韓曉文，韓 碩，胡義鋒，王夢如，陳中義，朱永興，尹軍良

（1.長江大學(xué)濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心 / 長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 長江大學(xué)園藝園林學(xué)院, 湖北 荊州 434025；2.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430074）

空心蓮子草(Alternanthera philoxeroides)，也稱水花生、空心莧，屬多年生宿根草本植物，原產(chǎn)于南美洲，是一種“水陸兩侵”的外來入侵物種[1]。目前，空心蓮子草在20 余個(gè)省(市)均有分布，黃河以南的區(qū)域?yàn)楹τ绕鋰?yán)重，據(jù)2016 年統(tǒng)計(jì)，全國中度以上(蓋度大于30%)危害面積超過500 萬hm2，直接經(jīng)濟(jì)損失每年16 億～18 億元[2]，如何高效防治空心蓮子草已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。

植物受到生物/非生物脅迫時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)的氧化還原動態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致過氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH-)、超氧陰離子(O2-)等氧自由基(ROS)的過量產(chǎn)生[3-4]。適量的ROS 在生物體內(nèi)可作為第二信使參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活免疫細(xì)胞、引起細(xì)胞增殖、衰老和凋亡[5]，但ROS 的過度積累會導(dǎo)致植物細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[3]。其中過氧化氫酶(catalase, CAT)能夠通過催化電子轉(zhuǎn)移，將生物體內(nèi)多余H2O2還原成H2O 和O2，有效清除植物光呼吸和線粒體電子傳遞過程中產(chǎn)生的過氧化氫[6]。CAT 的相對分子質(zhì)量在200～400 kDa，通常由4 個(gè)亞基組成[7]。每個(gè)亞基在羧基端含有1 個(gè)血紅素分子和1 個(gè)CAT 體靶向信號肽(PTS1)序列[8]。根據(jù)CAT催化中心結(jié)構(gòu)的不同，CAT 可分為鐵卟啉結(jié)構(gòu)CAT(FeCAT)和錳卟啉結(jié)構(gòu)CAT (MnCAT) 。

大量研究表明，CATs基因具有時(shí)空表達(dá)特異性，例如玉米(Zeamays)ZmCAT1和ZmCAT3在籽粒發(fā)育整個(gè)過程均有表達(dá)，ZmCAT2僅在籽粒發(fā)育后期表達(dá)[9-10]。水稻(Oryzasativa)OsCATA和OsCATC的表達(dá)受晝夜節(jié)律調(diào)控，OsCATA在晚上特異性表達(dá)，OsCATC在清晨特異性表達(dá)[11]。同時(shí)CATs基因在脅迫應(yīng)答響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[12]。擬南芥(Arabidopsisthaliana) AtCAT1 通過降解H2O2來響應(yīng)非生物脅迫，此外，AtCAT2 和AtCAT3 可以降解H2O2來維持細(xì)胞內(nèi)ROS 的動態(tài)平衡[13]；過表達(dá)OsCATA和OsCATC提高了水稻的抗旱性，同時(shí)OsCATC 也可以被STRK1 磷酸化激活，從而提高水稻的耐鹽性和抗氧化性[11]；ZmCAT2轉(zhuǎn)基因煙草(Nocetoana tabacum)與野生型相比具有更強(qiáng)抗病性和活性氧脅迫的耐受性[14]。此外，CAT 在植物響應(yīng)除草劑脅迫中發(fā)揮重要作用，例如不同濃度的乙草胺和阿特拉津均能使肉芝軟珊瑚和短指軟珊瑚CAT 酶活性快速上升，且在一定范圍內(nèi)，CAT 酶活性隨著除草劑濃度升高和脅迫時(shí)間延長而持續(xù)上升[15]。不同濃度的噻隆·異噁酮施藥7、14 d 時(shí)玉米CAT 酶活性顯著提高，且活性隨著施藥時(shí)間的延長和藥劑濃度的降低而逐漸降低[16]。

