (10 000 r·min-1、4 ℃)，吸取上清液5 mL，并加等體積的Salkowski 比色液[25]，測定培養(yǎng)液在波長530 nm 的吸光度值，通過標準曲線計算所測IAA 濃度(μg·mL-1)[24]。

1.2.4 菌株生防能力的測定

利用平板對峙法[13]初步測試所有菌株對上述4 種病原菌的拮抗作用。使用直徑為90 mm 的培養(yǎng)皿。采用“十”字交叉法分別在中心處點接病原菌菌絲，在“十”字兩端距中心23 mm 處點接供試菌株，重復(fù)3 次，對照平板為單接病原菌絲。25 ℃培養(yǎng)5～7 d，待整個平板被對照鋪滿時，計算拮抗菌株抑制率，按照以下公式計算：

通過初篩發(fā)現(xiàn)接有供試菌株的PDA 平板有抑菌帶之后，按照上述方法復(fù)篩，3 次重復(fù)，觀察測定拮抗菌株抑菌帶寬度。

1.2.5 優(yōu)良耐低溫PGPR 菌株鑒定

將上述篩選的溶磷菌株LPA7、LNA2，固氮菌株CND1，分泌IAA 菌株LMJ2，生防菌株LMG2、LMY8，平板劃線接種于LB 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h(15 ℃)。按照試劑盒說明書提取細菌總DNA 并進行PCR 擴增，后用1%凝膠瓊脂糖電泳進行PCR 產(chǎn)物檢測。利用正向引物27F (5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′)和反向引物1 492R (5′-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3′)擴增菌株的16S rRNA基因序列。25 μL 反應(yīng)體系：2 × Taq PCR Master-Mix 12.5 μL、DNA 模 板 3 μL、正 反 向 引 物 各1.5 μL、ddH2O 6.5 μL。PCR 擴增參數(shù)設(shè)置：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)循環(huán)30 次；72 ℃總延伸10 min；將PCR 產(chǎn)物進行1%凝膠瓊脂糖電泳檢測后由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。測序結(jié)果在 EZBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)中進行序列比對分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2016 和SPSS 24.0 對數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)整理、One-Way ANOVA 統(tǒng)計分析和Duncan 極差法進行差異顯著性比較，圖表數(shù)據(jù)為平均值 ± 標準誤差；采用Origin 2021 軟件繪圖。通過MEGA7.0 軟件以鄰接法構(gòu)建所測菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap 為1 000 次。

2 結(jié)果分析

2.1 18 株菌株促生特性

供試18 株菌株中除菌株CPB3、CPJ2、ZWA1、LMJ2未檢測出固氮酶活性外，其余14 株菌在15 ℃培養(yǎng)下 的 固 氮 酶 活 性 介 于25.43～230.52 nmol·(h·mL)-1(圖1)，其中，菌株ZWC1 的固氮酶活性最高，達230.52 nmol·(h·mL)-1，其次是菌株LMB5，為 216.49 nmol·(h·mL)-1，菌 株LTZ1 和CND1、ZWE1 的 固 氮酶活性分別為181.72、144.67、138.95 nmol·(h·mL)-1，菌株ZWF1 和LPA7 的固氮酶活性分別為95.46 和93.84 nmol·(h·mL)-1，其 余 菌 株 固 氮 酶 活 性 均 低 于69.46 nmol·(h·mL)-1。

圖1 菌株的固氮能力Figure 1 Nitrogen-fixing capacity of strains

供試18 株菌株均能分泌生長激素IAA，分泌量介于12.45～71.71 μg·mL-1(圖2)，其中以菌株LTZ1分 泌IAA 量 最 大，為71.71 μg·mL-1，其 次 是 菌 株LMJ2，分泌IAA 量為69.13 μg·mL-1。菌株LNA2 分泌IAA 量最小，為12.45 μg·mL-1。

圖2 菌株分泌植物生長激素(IAA)的能力Figure 2 Indole acetic acid (IAA) secreted by strains

供試18 株菌株有機磷溶磷量介于51.76～115.06 μg·mL-1(圖3)，18 株 菌 株 溶 有 機 磷 的pH 介于2.20～4.37，其中， 菌株ZWF1 的溶有機磷含量最高為115.06 μg·mL-1，pH 2.20。供試18 株菌株無機磷 的 溶 磷 量 介 于9.22～380.28 μg·mL-1(圖4)，pH 4.07～6.64。其中菌株LNA2 溶無機磷量最高，達380.28 μg·mL-1，pH 4.29。其次菌株LPA7 溶無機磷量為321.57 μg·mL-1，pH 4.07。綜上，供試18 株菌株均能溶無機磷和有機磷。

