戴妍賢，沈 娟，龔文進，韓永斌，李丹丹，陶 陽,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學 全谷物食品工程研究中心，江蘇 南京 210095）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）又稱黑果花楸，是薔薇科腺肋花楸屬植物[1]，20世紀90年代引進中國[2]，并于2018年9月獲批為國家新資源食品原料[3]。黑果花楸含有豐富的酚類物質(zhì)，主要包括花色苷、黃酮醇、黃烷醇、原花青素、酚酸等，其中花色苷可占多酚含量的25%[4]。已有研究表明，黑果花楸花色苷具有抑菌[5]、抗炎[6]、保護肝臟[7]、預防糖尿病[8]等功效。然而，花色苷類多酚在儲藏過程中易受到可溶性糖、有機酸和蛋白質(zhì)等組分影響，導致穩(wěn)定性和功能性下降[9]。為了有效發(fā)揮黑果花楸花色苷的精準營養(yǎng)功能，提高產(chǎn)品穩(wěn)定性，亟需對黑果花楸花色苷的分離純化技術(shù)開展研究。

常見花色苷分離純化方法包括柱層析[10]、高速逆流色譜[11]、膜分離[12]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[13]等，但上述方法無法同時在分離效率、處理規(guī)模、樣品純度、分離成本上滿足食品工業(yè)生產(chǎn)的需求。其中，大孔樹脂柱層析法多用于花色苷粗提物的純化，在分離桑葚[14]、葡萄[15]、藍莓[16]花色苷方面已有研究基礎，具有成本較低、處理量大的優(yōu)點[17]。但是，大孔樹脂柱層析依然存在分離效率和花色苷回收率低、溶劑消耗量大、樹脂用量大等缺點。為了實現(xiàn)黑果花楸花色苷的高效精準制備，需對傳統(tǒng)柱層析分離技術(shù)進行改良。

超聲波是頻率高于20 kHz的機械波，其在液態(tài)介質(zhì)中傳播產(chǎn)生的機械和空化效應可顯著促進加工過程中物質(zhì)的遷移，強化食品干制[18]、組分提取[19]、分離純化[20]等加工單元。目前，已有研究報道在開放體系下（如三角瓶、燒杯等）超聲可用于強化大孔樹脂對花色苷及其他酚類物質(zhì)的吸附和解吸附。Wu Yue等[21]發(fā)現(xiàn)，在279 W/L超聲輔助下，三角瓶中大孔樹脂純化后藍莓花色苷的回收率提高了52.8%。在Ismail等[22]的研究中，超聲處理顯著提高了開放體系下大孔樹脂吸附/解吸附猴面包樹果肉中黃酮類化合物的能力，并縮短了平衡時間。此外，本課題組前期預實驗結(jié)果表明，超聲可影響固定床體系下大孔樹脂吸附花色苷的傳質(zhì)過程。但是，目前尚鮮見關(guān)于超聲耦合大孔樹脂固定床分離的研究報道。為了促進分離新技術(shù)的開發(fā)和花色苷資源的高效利用，需系統(tǒng)研究超聲耦合固定床分離純化效果及傳質(zhì)特性。

綜上，本研究設計超聲耦合大孔樹脂固定床裝置，系統(tǒng)分析超聲場下黑果花楸花色苷的分離純化行為。研究不同超聲強度和柱床高度對固定床中大孔樹脂吸附黑果花楸花色苷傳質(zhì)特性的影響，以及不同超聲強度和洗脫液極性對固定床中大孔樹脂解吸附黑果花楸花色苷傳質(zhì)行為的影響。在此基礎上，進一步分析吸附/解吸附過程中單體花色苷及其他酚類物質(zhì)的分離特性及樹脂顆粒的理化性質(zhì)，以期為花色苷分離純化新技術(shù)和新設備的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黑果花楸（A. melanocarpa(Michx.) Ell）由遼寧省鞍山市岫巖縣黑果花楸繁育基地提供，品種為‘富康源一號’。樣品運達實驗室后立即保存于－18 ℃冰箱中。

XAD-7HP大孔樹脂 北京索萊寶科技有限公司；花色苷、黃酮、酚酸標準品 上海源葉生物科技有限公司；其他化學品均為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設備