到目前為止，CAT基因家族已在小麥(Triticum aestivum)[5]、水稻[11]、油菜(Brassicanapus)[17]等多種植物中進(jìn)行了鑒定分析，并對其脅迫響應(yīng)模式進(jìn)行了研究，但尚缺乏對空心蓮子草CAT 家族成員的系統(tǒng)認(rèn)識。因此，本研究對空心蓮子草的CAT基因進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，并分析了該基因家族成員在除草劑脅迫下的表達(dá)模式，旨在了解CAT 在空心蓮子草脅迫應(yīng)答響應(yīng)過程中的潛在作用，為空心蓮子草的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 空心蓮子草ApCAT 的鑒定

獲取空心蓮子草基因組數(shù)據(jù)庫[18]。從Pfam(http://pfam.xfam.org/)下載CAT (PF00199)的隱馬爾可夫模型序列，BLASTp 搜索空心蓮子草氨基酸序列數(shù)據(jù)庫，鑒定候選ApCAT (e-value ＜ 1e-10)[19]。獲得的候選序列通過Pfam (v35.0，http://Pfam.xfam.org)和 InterProScan (v93.0， http://www.ebi.ac.uk/InterPro Scan)進(jìn)行確認(rèn)，排除不包含CAT 結(jié)構(gòu)域的序列。

1.2 ApCAT 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用ClustalW2 軟件將ApCAT 與已知物種(水稻、擬南芥) CAT 氨基酸序列進(jìn)行多序列比對。使用ITOL 工 具(Interactive tree of Life， http://ITOL.embl.de)繪制包含ApCATs、AtCATs 和OsCATs 的系統(tǒng)發(fā)育樹，說明ApCATs 的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并輔助它們的命名[20]。

1.3 ApCAT 保守結(jié)構(gòu)域和基序分析

根據(jù)GFF3 基因結(jié)構(gòu)注釋信息，利用TBtools 繪制ApCATs 的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。使用MEME(版 本 5.5.1， http://meme-suite.org/tools/meme)識 別ApCATs 的保守基序[21]。參數(shù)設(shè)置如下：每個(gè)序列可以包含任意個(gè)的非重疊基序，不同基序的數(shù)量為10，基序?qū)挾确秶鸀? 到50 個(gè)氨基酸。利用TBtools繪制蛋白基序結(jié)構(gòu)圖。

1.4 ApCAT 蛋白質(zhì)特征分析

使用ExPASyServer10 (https://prosite.expasy.org/PS 50011)分析ApCATs 的蛋白質(zhì)基本特征，包括蛋白序列長度(Len)、分子量(MW)、等電點(diǎn)(pI)、總親水性(GRAVY)[22]。使用Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Plant multi)預(yù)測ApCATs 的亞細(xì)胞定位[23]。使用SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/)對ApCATs 的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模。

1.5 ApCATs 表達(dá)模式分析

從NCBI 的SRA 數(shù)據(jù)庫收集4 組空心蓮子草的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[24]。詳情信息：PRJNA256235，陸地和池塘中采集的混合組織樣本；PRJNA256237，低鉀脅迫下根部組織樣本；PRJNA263573，水中和盆栽種植的莖節(jié)組織樣本；PRJNA268359，山東濟(jì)南收集的“北方”種群和上海收集的“中央”種群上部第1～3 對葉片組織樣本。通過Cufflinks 計(jì)算ApCATs基因的表達(dá)水平(用標(biāo)準(zhǔn)化的FPKM 值表示)。使用log2(FPKM + 1)值，通過R 軟件包pheatmap 繪制熱圖，展示不同條件下ApCATs基因的表達(dá)模式[25]。

1.6 除草劑防效測試

試驗(yàn)于10 月中旬在長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)田中進(jìn)行，選取平均高度為10～15 cm、長勢一致的空心蓮子草植株，每次處理重復(fù)3 次，共18 個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積1 m2，每個(gè)處理噴施藥液量為250 mL，重復(fù)3 次，空白對照為清水。分別于0.5、1、3、5、7 d 觀察防治效果并取樣。供試藥劑及濃度如表1 所列。

