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        腺苷三磷酸處理對鮮切黃瓜的保鮮作用

        2023-12-11 06:58:08陳逸婷孟憲偉王春飛鄭永華
        食品科學 2023年21期
        關鍵詞:總酚外源果蔬

        陳逸婷,湯 靜,孟憲偉,王春飛,金 鵬,鄭永華

        (南京農業(yè)大學食品科學技術學院,江蘇 南京 210095)

        鮮切果蔬是最小限度加工的果蔬產品,具有食用方便、新鮮衛(wèi)生等優(yōu)點,廣受消費者喜愛[1]。黃瓜(Cucumis sativusL.)果實肉質脆嫩、營養(yǎng)價值高,具清熱解毒、減肥健體和美容護膚等功效,其鮮切產品是可生食大宗蔬菜品類的代表,在西式快餐、中式配餐等方面的市場需求量越來越大,發(fā)展前景廣闊[2]。但切分等加工處理會造成機械損傷,使鮮切黃瓜在貯藏期間出現(xiàn)顏色變暗、果實軟化和微生物滋生等現(xiàn)象,導致品質劣變、貨架期變短[3]。能量虧損是引起果蔬采后品質劣變的關鍵因素,腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)是其生命活動的主要能量來源,外源ATP處理也因其安全有效而被用于果蔬保鮮。研究表明,采用外源ATP處理可保持南果梨[4]、龍眼[5]、荔枝[6]和綠豆芽[7]等果蔬較高的能荷水平,延緩其采后衰老和品質劣變進程,從而起到保鮮作用,但外源ATP處理對鮮切黃瓜保鮮的影響還鮮見研究報道。

        γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作為一種非蛋白氨基酸,在微生物和動植物中普遍存在,具有緩解焦慮、降低血壓、治療癲癇、提高記憶力和抗癌、抗衰老等生理功效[8]。植物性食品中GABA含量隨種類和組織不同而存在差異,但總體含量較低,不能滿足人體生理需求[9]。研究表明,植物在遭受鹽害[10]、機械損傷[11]、缺氧[12]和低溫脅迫[13]等逆境脅迫時,GABA含量會快速大量增加,以抵御逆境傷害。已有研究報道,鮮切加工導致的機械損傷可誘導鮮切梨[14]、胡蘿卜[15]、獼猴桃[16]和萵苣[17]中GABA的積累。同時,切分處理造成的機械損傷也會促進鮮切果蔬中酚酸和黃酮類等酚類物質產生,從而發(fā)揮愈傷作用,抵御切分損傷[18]。如研究表明,鮮切加工能夠促進鮮切紫甘藍[19]、花椰菜[20]和火龍果[21]等鮮切果蔬中酚類物質含量增加,同時增強產品的抗氧化活性,且酚類物質的合成積累隨著切分損傷強度的增加而增多,抗氧化活性也提高。因此,鮮切加工可望成為一種逆境脅迫方式來促進鮮切果蔬中酚類物質和GABA等活性成分含量提高,進而提高產品的抗氧化活性和潛在的營養(yǎng)保健價值。但對于鮮切加工和外源ATP處理對鮮切黃瓜品質和活性成分積累的影響還鮮見研究報道。為此,本實驗先對不同濃度外源ATP處理對鮮切黃瓜貯藏期間的品質及總酚和GABA含量變化的影響進行研究,同時研究外源ATP通過苯丙烷類代謝、GABA支路及多胺降解途徑調控活性成分富集的可能機制,以期為鮮切黃瓜的保鮮及利用提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        挑選大小均勻、無損傷和成熟度一致的新鮮‘綠翠2號’黃瓜,購買后立即運回實驗室。

        氯化鑭、ATP、L-苯丙氨酸、輔酶A 南京梅林學海生物科技有限公司;β-巰基乙醇、亮抑酶肽、p-香豆酸 南京菲亞生物科技有限公司;氧化型輔酶II鈉鹽、二硫蘇糖醇、N,N-二甲基苯胺 南京邁博生物科技有限公司;苯甲酰氯、辣根過氧化物酶、L-谷氨酸南京丁貝生物科技有限公司;谷氨酸脫氫酶、腐胺、亞精胺、精胺 南京晶格化學科技有限公司。