VCX-150超聲波破碎儀 美國Sonics公司；BS-100A自動部份收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；UV-2802型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；H1650-W臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；XOWX-100真空冷凍干燥機 南京先歐儀器制造有限公司；LC-2010A HPLC儀 日本島津公司；Mastersizer 300激光粒度儀 英國馬爾文公司；BELSORP小型N2吸附儀 德國拜耳公司。

超聲輔助大孔樹脂固定床吸附和解吸附裝置由本課題組自主設計，如圖1所示，裝置主要包括帶夾套的層析柱（用于控溫）、超聲探頭、超聲波發(fā)生器、恒流泵（2 個）和自動接收器。其中層析柱內(nèi)半徑為1.3 cm，超聲探頭半徑為3.2 mm，超聲探頭插于固定床中，探頭前端距層析柱底部尼龍濾網(wǎng)0.5 cm，超聲波發(fā)生器的功率為20 kHz，最大輸出功率為150 W。

圖1 超聲輔助固定床純化裝置Fig. 1 Ultrasound-assisted fixed bed purification device

1.3 方法

1.3.1 大孔樹脂活化

XAD-7HP大孔樹脂參照Wu Yue等[21]的方法進行活化。樹脂于去離子水中充分溶脹后，用95%（體積分數(shù)，下同）乙醇溶液沖洗至洗脫液澄清，再用去離子水洗滌至無乙醇氣味。用4%鹽酸溶液充分沖洗樹脂，并用去離子水洗滌至中性。隨后，用質(zhì)量分數(shù)5%氫氧化鈉溶液充分沖洗樹脂，再用去離子水洗滌至中性。最后，將樹脂在60 ℃烘箱內(nèi)干燥至恒質(zhì)量。

1.3.2 黑果花楸粗提液的制備

粗提液的制備參照Tao Yang等[23]的方法并稍作修改。黑果花楸在4 ℃條件下解凍12 h，與50%乙醇溶液以1∶3（m/V）比例混合打漿，置于300 W超聲波細胞破碎儀中20 ℃下處理30 min，結(jié)束后使用 8 層紗布過濾，進一步于8 000 r/min條件下離心20 min得上清液。隨后，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，制得黑果花楸粗提液，存放于－18 ℃待用。

1.3.3 超聲輔助大孔樹脂固定床吸附和解吸附

1.3.3.1 超聲輔助固定床吸附

將活化后的樹脂于去離子水中充分溶脹，緩慢轉(zhuǎn)移入層析柱中，控制溶液液面比固定床層高1 cm。將去離子水以3 mL/min的速率沖洗柱床2 h，充分平衡柱床。將初始花色苷質(zhì)量濃度（ρA,0）為200 mg/L的黑果花楸粗提液（pH 2.5）以3 mL/min的速度上樣，在柱床底端收集流出液，每管6 mL，并測定花色苷質(zhì)量濃度（ρA,t）。吸附過程中超聲強度分別為0、8.44、18.76 W/cm2，柱床高度分別為2.5、4.5 cm，采用全因子法進行實驗設計，共計6 組超聲輔助大孔樹脂固定床吸附處理，每組吸附處理重復3 次。

以ρA,t/ρA,0為縱坐標，吸附時間為橫坐標，構(gòu)建不同處理下的吸附穿透曲線[24]，并得出吸附突破時間（tb）（ρA,t/ρA,0＝0.1所需的時間）和流穿時間（ts）（ρA,t/ρA,0＝0.9所需的時間）[25-26]，進一步計算相關(guān)傳質(zhì)參數(shù)，包括吸附量（qt）（按公式（1）計算）、吸附率（At）（按公式（2）計算）、傳質(zhì)區(qū)長度（按公式（3）計算）。固定床在tb和ts時的吸附量分別為突破吸附量（qtb）和流穿吸附量（qts），對應的吸附率為突破吸附率（Atb）和流穿吸附率（Ats）。

式中：v為流速/（mL/min）；ρA,0為進樣花色苷質(zhì)量濃度/（mg/L）；ρA,t為t時刻流出液中花色苷質(zhì)量濃度/（mg/L）；t為時間/min；m為樹脂質(zhì)量/g；lb為柱床高度/cm。