表1 試驗(yàn)藥劑和濃度Table 1 Data for the agents and their concentrations

1.7 RT-qPCR 分析

除草劑處理0.5、1、3、5、7 d 時(shí)分別收集頂端嫩葉，-80 ℃保存。使用TRizol 試劑(GenStar，中國北京)提取總RNA，并用DNaseI (TaKaRa，中國大連)去除DNA。使用RevertAid 逆轉(zhuǎn)錄酶(Vazyme，中國南京)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后將cDNA稀釋至100 ng·μL-1。按照制造商的說明書，使用SYBR GreenMaster Mix (Vazyme，南京，中國)在CFX96 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)(BioRad，HercuLes，CA，USA)上進(jìn)行RT-qPCR。使用PrimerPremier5 軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物。20 μL RT-qPCR 反應(yīng)體系由10 μL 2 × SYBR Premix Extaq、正向和反向引物各0.4 μL、cDNA 2 μL 和7.2 μL ddH2O 組成。試驗(yàn)流程如下：95℃預(yù)變性30 s (步驟1)；95 ℃變性5 s (步驟2)，58℃退火15s，72 ℃延伸30 s，60 ℃熒光信號采集30 s(步驟3)；步驟2 至步驟3 循環(huán)40 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

使用2-ΔΔCt方法計(jì)算ApCAT基因的相對表達(dá)水平[5]，運(yùn)用Excel 2016 對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，使用單因素方差分析來計(jì)算平均值之間的顯著差異，本研究差異顯著水平均為P＜ 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 ApCAT 的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

為鑒定空心蓮子草基因組中的ApCAT基因，以CAT (PF00199)種子序列作為參考序列進(jìn)行本地BLASTp，并利用Pfam 驗(yàn)證候選序列中是否含有CAT 結(jié)構(gòu)域。最終從空心蓮子草基因組中鑒定到20 個(gè)ApCAT基因(圖1)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹所示的進(jìn)化關(guān)系，將它們分別命名為ApCAT1到ApCAT20。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類情況，將ApCAT基因家族分為3 個(gè)亞群(Group a、b、c)。

圖1 空心蓮子草、擬南芥和水稻CAT 成員的系統(tǒng)發(fā)育分析Figure 1 Phylogenetic analyses of catalase (CAT) from Alternanthera philoxeroides, Arabidopsis thaliana,and Oryza sativa

2.2 ApCATs 蛋白基序和基因結(jié)構(gòu)

根據(jù)GFF3 基因結(jié)構(gòu)注釋信息，使用TBtools 繪制ApCATs的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖，并根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的順序排列(圖2A)。所有ApCATs均不含內(nèi)含子，其中ApCAT7.a、ApCAT17.b和ApCAT16.b僅在5’端包含UTR 區(qū)域；ApCAT2.c、ApCAT8.c、ApCAT15.c、ApCAT9.c和ApCAT1.c僅在3’端包含UTR 區(qū)域；而ApCAT13.b和ApCAT19.c在兩端均含有UTR 區(qū)域(圖2B)。保守基序分析發(fā)現(xiàn)，從ApCATs 中鑒定到10 個(gè)motif，其中ApCATs3.c 含有的motif 最少，為2 個(gè)；ApCATs13.b 含有的motif 最多，為11 個(gè)；結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，親緣關(guān)系越近的ApCATs 含有越相似的motif (圖2A、B)。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，motif 1 到motif 4 和motif 7到motif 9 均為氧化氫酶核心結(jié)構(gòu)域(catalase domain)，motif 5 為過氧化氫酶相關(guān)的免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域(catalase-related immune-responsive domain)。其他motif 未匹配到已知的關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域(圖3)。

圖2 ApCATs 系統(tǒng)發(fā)育樹(A)、ApCATs 基因結(jié)構(gòu)(B)、ApCATs 蛋白motif 分布(C)Figure 2 Phylogenetic tree of ApCATs (A), gene structure of ApCATs (B) , and motif distribution of ApCATs (C)