圖3 菌株的溶有機磷能力Figure 3 Organic phosphate solubility of strains

圖4 菌株的溶無機磷能力Figure 4 Inorganic phosphate solubility of strains

2.2 抑制植物病原真菌能力

通過測定18 株菌株對病原真菌茄病鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌、銳頂鐮孢菌的抑菌能力(表2)，初篩發(fā)現(xiàn)菌株LNA2、LMY8、ZWA1、LMJ2、LMG2 對病原真菌銳頂鐮孢菌有抑制能力，而對其他病原真菌并無抑制能力。復(fù)篩發(fā)現(xiàn)菌株LMG2、LMJ2 對病原真菌銳頂鐮孢菌的抑菌能力顯著(P＜0.05)，抑菌率分別為31.00%和30.75%。

表2 植物根際促生菌(PGPR)對病原真菌的拮抗效果Table 2 Antagonistic effect of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) on pathogenic bacteria

2.3 優(yōu)良耐低溫PGPR 菌株鑒定

綜合評價各菌株促生特性和抑菌效果，篩選出6 株優(yōu)良PGPR 菌株，對其進行基于16S rRNA 基因序列的鑒定，通過同源序列比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，篩選得到的編號LMG2 菌株和LMJ2 菌株的16S rRNA 基因序列與Pseudomonas pisciumP50T的相似度分別為99.27%和99.51%； 另外兩株編號為LNA2 和LPA7 的菌株與Pseudomonas neuropathica的親緣關(guān)系最近，它們的16S rRNA 基因序列與P.neuropathicaP155T的相似度為99.11%。編號CND1的16S rRNA 基因序列與猴假單胞菌Pseudomonas simiaeOliT的相似度為99.78%，編號LMY8 的16S rRNA 基因序列與Pseudomonas kairouanensisKC12T的相似度為99.57% (圖5)。

圖5 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)進化樹Figure 5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA showing the phylogenetic relationships among isolated strains

3 討論

高寒草地的退化使得優(yōu)勢植被發(fā)生逆向演替，限制了植被根際的有益微生物發(fā)揮作用[26]。微生物肥料的出現(xiàn)，成為調(diào)控退化高寒地區(qū)植物、土壤及微生物三者的橋梁，使綠色高效的生態(tài)恢復(fù)方式成為了可能。因此，挖掘生存于高寒地區(qū)的多功能PGPR 菌株并研發(fā)微生物肥料，有望解決高寒退化草地修復(fù)的問題[27]。

氮和磷在植物生產(chǎn)、光合作用和大分子生物合成等過程中起著至關(guān)重要的作用。同時，在高寒生態(tài)系統(tǒng)中氮素和磷素是有機體必需的兩種限制性營養(yǎng)元素；在生物固氮過程中，土壤微生物扮演著不可替代的角色[28]，合理發(fā)揮固氮菌的生物固氮作用，對于修復(fù)和維穩(wěn)退化高寒草地生態(tài)有著重要意義。低溫是高寒地區(qū)影響植物正常生長的因素之一，低溫會導(dǎo)致植物細胞內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，從而降低抗氧化酶活性，最終導(dǎo)致植物細胞死亡，耐低溫PGPR 的接種可以增強植物耐低溫脅迫[17]。本研究測定的18 株耐低溫菌株中除4 株菌低溫下未表現(xiàn)出固氮酶活性外，除個別固氮能力較弱，剩余菌 株固氮酶活性介于25.43～230.52 nmol·(h·mL)-1。李明源等[19]在祁連山高寒草地分離的固氮菌株固氮能力與本研究相比較弱，但對垂穗披堿草(Elymus nutans)的生長有明顯促進作用，也可推測本研究分離的固氮菌也具有促進植物生長的潛力。本研究所篩選得到的P.simiae菌株促生特性與白潔等[20]的研究結(jié)果相比，本研究在低溫條件下測定的P.simiae固氮能力高于常溫下測定的P.simiae固氮能力，可見即使菌株同源，但在不同溫度的作用下固氮酶活性的大小仍有所不同，這與所分離PGPR 的植物、土壤、生境和地域等有關(guān)[13,23]。也可推測本研究篩選的固氮菌有望在實際使用中更適應(yīng)低溫的高寒草地，并發(fā)揮更好的固氮作用。溶磷菌能夠通過分泌有機酸等物質(zhì)來分解土壤中的難溶性磷酸鹽，改善土壤結(jié)構(gòu)與提高土壤養(yǎng)分促進植物吸收磷素，加速植物生長[28]。通過溶磷能力的測定，本研究中18 株菌株的溶有機磷量高于劉曉婷和姚拓[18]在紅原高寒草甸植株根際篩選的溶磷菌溶有機磷量，溶無機磷量則反之，這也許與配制溶磷培養(yǎng)基時所選擇的磷源、菌株自身特性有關(guān)[18]。本研究中菌株溶有機磷菌株的發(fā)酵液pH 整體偏低并與溶有機磷量沒有關(guān)聯(lián)，但溶無機磷量隨發(fā)酵液pH 的降低而增大。楊美英等[29]研究發(fā)現(xiàn)，溶磷培養(yǎng)基中pH 越低，表示菌株在溶磷過程中分泌的有機酸含量越高，種類越多。后續(xù)可以針對本研究篩選的溶磷菌株進行有機酸種類的研究和分析，深入探究溶磷的機制和機理。