1.3.3.2 超聲輔助固定床解吸附

裝柱及平衡過程同1.3.3.1節(jié)，固定床高度設為4.5 cm。以3 mL/min的流速將75 mL黑果花楸粗提液（pH 2.5，花色苷質(zhì)量濃度ρA,0為200 mg/L）上樣，然后使用4 倍柱床體積的去離子水沖洗，去除床層內(nèi)可溶性糖、有機酸等雜質(zhì)，在柱床底端收集流出液，測定其中可溶性糖、有機酸、花色苷質(zhì)量，判斷雜質(zhì)分離效果。

水洗完成后，使用乙醇-水洗脫液解吸附花色苷，流速為3 mL/min。在柱床底端收集流出液，每管6 mL，測定花色苷質(zhì)量濃度（ρA,t）。解吸附過程中超聲強度分別為0、8.44、18.76 W/cm2，洗脫液乙醇體積分數(shù)分別為25%、60%和95%，采用全因子法進行實驗設計，共計9 組超聲輔助大孔樹脂固定床解吸附處理，每組解吸附處理重復3 次。以時間為橫坐標、ρA,t為縱坐標，繪制動態(tài)解吸附曲線，并計算解吸附過程中花色苷解吸附量（mt）（按公式（4）計算）和解吸附終點對應的解吸附率（D）（按公式（5）計算）。

式中：v為流速/（mL/min）；ρA,t為t時刻流出液中花色苷質(zhì)量濃度/（mg/L）；t為時間/min；ρA,0為進樣花色苷質(zhì)量濃度/（mg/L）；VI為粗提液進樣體積/L；ρW為進樣及水洗過程中流出液花色苷質(zhì)量濃度/（mg/L）；VW為上樣及水洗過程流出液總體積/L。

1.3.4 大孔樹脂固定床純化前后的花色苷和多酚純度

收集1.3.3.2節(jié)中解吸附后的樣品，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，然后冷凍干燥（真空度15 Pa、時間48 h）并稱質(zhì)量。結(jié)束后測定凍干粉中總花色苷和總酚質(zhì)量，分別計算樣品中花色苷和多酚的純度（P）（按公式（6）計算）。

式中：m1為樣品質(zhì)量/mg；m2為樣品中總花色苷或總酚質(zhì)量/mg。

1.3.5 黑果花楸粗提液和純化液中組分測定

分析吸附、解吸附過程所收集樣液中總花色苷、總酚、可溶性糖、有機酸、單體花色苷和非花色苷單體酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.3.5.1 總花色苷質(zhì)量濃度的測定

總花色苷質(zhì)量濃度的測定采用分光光度法[27]。使用酸化乙醇（V（乙醇）∶V（水）∶V（HCl）＝69∶30∶1）適當稀釋所收集待測樣品，在540 nm波長處測定吸光度，按公式（7）計算總花色苷質(zhì)量濃度（ρA）。

式中：A540nm為540 nm波長處吸光度；D為樣品稀釋倍數(shù)；總花色苷質(zhì)量濃度以每升樣品液中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量表示。

1.3.5.2 總酚質(zhì)量濃度的測定

總酚質(zhì)量濃度的測定采用福林-酚比色法[28]。取0.2 mL適當稀釋后的樣品，依次加入1.5 mL稀釋10 倍體積的福林-酚試劑及1.5 mL Na2CO3溶液（75.0 g/L），混勻后室溫避光靜置1 h，于765 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸為標準品制作標準曲線，根據(jù)標準曲線方程計算總酚質(zhì)量濃度，總酚質(zhì)量濃度以每升樣品液中沒食子酸的質(zhì)量表示。

1.3.5.3 可溶性糖質(zhì)量濃度的測定

可溶性糖質(zhì)量濃度的測定采用硫酸-蒽酮比色法[29]。取1 mL適當稀釋后的樣品，依次加入1 mL去離子水和0.5 mL蒽酮溶液（1 g蒽酮溶于50 mL乙酸乙酯）。隨后加入5 mL濃硫酸，混勻后煮沸并保持1 min，冷卻后于630 nm波長處測定吸光度。以無水葡萄糖為標準品制作標準曲線，根據(jù)標準曲線方程計算可溶性糖質(zhì)量濃度，可溶性糖質(zhì)量濃度以每升樣品液中葡萄糖的質(zhì)量表示。