圖3 ApCATs 保守基序Figure 3 Conservative motif in ApCATs

2.3 ApCATs 蛋白特征和三維結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)特性分析發(fā)現(xiàn)，ApCATs 氨基酸數(shù)量平均值為194 aa，分布范圍為74～492 aa，分子量平均值為22.32 kDa，分布范圍為8.51～57.05 kDa。等電點(diǎn)平均值為7.39，分布范圍為4.26～9.69，平均值小于8，故大部分ApCATs 為酸性蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定指數(shù)平均值為32.52，分布范圍為13.72～49.10，除ApCAT1.c、 ApCAT3.c、 ApCAT9.c、 ApCAT13.b、ApCAT15.c、ApCAT19.c、ApCAT20.c 外，其他ApCATs屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。親水性平均值-0.55，分布范圍為-1.17～-0.05，所有親水性的數(shù)值小于0，說明ApCATs 都是親水性蛋白質(zhì)。亞細(xì)胞定位預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，所有ApCATs 均分布在過氧化物酶體中，同時(shí)部分ApCATs 也預(yù)測可能分布在線粒體、葉綠體和細(xì)胞核內(nèi)(表2)。

表2 ApCATs 蛋白質(zhì)特征分析Table 2 Characterization of Alternanthera philoxeroides ApCAT proteins

通過SWISS-MODEL 完成了ApCATs 的三維同源性建模(圖4)，所有的ApCATs 主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和隨機(jī)卷曲構(gòu)成，而這4 種結(jié)構(gòu)在ApCATs 蛋白中的比例不同，隨機(jī)卷曲所占比例最大(23.71～51.14%)，其次是α-螺旋(14.58%～37.11%)和延伸鏈(9.60%～33.98%)，β-轉(zhuǎn)角所占比例最小(5.75%～19.42%)。

圖4 使用SWISS-MODEL 生成的ApCATs 的3D 模型預(yù)測Figure 4 Predicted three-dimensional models of ApCATs generated by using SWISS-MODEL

2.4 ApCATs 的表達(dá)模式分析

ApCAT1.c、ApCAT2.c、ApCAT3.c、ApCAT12.b、ApCAT14.b、ApCAT16.b、ApCAT17.b、ApCAT18.b和ApCAT19.c在不同處理下的表達(dá)水平普遍較高，而其他ApCATs表達(dá)水平偏低或不表達(dá)。在水中和盆栽種植的莖節(jié)組織樣本中，ApCAT14.b、ApCAT18.b、ApCAT17.b、ApCAT3.c和ApCAT19.c的 表 達(dá) 量 先 上升，在12 h 時(shí)達(dá)到峰值后下降；而ApCAT16.b的表達(dá)量先下降，在12 h 降到最低后回升。此外，根系組織在低鉀脅迫下，ApCAT6.a、ApCAT14.b、ApCAT17.b、ApCAT18.b和ApCAT19.c的 表 達(dá) 量 下 降，ApCAT4.a和ApCAT12.b的表達(dá)量上升。對于空心蓮子草的不同種群，除了ApCAT14.b在山東濟(jì)南收集的“北方”種群中的表達(dá)量高于上海收集的“中央”種群外，其余ApCATs在兩個(gè)種群中的表達(dá)水平相差不大(圖5)。

圖5 不同組織和處理的ApCATs 表達(dá)熱圖Figure 5 Heat map of ApCATs in different tissues and under different treatments

2.5 除草劑對空心蓮子草的防治效果

5 種除草劑對空心蓮子草的防治效果不同。20%氯氟吡氧乙酸和13%噁草酮防治效果最好，20%氯氟吡氧乙酸在藥后5 d 時(shí)引起植株退綠、萎蔫，停止生長，而13%噁草酮在藥后3 d 時(shí)引起頂端幼嫩組織壞死；其次是10%乙羧氟草醚和41%草甘膦，在藥后5～7 d 時(shí)引起頂端幼嫩組織失綠枯黃，并且41%草甘膦在藥后7 d 時(shí)開始出現(xiàn)褐色枯斑；50%異丙隆防治效果不明顯，藥后7 d 后均無明顯變化(圖6)。

圖6 5 種除草劑藥對空心蓮子草的生長的影響Figure 6 Influence of five herbicides on Alternanthera philoxeroides growth