        1.2 儀器與設備

        TA-XT2i型質構儀 美國FTC公司;UV-1600型分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;CR-400型色差儀 日本Minolta公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司;LC-20A高效液相色譜儀 日本島津有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 材料處理

        將挑選好的黃瓜用蒸餾水清洗表面上細刺后于200 μL/L次氯酸鈉溶液中浸泡5 min,去皮后用消毒好的搓絲板將黃瓜刨成6 cm×0.2 cm×0.2 cm的絲狀,分別用0(蒸餾水,對照(CK))、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol/L ATP溶液浸泡10 min,晾干后用19 cm×12 cm×4.5 cm塑料保鮮盒包裝,每盒約100 g,外覆聚乙烯薄膜包裹后置于10 ℃環(huán)境中貯藏,在貯藏的6、12、24、48 h和72 h時取樣,一部分用于物理指標測定,另一部分經液氮速凍后測定相關代謝指標。預實驗結果表明,1.6 mmol/L ATP處理可最有效地延緩鮮切黃瓜貯藏期間品質下降和促進總酚和GABA合成,因此選擇此濃度處理進行后續(xù)機理研究。

        1.3.2 指標測定

        1.3.2.1 色澤和菌落總數(shù)

        參照Fan Kai等[22]的方法,采用色差儀測定L值。菌落總數(shù)的測定參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》。

        1.3.2.2 硬度和抗壞血酸含量

        采用探頭直徑為2 mm的TA-XT2i型質構儀測定鮮切黃瓜硬度,參照Zambrano-Zaragoza等[23]的檢測參數(shù)并稍加修改:穿刺深度1.5 mm、穿刺速率100 mm/min、觸發(fā)力0.5 N,硬度單位為N。抗壞血酸含量的測定參考曹建康等[24]的鄰菲羅啉比色法,單位為mg/100 g。

        1.3.2.3 總酚含量

        總酚含量測定參考趙磊等[25]的方法,單位為mg/kg。

        1.3.2.4 苯丙氨酸解氨酶、4-香豆酸輔酶A連接酶和肉桂酸羥化酶活力

        參照Ke等[26]的方法測定苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活力,稱取1 g黃瓜凍樣,加入5 mL含有40 g/L聚乙烯吡咯烷酮、2 mmol/L乙二胺四乙酸、5 mmol/Lβ-巰基乙醇的100 mmol/L硼酸-硼砂緩沖液(pH 8.8)研磨至勻漿,于12 000×g、4 ℃離心15 min得到上清液。取3 mL上述硼酸緩沖液和0.5 mL 20 mmol/LL-苯丙氨酸溶液混合,37 ℃反應10 min后再加入1 mL上清液,渦旋后迅速保溫60 min,測定保溫前后在290 nm波長處的吸光度,以每分鐘吸光度變化0.001定義為一個PAL活力單位(U)。4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate-CoA ligase,4CL)和肉桂酸羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase,C4H)活力參考Wang Li等[27]的方法測定,分別以體系每分鐘在333 nm和340 nm波長處吸光度變化0.001定義為一個4CL、C4H活力單位(U)。

        1.3.2.5 GABA和谷氨酸含量

        GABA含量測定參照Wang Kaikai等[28]的方法并略有改動。反應體系渦旋混勻后于室溫下放置6 min,經沸水浴10 min、冰浴5 min終止反應,最后加入800 μL體積分數(shù)60%乙醇溶液后于20 ℃保溫20 min,測定645 nm波長處吸光度,并以BABA標準品溶液繪制標準曲線,進而計算樣品中的BABA含量,單位為mg/g。谷氨酸(glutamate,Glu)含量參考Al-Quraan等[29]的方法測定。將研缽預冷后稱取1 g黃瓜凍樣,加入3 mL 75%甲醇溶液研磨成勻漿,4 ℃、12 000×g離心15 min。取20 μL上清液,加入200 μL 100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.3,含有7.5 mmol/Lβ-NAD+和1 U/mL谷氨酸脫氫酶)混勻后于30 ℃反應1 h,測定340 nm波長處反應前后的吸光度變化,并以谷氨酸標準品溶液繪制標準曲線,進而計算樣品中的谷氨酸含量,單位為mg/g。