1.3.5.4 單體花色苷質(zhì)量濃度的測定

采用HPLC法測定單體花色苷的質(zhì)量濃度[30]。HPLC條件如下：TC-C18柱（4.6 mm×25 mm，5 μm）；檢測波長520 nm；流動相A為0.5%三氟乙酸溶液，流動相B為乙腈。洗脫條件：0～5 min，10%～12% B；5～14 min，12%～13% B；14～16 min，13%～14% B；16～18 min，14%～16% B；18～19 min，16%～18% B；19～22 min，18%～22% B；22～35 min，22%～30% B；35～45 min，10% B；柱溫30 ℃；流速0.6 mL/min，進樣量10 μL。

1.3.5.5 非花色苷單體酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度的測定

采用HPLC法測定單體酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度[31]。HPLC條件如下：Inertsil ODS-3柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；酚酸類成分檢測波長為280 nm，黃酮類成分檢測波長為350 nm；流動相A為1%醋酸溶液，流動相B為含有1%醋酸的甲醇溶液。洗脫條件為：0～10 min，10%～26% B；10～25 min，26%～40% B；25～45 min，40%～65% B；45～55 min，65%～95% B；55～58 min，95%～10% B；58～65 min，10% B；柱溫25 ℃；流速0.6 mL/min，進樣量20 μL。

1.3.5.6 有機酸質(zhì)量濃度的測定

采用HPLC法測定有機酸的質(zhì)量濃度[30]。HPLC條件：TC-C18柱（4.6 mm×25 mm，5 μm）；檢測波長210 nm；流動相為0.08 mol/L KH2PO4溶液（用磷酸調(diào)節(jié)至pH 2.9）。洗脫條件：等度洗脫，柱溫30 ℃，流速0.7 mL/min，進樣量20 μL。

1.3.6 可溶性糖及有機酸流出率的測定

1.3.6.1 可溶性糖流出率

按1.3.5.3節(jié)方法測定黑果花楸粗提液中可溶性糖質(zhì)量濃度，根據(jù)進樣體積計算進樣黑果花楸粗提液中總可溶性糖質(zhì)量（ms1/mg）。收集進樣和去離子水洗脫過程流出液，按1.3.5.3節(jié)方法測定其中可溶性糖質(zhì)量濃度，根據(jù)流出液體積計算流出液中可溶性糖質(zhì)量（ms2/mg）。按公式（8）計算可溶性糖流出率（Rs）。

1.3.6.2 有機酸流出率

按1.3.5.6節(jié)方法測定黑果花楸粗提液中主要有機酸的質(zhì)量濃度，根據(jù)進樣體積計算進樣黑果花楸粗提液中主要有機酸的總質(zhì)量（ma1/mg）。收集進樣和去離子水洗脫過程流出液，按1.3.5.6節(jié)方法測定其中有機酸的質(zhì)量濃度，根據(jù)流出液體積計算流出液中有機酸質(zhì)量（ma2/mg）。按公式（9）計算有機酸流出率（Ra）。

1.3.7 大孔樹脂結(jié)構(gòu)表征

1.3.7.1 掃描電子顯微鏡觀察

收集不同處理組吸附后的大孔樹脂，在掃描電子顯微鏡專用鎳銅合金板上粘貼適量樣品，然后鍍一層導電性的金膜（約15 nm），移入掃描電子顯微鏡下進行觀察。

1.3.7.2 樹脂粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)分析

收集不同處理組吸附后的大孔樹脂，采用Mastersizer 300激光粒度儀分析粒徑；采用BELSORP小型氮氣吸附儀測定比表面積、總孔容以及平均孔徑，測定方法為Brunaueremmet-Teller（BET）法[32]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗重復3 次，實驗結(jié)果以平均值±標準差表示，使用SPSS 25.0軟件進行顯著性分析，運用最小顯著差異法進行兩兩比較，以P＜0.05表示差異顯著，采用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲對大孔樹脂固定床吸附黑果花楸花色苷的影響

2.1.1 固定床吸附流穿曲線

如圖2A所示，無超聲處理條件下，花色苷的吸附流穿曲線呈典型斜“S”型[33]，超聲作用后流穿曲線形狀在吸附初始階段發(fā)生改變，同時，在同一柱床高度下，超聲處理組的吸附流穿曲線位于未超聲組上方，表明超聲明顯改變了固定床中的吸附傳質(zhì)行為，促進了柱床內(nèi)花色苷的溶出，降低了固定床的吸附量。同時，相同超聲強度下，柱床高度為4.5 cm時的花色苷流穿曲線均位于柱床高度2.5 cm組的下方，這是由于柱床高度增加后，柱床內(nèi)吸附活性位點數(shù)量增加，且軸向移動路徑增長。