2.6 ApCATs 的除草劑誘導(dǎo)表達(dá)模式分析

挑選6 個(gè)高水平表達(dá)的ApCATs 基因，利用RTqPCR 檢測其在5 種農(nóng)藥處理下的相對表達(dá)量(圖7)。ApCATs 對5 種農(nóng)藥處理均有響應(yīng)。

圖7 5 種除草劑不同處理時(shí)間下ApCATs 的相對表達(dá)量Figure 7 Expression patterns of ApCATs in the presence of the five herbicides

在氯氟吡氧乙酸處理下，2 個(gè)ApCATs的表達(dá)量呈下降趨勢，4 個(gè)ApCATs的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，但5 d 時(shí)6 個(gè)ApCATs表達(dá)量顯著升高，其中ApCAT12.b的表達(dá)量升高最顯著，是CK 的5.5倍。此外，6 個(gè)ApCATs在3 d 時(shí)表達(dá)量均降低，其中ApCAT17.b最顯著，僅為CK 的9% (圖7A)。

在 噁 草 酮 處 理 下，ApCAT3.c、ApCAT12.b和ApCAT14.b在3～7 d 時(shí)有明顯的下降趨勢，ApCAT16.b、ApCAT17.b和ApCAT18.b在1～5 d 時(shí)有明顯的上升趨勢。此外，在1 和7 d 時(shí)6 個(gè)ApCATs的表達(dá)量均下降，其中ApCAT18的表達(dá)量最低，分別只有CK 的0.3%和0.2% (圖7B)。

在乙羧氟草醚處理下，5 個(gè)ApCATs 呈先升高后下降再升高的趨勢，4 個(gè)ApCATs 在3 d 時(shí)表達(dá)量顯著降低，其中ApCAT14.b的表達(dá)量最低，僅為CK 的0.8%，而ApCAT17.b在1 d 時(shí)表達(dá)量最低，為CK 的19%。此外ApCAT18.b在0.5 d 時(shí)表達(dá)量升高最顯著，是CK 的1.9 倍，隨后在1 d 時(shí)下降并穩(wěn)定在CK 的78%～94%(圖7C)。

草甘膦處理下，6 個(gè)ApCATs基因的相對表達(dá)量呈下降趨勢(圖7A)，其中ApCAT14.b、ApCAT17.b和ApCAT18.b表達(dá)量降低最為明顯，分別下降至CK 的19%、9%和17%。ApCAT3.c和ApCAT12.b，在3 和7 d 時(shí)表達(dá)量高于CK，最高達(dá)到1.5 倍。(圖7D)。

異丙隆處理下，處理1 d 時(shí)，ApCAT12.b表達(dá)量與CK 相比上升3.1 倍，其余5 個(gè)ApCATs均低于CK，其中ApCAT18最低，僅為CK 的0.4%。此外ApCAT12在0～7 d 時(shí)表達(dá)量均較高，是CK 的1.7～4.2 倍，而ApCAT14.b、ApCAT16.b和ApCAT18.b表達(dá)量持續(xù)下降，尤其是ApCAT16.b在處理1 d 后均不足CK 的15% (圖7E)。

3 討論

空心蓮子草在2003 年被列入“中國第一批外來入侵物種名單”，具有極強(qiáng)表型可塑性和入侵性，對我國生態(tài)系統(tǒng)和社會經(jīng)濟(jì)造成惡劣的影響。已有研究表明CAT 在空心蓮子草響應(yīng)鋅、銅等重金屬脅迫[26-28]和澇漬脅迫[29]中發(fā)揮調(diào)控作用。同時(shí)，CAT在植物響應(yīng)除草劑中發(fā)揮重要作用[30-33]，而CAT 在空心蓮子草響應(yīng)除草劑中的作用尚未研究。因此，開展基因組水平空心蓮子草ApCATs基因的系統(tǒng)鑒定和分析，了解其表達(dá)模式，尤其揭示其響應(yīng)除草劑的誘導(dǎo)表達(dá)特征，可為開展ApCATs逆境脅迫響應(yīng)功能研究奠定基礎(chǔ)，也為空心蓮子草的有效防治提供指導(dǎo)。