        1.3.2.6 谷氨酸脫羧酶活力

        參考Li Dong等[30]的方法測定谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)活力。反應體系為0.2 mL粗酶液和0.5 mL 0.1 mol/L pH 5.8磷酸鉀緩沖液(內含3 mmol/LL-谷氨酸、40 μmol/L磷酸吡哆醛),終止反應后吸取0.5 mL上清液,根據(jù)1.3.2.5節(jié)方法測定GABA含量,以每小時生成1 μmol GABA定義為一個GAD活力單位。

        1.3.2.7 腐胺、亞精胺和精胺含量

        多胺含量測定參照Madebo等[31]的方法。稱取3 g黃瓜凍樣,加入5 mL、體積分數(shù)5%預冷的高氯酸溶液研磨至勻漿后于冰箱中4 ℃浸提1 h,12 000×g、4 ℃離心25 min。將上清液和2 mol/L氫氧化鈉溶液各2 mL與10 μL苯甲酰氯混勻30 s,37 ℃水浴20 min,再加入飽和氯化鈉和無水乙醚各2 mL,混勻后吸取1 mL醚相進行氮吹,再加入1 mL無水乙醚進行二次氮吹,吹干后加入0.4 mL色譜級甲醇渦旋溶解洗出多胺,過0.22 μm有機濾膜后進行高效液相色譜測定。色譜條件:流動相:色譜級甲醇-水(65∶35,V/V),流速0.8 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量20 μL,色譜柱為C18反相柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測波長254 nm,單位為nmol/g。

        1.3.2.8 4-氨基丁醛脫氫酶、二胺氧化酶和多胺氧化酶活力

        4-氨基丁醛脫氫酶(4-amino aldehyde dehydrogenase,AMADH)活力參考Wang Kaikai等[28]的方法測定。反應體系為0.5 mL上清液和2 mL 0.1 mol/L pH 8.0磷酸鉀緩沖液(內含1 mmol/L NAD+、1 mmol/L 4-氨基丁醛),30 ℃孵育20 min,以340 nm波長處反應前后吸光度每分鐘變化0.001定義為一個AMADH活力單位(U)。二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)和多胺氧化酶(polyamine oxidase,PAO)活力測定參考Li Ziying等[32]的方法,均以反應體系每分鐘在555 nm波長處吸光度變化0.001定義為一個DAO、PAO活力單位。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

        以上指標測定均取3 個平行樣,每個樣3 次重復,所有指標均以鮮質量計。采用SAS 8.1軟件進行統(tǒng)計分析,并利用Origin Pro 8.0軟件繪圖。

        2 結果與分析

        2.1 不同濃度ATP處理對鮮切黃瓜品質的影響

        鮮切黃瓜呈淺綠色,但隨著貯藏時間延長表面顏色逐漸變暗,影響感官品質和食用價值。L值表示明亮度,可以反映鮮切黃瓜顏色變暗程度,由圖1A可知,鮮切黃瓜貯藏期間L值呈下降趨勢,ATP處理能延緩L值的下降,維持鮮切黃瓜的色澤,其中1.6、2.0 mmol/L ATP處理效果最佳。

        圖1 不同濃度ATP處理對鮮切黃瓜L值(A)、菌落總數(shù)(B)、硬度(C)和抗壞血酸含量(D)的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of ATP treatment on L value (A),total bacterial count (B), firmness (C) and ascorbic acid content (D) of fresh-cut cucumber