圖2 不同條件下的黑果花楸花色苷吸附流穿曲線（A）、吸附動力學曲線（B）及吸附率變化曲線（C）Fig. 2 Breakthrough curves (A), adsorption kinetic curves (B) and adsorption rate curves (C) of total anthocyanins from A. melanocarpa under different treatments

當流出液中花色苷質(zhì)量濃度為進樣初始質(zhì)量濃度的1/10時（ρA,t/ρA,0＝0.1）定義為吸附“突破”[25]，當流出液中花色苷質(zhì)量濃度為進樣初始質(zhì)量濃度的9/10（ρA,t/ρA,0＝0.9）時定義為吸附“流穿”。由表1可知，超聲可縮短固定床吸附突破時間（tb）和吸附流穿時間（ts），柱床高度為2.5 cm時，未超聲組tb為57.5 min，8.44、18.76 W/cm2超聲組的tb分別較未超聲組縮短了55.3%和65.8%，表明超聲加快了花色苷在固定床內(nèi)的軸向運動速率，促使花色苷較早流出。

表1 不同條件下黑果花楸花色苷吸附流穿曲線的傳質(zhì)參數(shù)Table 1 Representative mass transfer parameters for breakthrough curves of total anthocyanins from A. melanocarpa under different treatments

由圖2B可知，吸附前期，超聲處理對大孔樹脂固定床內(nèi)花色苷的吸附量無明顯影響，隨著吸附的進行，超聲降低了花色苷的吸附量，且超聲強度越大、超聲時間越長，吸附量下降越明顯，與圖2A結(jié)果相對應。同時，由表1可知，超聲明顯減小了固定床突破吸附量（qtb），柱床高度為2.5 cm時，未超聲組的qtb為11.0 mg/g，8.44、18.76 W/cm2超聲組的qtb較未超聲組分別減少了56.3%和66.5%。

如圖2C所示，當柱床處于吸附“突破”狀態(tài)時，2.5 cm和4.5 cm柱床內(nèi)花色苷突破吸附率（Atb）分別為95.0%～97.2%和96.1%～97.3%，超聲均未明顯影響花色苷的吸附率。當柱床處于吸附“流穿”狀態(tài)時，超聲略微降低了柱床內(nèi)花色苷流穿吸附率（Ats），柱床高度為2.5 cm時，未超聲及8.44、18.76 W/cm2超聲作用下的Ats分別為51.1%、44.6%和44.3%。

綜上，花色苷在固定床吸附過程中的傳質(zhì)行為主要分為向樹脂顆粒內(nèi)部的擴散運動和在樹脂顆粒間的低速層流運動[25]，由于超聲對前者的促進作用弱于后者，導致花色苷吸附量發(fā)生一定程度的降低，但是花色苷吸附率在tb前無明顯變化。因此，建議在固定床達到吸附“突破”狀態(tài)之前采用超聲強化吸附，以縮短吸附時間。此外，超聲對固定床內(nèi)流體在樹脂顆粒間運動的促進作用，可促進有機酸和可溶性糖等物質(zhì)與花色苷分離，提高花色苷與雜質(zhì)的分離度。

2.1.2 超聲輔助吸附過程中花色苷類及非花色苷單體酚類物質(zhì)吸附量和吸收率的變化

通過質(zhì)譜鑒定結(jié)果可知，黑果花楸粗提液中花色苷類多酚主要為矢車菊素-3-O-半乳糖苷及矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷，非花色苷單體酚類物質(zhì)主要為原花青素B2、蘆丁、綠原酸、高香草酸、對羥基苯甲酸和原兒茶酸等，相關(guān)質(zhì)譜信息見附表1，本研究結(jié)果與Zhu Rui[34]和Zhang Yiwen[35]等報道的黑果花楸多酚組成結(jié)果相似。

由圖3、4可知，大孔樹脂固定床可有效吸附黑果花楸粗提液中的單體酚類物質(zhì)，其中，未超聲條件下，經(jīng)4.5 cm柱床吸附270 min后，矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷的吸附量分別達到16.7 mg/g和15.5 mg/g，吸附率分別為80.6%和91.7%，原花青素B2和綠原酸兩種非花色苷單體酚類物質(zhì)的吸附量分別達到103.2 mg/g和23.3 mg/g，吸附率分別為85.2%和93.0%。