本研究從空心蓮子草全基因組中鑒定了20 個(gè)ApCAT基因家族成員(ApCAT1～ApCAT20)，其成員數(shù)量高于擬南芥(3 個(gè))[13]、水稻(3 個(gè))[11]、小麥(10 個(gè))[5]和甘藍(lán)型油菜(14 個(gè))[17]。其中ApCAT編碼的蛋白質(zhì)長度為74～492 aa (表2)，其蛋白長度差異較大且相對于其他物種來說長度較短，例如在油菜 中[17]，BnCATs 長 度 為477 (BnCAT13)～1 040 aa(BnCAT10)； 在 小 麥 中[5]， TaCATs 長 度 為 290(TaCAT3-A2)～494 aa (TaCAT2-A)；而水稻[11]和大豆[34]中，所有的CAT 長度均為492 aa。通過保守基序分析發(fā)現(xiàn)，ApCAT基因含有10 個(gè)motif，其中motif1 到motif5、motif7 到motif9 均注釋為過氧化氫酶功能結(jié)構(gòu)域。此外結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，處于同一亞組的ApCAT 含有越相似的基因結(jié)構(gòu)和motif，但個(gè)別家族成員的motif 數(shù)量存在一定的差別，推測該現(xiàn)象是因?yàn)锳pCAT 在進(jìn)化過程中丟失或新增Motif 所致[35]。

為了解ApCATs基因的表達(dá)水平，借助已經(jīng)發(fā)表的RNA-seq 數(shù)據(jù)，對20 個(gè)空心蓮子草CAT基因表達(dá)水平和表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析，并揭示了在不同環(huán)境條件下的ApCATs 表達(dá)水平(圖6)。本研究表明，ApCATs的表達(dá)具有時(shí)空特異性。ApCAT14.b、ApCAT18.b、ApCAT17.b、ApCAT16.b、ApCAT12.b、ApCAT3.c、ApCAT2.c、ApCAT19.c和ApCAT1.c在 不同處理下(低鉀脅迫、水分變化)的表達(dá)水平普遍較高，并且在不同的水分環(huán)境中總體表達(dá)量變化趨勢相似。因此推測不同的水分環(huán)境的變化對ApCAT基因的表達(dá)影響較小。此外，在山東濟(jì)南收集的“北方”種群和上海收集的“中央”種群中除ApCAT14.b的表達(dá)量在葉片差異較大外，其余ApCATs的表達(dá)水平相差不大。這表明，在正常生長的情況下，空心蓮子草ApCAT的表達(dá)量受緯度、海拔、溫度、光照等條件的影響較小，推測ApCATs的表達(dá)可能受到特定環(huán)境條件的誘導(dǎo)，例如干旱[36]、鹽[37]、低溫[38]等脅迫。

為了研究除草劑誘導(dǎo)ApCAT的表達(dá)特征，本研究對6 個(gè)高水平表達(dá)的ApCATs在5 種除草劑脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20%氯氟吡氧乙酸藥后5 d 時(shí)植株開始出現(xiàn)失綠、黃花的癥狀；藥后7 d 時(shí)植株已經(jīng)完全枯黃萎蔫，停止生長。與本研究結(jié)果類似，高宗軍等[39]的研究表明，20%氯氟吡氧乙酸(100 g·hm-2, 有效成份)會使空心蓮子草葉片紫化、萎蔫，并在10 d 時(shí)引起植株死亡。同時(shí)，表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)ApCAT3.c、ApCAT12.b和ApCAT16.b在5～7 d 時(shí)的表達(dá)量均顯著高于CK。而在水稻中，各濃度下氯氟吡氧乙酸在6 d 時(shí)能夠引起水稻根系和葉片組織中活性氧的積累，同時(shí)積累程度隨著濃度的增加而升高；且低濃度的氯氟吡氧乙酸(0.1 mg·L-1)顯著增加了CAT 酶活性和CAT同工酶的表達(dá)量[32]。因此推測在空心蓮子草中，氯氟吡氧乙酸可能同樣導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧的積累，從而誘導(dǎo)CAT基因的表達(dá)。