        鮮切黃瓜因切分導致的組織損傷易導致微生物滋生,菌落總數(shù)可以反映其受微生物侵染的程度。由圖1B可知,鮮切黃瓜貯藏期間菌落總數(shù)不斷上升,對照組貯藏72 h后菌落總數(shù)比初始值增加了2.59(lg(CFU/g)),但貯藏結束后各組鮮切黃瓜菌落總數(shù)均小于106CFU/g,仍然在安全可食用范圍中。ATP處理組菌落總數(shù)明顯低于對照組,說明ATP處理能有效抑制鮮切黃瓜微生物生長,但不同處理濃度組間無顯著差異。

        硬度是反映鮮切黃瓜新鮮度和感官品質的重要指標。如圖1C所示,鮮切黃瓜硬度在貯藏前期迅速下降,后期趨于穩(wěn)定。ATP處理可以有效延緩鮮切黃瓜硬度的降低,保持脆嫩口感,其中1.6 mmol/L ATP處理組的硬度在整個貯藏過程中均高于其他處理組。

        抗壞血酸含量是反映果蔬營養(yǎng)品質的主要指標。如圖1D所示,鮮切黃瓜抗壞血酸含量變化趨勢與硬度相似,前期下降較快,后期趨于平緩。整個貯藏過程中,ATP處理組的抗壞血酸含量均比對照組高,表明ATP處理能減緩抗壞血酸含量降低,其中1.6、2.0 mmol/L ATP處理能較好地抑制抗壞血酸含量的損失。

        2.2 不同濃度ATP處理對鮮切黃瓜總酚和GABA含量的影響

        由圖2A可知,鮮切黃瓜貯藏期間總酚含量呈先升高后降低的趨勢,除2.0 mmol/L ATP處理外,其他組均于貯藏48 h時達到最高值。在整個貯藏期間ATP處理組總酚含量均比對照組高,說明ATP處理促進了鮮切黃瓜中總酚的合成,且能使總酚含量在貯藏前期上升較快。其中1.6 mmol/L ATP處理對促進總酚積累的效果最佳,在貯藏48 h后總酚含量明顯高于其他處理組。由圖2B可知,鮮切黃瓜貯藏期間GABA含量呈先上升后下降并趨于穩(wěn)定的趨勢,除2.0 mmol/L ATP處理組外,其他組在6 h時達到峰值。不同濃度ATP處理均可提高鮮切黃瓜GABA含量。整體來看,1.6 mmol/L ATP處理對提高GABA含量的效果最好。

        圖2 不同濃度ATP處理對鮮切黃瓜總酚(A)和GABA(B)含量的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of ATP treatment on total phenolic content (A) and GABA content (B) of fresh-cut cucumber

        綜合上述結果可知,1.6 mmol/L ATP處理能最有效地延緩鮮切黃瓜品質下降及提高總酚和GABA的含量,因此,選用此濃度處理進行后續(xù)ATP促進鮮切黃瓜活性成分積累的機理研究。

        2.3 1.6 mmol/L ATP處理對鮮切黃瓜苯丙烷類代謝關鍵酶活力的影響

        酚類物質合成主要通過苯丙烷類代謝途徑,PAL、4CL和C4H是催化酚類物質合成的關鍵酶。如圖3所示,鮮切黃瓜在貯藏期間PAL、4CL和C4H活力均呈先升高后降低的趨勢,在整個貯藏期間ATP處理組的PAL、4CL和C4H活力顯著高于對照組,表明ATP處理能激活鮮切黃瓜苯丙烷類代謝關鍵酶活力,從而促進酚類物質的合成與積累。

        圖3 ATP處理對鮮切黃瓜PAL(A)、4CL(B)和C4H(C)活力的影響Fig. 3 Effect of ATP treatment on PAL (A), 4CL (B) and C4H (C)activities of fresh-cut cucumber