IAA 在植物的生長發(fā)育中必不可少。由根際微生物分泌的IAA 可促進植物地上部分的生長以及根系伸長，增加了參與養(yǎng)分吸收的根毛和側(cè)根的數(shù)量[30]。Noori 和Saud[31]分離的20 株P(guān)GPR 中，有75%的菌株可分泌IAA，可分泌IAA 的PGPR 能夠促進植物根系生長。本研究綜合篩選獲得的6 株假單胞菌株均能分泌IAA，表明6 株菌對高寒草地優(yōu)勢植株生長發(fā)育具有促生潛力。高寒草地的退化引起根際病原微生物泛濫易使植物病害發(fā)生，影響植物生長[5,32]。為此，在篩選優(yōu)良PGPR 時，除了關(guān)注其固氮、溶磷和分泌IAA 能力，還需聚焦菌株在極端生境中是否具有抑制病原菌的能力。蘭曉君[33]從天祝草原草(Koeleria macrantha)根際分離的生防芽孢桿菌TZF1 均對小麥長蠕孢(Helmintho sporium tritici-vulgaris)、茄鏈格孢(Alternaria solani)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)等6 株病原真菌的抑菌率均在64%以上。楊成德等[34]從東祁連山高寒草地上珠芽蓼(Bistorta vivipara)分離的Z19 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)對核盤菌屬、絲核菌屬等的植物病原真菌具有抗性，且可能具有應(yīng)用在高寒草地的潛能。目前，芽孢桿菌屬有關(guān)抑制病原菌的研究已非常成熟。而假單胞菌屬菌株在植物病害的防治中也發(fā)揮著作用，前人研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬菌株一般可通過產(chǎn)生如抗生素、植物激素、揮發(fā)性化合物氰化氫和鐵載體等次級代謝物來有效控制植物病蟲害的發(fā)生，有利植物的生長發(fā)育[35-36]，除上述假單胞菌屬菌株通過產(chǎn)生次級代謝物來控制病害的途徑，Chen 等[37]研究發(fā)現(xiàn)P.pisciumZJU60 可以通過調(diào)控真菌組蛋白修飾來抑制禾谷鐮刀菌(F.graminearum)。有研究[22]報道，銳頂鐮孢菌(G.acuminata)是引起植物土傳病害的病原真菌之一，對植物的致病力僅次于禾谷鐮刀菌，當前對該病原真菌的拮抗研究缺乏報道。在本研究中，通過平板對峙法研究得出有5 株菌株均對病原真菌G.acuminata表現(xiàn)出拮抗作用。其中拮抗作用最強的菌株LMG2 經(jīng)鑒定為P.piscium，此菌株拮抗病原真菌的機制是否與上述蛋白調(diào)控有關(guān)還尚未可知，后續(xù)還需對該菌株拮抗病原真菌G.acuminata的機理進行深入研究。

本研究對候選菌株進行16S rRNA 基因序列比對后，分析結(jié)果顯示均屬于假單胞菌屬，這可能與假單胞菌能在4～37 ℃條件下生長[38]，且具有分布廣、耐受能力強的特性以及研究地區(qū)宿主植物所處生態(tài)環(huán)境的特殊性有關(guān)。并且從鑒定結(jié)果可知，存在兩個菌株為同一個屬同一個種且與模式菌株相似度相近，但由于菌株遺傳特性不同，所表現(xiàn)的促生特性各有差異，因此篩選菌株也應(yīng)從多方面綜合考慮[20,39]?？紤]到自然條件的不可控性，篩選獲得的6 株耐低溫多功能植物根際促生菌對于生長在高寒草地植物的實際促生效果還需進一步的研究與驗證。

4 結(jié)論

選取的18 株菌有14 株菌在低溫條件下均具有固氮、溶磷和分泌植物生長激素IAA 的能力。經(jīng)過特性測定，綜合比較獲得6 株優(yōu)良PGPR，其中菌株LPA7、菌株LNA2 溶有機磷和溶無機磷能力最強，菌株CND1 固氮能力最好，菌株LMJ2 分泌IAA 能力最強，菌株LMG2 拮抗病原真菌G.acuminata效果最好。 6 株優(yōu)良耐低溫菌株被鑒定為：菌株LMG2和LMJ2 為P.piscium，菌株LMY8 為P.kairouanensis，菌株CND1 為猴假單胞菌(P.simiae)，菌株LNA2、LPA7 為P.neuropathica。6 株優(yōu)良耐低溫菌株可為后續(xù)制作適用高寒草地的微生物菌劑提供優(yōu)質(zhì)菌株資源。