在噁草酮處理中，3 d 時(shí)出現(xiàn)了頂葉白化的現(xiàn)象。類似的，在高宗軍等[39]的研究中，13%噁草酮(400 g·hm-2)藥后空心蓮子草葉片白化、干卷，并在3 d 時(shí)死亡。同時(shí)，水稻植株噁草酮(1 270 g·hm-2)藥后6 d，CAT 酶活性增加了22%，CAT 同工酶的表達(dá)量也顯著增強(qiáng)[31]。本研究中，ApCAT12.b和ApCAT18.b的表達(dá)量在5 d 時(shí)顯著高于CK，而其余4 個(gè)ApCATs在6 d 左右時(shí)的表達(dá)量并未高于CK，并且所有ApCATs的表達(dá)量在7 d 時(shí)均顯著降低，其原因未知，需要進(jìn)一步的研究。

在乙羧氟草醚處理中，10%乙羧氟草醚藥后7 d 時(shí)也引起心葉枯黃，而相關(guān)研究表明，20%乙羧氟草醚(80 g·hm-2)在藥后5 d 時(shí)會引起空心蓮子草心葉卷曲枯黃[39]，這一差異可能是由于藥劑濃度不同而導(dǎo)致的。表達(dá)模式分析結(jié)果表明，ApCAT3.c、ApCAT12.b、ApCAT16.b和ApCAT18.b在 施 藥1 d 內(nèi)表達(dá)水平顯著升高，推測這4 個(gè)ApCATs在藥后短時(shí)間內(nèi)受到乙羧氟草醚的誘導(dǎo)。

在草甘膦的處理中，空心蓮子草在41%草甘膦藥后7 d 時(shí)出現(xiàn)輕微枯黃并開始出現(xiàn)枯斑。而高宗軍等[39]研究表明，41%草甘膦(800 g·hm-2)在藥后4 d 時(shí)引起空心蓮子草葉片枯黃并有枯斑，與本研究結(jié)果存在一定的差異，推測原因可能是噴施方式和施藥劑量不同。在玉米[40]、莎草(Cyperus rotundus)[41]和大豆(Glycine max)[42]等植物中，草甘膦藥后3 d會引起植株體內(nèi)CAT 酶活降低。而類似的，在本研究中ApCAT14.b、ApCAT16.b、ApCAT17.b和ApCAT18.b的表達(dá)量在藥后7 d 內(nèi)均較低，推測草甘膦可以通過抑制CAT基因的表達(dá)，從而降低CAT 酶活性。

在異丙隆處理中，空心蓮子草在50%異丙隆處理7 d 內(nèi)均無任何變化，而相關(guān)研究表明，異丙隆一種持效型除草劑，在藥后10 d 后才會引起空心蓮子草植株死亡[39]。結(jié)合表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，ApCAT3.c、ApCAT12.b和ApCAT18.b的表達(dá)量在0.5 d 時(shí)顯著升高，并且ApCAT12.b在0.5 d 后繼續(xù)升高，在3 d 時(shí)達(dá)到峰值，而ApCAT17.b在處理7 d 時(shí)顯著升高并達(dá)到峰值。因此推測ApCAT12.b在處理前期受異丙隆的誘導(dǎo)，ApCAT17.b在處理后期受到誘導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究共鑒定出20 個(gè)ApCATs基因。所有的ApCATs 均只含有一個(gè)CAT 結(jié)構(gòu)域，且均為親水性蛋白；所有ApCATs 均預(yù)測定位于過氧化物酶體，個(gè)別ApCATs 也有定位線粒體、葉綠體和細(xì)胞核的可能。ApCAT成員受緯度、海拔、溫度、光照、水分條件等影響較小，表達(dá)水平相對穩(wěn)定，但響應(yīng)除草劑脅迫而誘導(dǎo)差異表達(dá)。20%氯氟吡氧乙酸和13%噁草酮防治效果好，結(jié)合RT-qPCR 分析結(jié)果表明，ApCAT 家族成員在空心蓮子草響應(yīng)除草劑處理過程中顯著差異表達(dá)，參與對除草劑脅迫的應(yīng)答過程。