        2.4 1.6 mmol/L ATP處理對鮮切黃瓜GABA支路的影響

        植物中GABA的主要合成途徑為GABA支路,Glu在GAD的作用下脫羧生成GABA。如圖4A所示,鮮切黃瓜貯藏期間Glu含量先下降后上升并趨于穩(wěn)定。在整個貯藏期間ATP處理組的Glu含量明顯低于對照組,貯藏6 h時比對照組減少了15.6%,說明ATP處理促進了Glu的降解。由圖4B可知,鮮切黃瓜貯藏期間GAD活力呈先上升后下降的趨勢,在6 h達到峰值,在整個貯藏期間ATP處理組的GAD活力顯著高于對照組,說明ATP處理可以促進Glu向GABA的轉化。綜上,ATP處理能激活鮮切黃瓜中GABA支路代謝關鍵酶活力,促進Glu降解從而合成GABA。

        2.5 1.6 mmol/L ATP處理對鮮切黃瓜多胺降解途徑的影響

        GABA合成的另一條重要途徑為多胺降解,它是指多胺在DAO、PAO催化下產生γ-氨基丁醛,再經AMADH作用生成GABA的過程。如圖5A~C所示,鮮切黃瓜貯藏期間腐胺、亞精胺和精胺3 種多胺含量前6 h均迅速下降,隨后稍有回升后又緩慢下降,ATP處理組3 種多胺的含量均比對照組低,說明ATP處理促進了多胺的降解。由圖5D~F可知,貯藏期間鮮切黃瓜DAO、PAO和AMADH活力總體呈先上升后下降的趨勢,在整個貯藏期間ATP處理組的這3 種酶活力明顯高于對照組,說明ATP處理可以促進多胺向GABA的轉化。綜上,ATP處理可通過提高鮮切黃瓜中多胺降解途徑關鍵酶活力促進多胺降解,從而合成GABA。

        圖5 ATP處理對鮮切黃瓜腐胺含量(A)、亞精胺含量(B)、精胺含量(C)、DAO活力(D)、PAO活力(E)和AMADH活力(F)的影響Fig. 5 Effect of ATP treatment on putrescine content (A), spermidine content (B), spermine content (C), DAO activity (D), PAO activity (E)and AMADH activity (F) of fresh-cut cucumber

        3 討 論

        黃瓜鮮切加工后內部組織結構受到破壞,導致營養(yǎng)汁液外流和果肉大面積暴露在空氣中,從而促進果肉軟化、表面顏色變暗和微生物的增殖,進而加速品質劣變,降低商品性和食用價值。能量是新鮮果蔬生命活動的基礎,果蔬采后能量虧損會導致活性氧積累及細胞膜結構完整性受損,進而促進組織褐變、質地軟化和腐爛等果蔬衰老和品質劣變的發(fā)生[33]。已有研究報道,外源ATP處理能影響果蔬采后能量水平,進而調控衰老和品質劣變進程。如外源ATP處理能降低羊肚菌貯藏期間的菌落總數(shù),提高呈香物質含量,保持較好的品質[34]。Chen Lin等[7]研究發(fā)現(xiàn)ATP處理可有效降低綠豆芽褐變程度,并保持較高的抗壞血酸含量,延長貯藏期。Li Meiling等[35]發(fā)現(xiàn)ATP處理可抑制龍眼果實細胞膜透性和褐變指數(shù)的上升,從而延緩果實采后衰老褐變。外源ATP處理也可提高冷藏南果梨果實中內源ATP含量和能荷水平,有效延緩呈香物質含量的下降,維持其風味品質[36]。本實驗中,不同濃度ATP處理可以有效保持鮮切黃瓜色澤,延緩菌落總數(shù)上升,抑制硬度和抗壞血酸含量下降,從而改善貯藏品質,延長貨架期,其中1.6 mmol/L ATP處理對品質維持效果最佳,因此在鮮切黃瓜貯藏保鮮中具有廣泛的應用價值。

        研究表明,胞外ATP可能作為一種信號分子與質膜上的特異受體結合,提高胞質游離鈣離子的含量,激活NADPH氧化酶活性,誘導活性氧產生,從而激活苯丙烷類代謝途徑,促進酚類物質的合成積累[37]。酚類化合物是果蔬中重要的次生代謝產物,果蔬鮮切后會產生應激反應導致多酚類物質合成積累以抵御損傷脅迫,同時提高產品的抗氧化活性和營養(yǎng)價值[38]。酚類物質主要通過苯丙烷類代謝途徑產生,莽草酸和苯丙氨酸在PAL、C4H和4CL等酶的催化作用下轉化為酚酸和黃酮類化合物[18]。研究表明,外源ATP處理可維持果蔬采后較高的總酚含量和抗氧化活性。如Aghdam等[39]發(fā)現(xiàn)ATP處理能顯著提高雙孢蘑菇中PAL活力,同時降低多酚氧化酶活力,從而促進總酚含量增加,延緩其衰老進程。采用外源ATP處理可以維持龍眼較高的類黃酮和總酚含量,同時抑制多酚氧化酶活性和果實褐變[5]。綠豆芽經ATP處理后多酚氧化酶活力降低,總酚含量提高,從而有利于抑制褐變和維持品質[7]。本實驗中,1.6 mmol/L ATP處理可提高鮮切黃瓜貯藏期間PAL、4CL和C4H的活力,促進酚類物質的合成積累,進而提高總酚含量。綜上,外源ATP處理可能作為信號分子促進活性氧產生,進而通過提高苯丙烷類代謝途徑中關鍵酶活性來促進鮮切黃瓜中酚類物質的合成積累,從而提高其抗氧化活力和營養(yǎng)價值。

        植物在遭受逆境脅迫時GABA會迅速積累使得植物脅迫耐受性更強[40]。高等植物中有兩條合成GABA的途徑,分別為GABA支路和多胺降解途徑,GAD為GABA支路的關鍵酶,其活性受鈣離子調控,而DAO和PAO等胺氧化酶及AMADH是多胺降解途徑的關鍵酶[41],無論哪條途徑,GABA合成的生化反應都需要能量保障。ATP處理也有可能作為信號分子通過激活鈣離子等第二信使的產生來調控各種細胞反應,近年來的研究表明,鮮切加工和CaCl2處理可提高這些GABA合成關鍵酶的活性,促進鮮切梨[14]、萵苣[17]、胡蘿卜[28]和火龍果[42]等鮮切果蔬產品中GABA的積累。本實驗中,1.6 mmol/L ATP處理可提高鮮切黃瓜貯藏期間GAD、DAO、PAO和AMADH的活力,促進Glu和多胺向GABA轉化,進而提高鮮切黃瓜中GABA含量。鮮切黃瓜貯藏前期Glu含量呈下降趨勢,說明Glu可能被迅速消耗生成GABA,隨后Glu含量上升可能是因為GABA轉化形成的琥珀酸進入三羧酸循環(huán)生成Glu。ATP處理組多胺含量在貯藏過程中先迅速下降,隨后稍有回升后又緩慢下降,可能是因為ATP處理提高了貯藏前期胺氧化酶和AMADH活力,促進多胺降解合成GABA,之后逆境脅迫生成的多胺大于分解,多胺含量上升,但隨著貯藏時間延長,果蔬衰老導致產生的多胺含量減少,最后呈下降趨勢。上述實驗結果表明,ATP處理能激活鮮切黃瓜中GABA支路和多胺降解途徑關鍵酶活性,促進Glu和多胺分解,進而提高GABA含量。但ATP處理通過促進GABA合成關鍵酶活性進而促進果蔬中GABA的合成積累的機理尚鮮有相關文獻報道,是否是因為外源ATP處理提高了果蔬中內源ATP水平或作為信號分子誘導鈣離子濃度升高進而調控GABA代謝有待進一步研究。

        綜上,1.6 mmol/L ATP能有效保持鮮切黃瓜較好的色澤和較低的菌落總數(shù),維持較高的果實硬度和抗壞血酸含量,從而延緩品質下降;同時1.6 mmol/L ATP處理可激活苯丙烷類代謝途徑和GABA代謝途徑中關鍵酶活性,促進總酚和GABA等活性成分的合成積累,提升鮮切黃瓜抗氧化活性和潛在的營養(yǎng)價值。

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