圖3 不同吸附條件下黑果花楸粗提液中單體花色苷類和非花色苷單體酚類物質(zhì)吸附量的變化Fig. 3 Changes in the amounts of adsorbed individual anthocyaninic and non-anthocyaninic phenolics from the crude extract of A. melanocarpa under different adsorption conditions

如圖3、4所示，與超聲對總花色苷吸附量和吸附率的影響相似，超聲在縮短吸附時間的同時降低了單體酚類物質(zhì)在柱床內(nèi)的吸附量和吸附率。相較于未超聲組，超聲場處理下各單體酚類物質(zhì)吸附量和吸附率下降范圍分別為0～19.3%和0～19.8%，表明超聲作用對固定床分離單體酚類物質(zhì)的影響較為可控。但是，在不同柱床高度和吸附時間下，超聲對固定床吸附單體酚類物質(zhì)的影響有所差異。其中，2.5 cm柱床內(nèi)超聲處理組矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、原花青素B2、綠原酸和高香草酸的吸附量和吸附率均低于同一時間下的未超聲組，且隨著吸附時間的延長，超聲對吸附效果的影響有所增大，例如2.5 cm柱床內(nèi)，18.76 W/cm2超聲處理30 min和270 min時，相較于未超聲組，矢車菊素3-O-阿拉伯糖苷的吸附率分別下降了6.61%和16.49%。而在柱床高度為4.5 cm時，相較于未超聲組，吸附0～60 min內(nèi)超聲對6 種單體酚類物質(zhì)的吸附量和吸附率均無明顯影響，這可能是因為較大的柱床體積“稀釋”了超聲能量，緩解了超聲對單體酚類物質(zhì)的加速流出作用。在兩種柱床高度下，相較于未超聲組，超聲處理均未明顯影響蘆丁的吸附量和吸附率，推測原因是黑果花楸粗提液中蘆丁含量較低，可被固定床充分吸附，減少了其在樹脂顆粒間的流動。

2.2 超聲對大孔樹脂固定床解吸附黑果花楸花色苷的影響

2.2.1 黑果花楸粗提液中有機酸和可溶性糖的分離度分析

為了更好地研究超聲對花色苷解吸附的影響，進樣后采用去離子水沖洗柱床去除黑果花楸粗提液中的有機酸和可溶性糖，洗脫過程中上述兩種物質(zhì)的分離度如圖5所示。與文獻[36]的結(jié)果相似，大孔樹脂幾乎不吸附有機酸和可溶性糖。去離子水洗脫3 個柱床體積后，草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸等有機酸和可溶性糖的去除率均達到90%以上，繼續(xù)洗脫至4 個柱床體積，有機酸和可溶性糖的流出量接近0 μg，此柱床狀態(tài)用于后續(xù)花色苷解吸附的研究。

圖5 黑果花楸粗提液進樣和洗脫過程中有機酸（A）和可溶性糖（B）的流出量及流出率Fig. 5 Efflux amounts and efflux rates of organic acids (A) and soluble sugars (B) during the loading of the crude extract of A. melanocarpa and fixed bed washing

結(jié)合2.1.1節(jié)的研究結(jié)果，超聲可以促進固定床內(nèi)流體在樹脂顆粒間的流動，可考慮將其應用于去離子水洗脫有機酸和可溶性糖的過程中，以促進雜質(zhì)流出，但超聲對多酚粗提液中雜質(zhì)的去除效率需進一步驗證。

2.2.2 固定床動態(tài)解吸附曲線

由圖6可知，超聲對不同極性溶液洗脫過程的影響不一。95%（體積分數(shù)，下同）乙醇溶液洗脫時，花色苷洗脫峰峰形窄且高，隨著洗脫液極性的增加，洗脫峰高度降低且拖尾加重，表明洗脫液極性的增加會導致花色苷洗脫效率降低。這是因為XAD-7HP大孔樹脂為弱極性樹脂，隨著洗脫液極性的增大，洗脫液與樹脂之間極性差增大，導致花色苷解吸附效果降低[37]。此外，對比超聲處理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60%和95%乙醇溶液洗脫時，超聲對花色苷的溶出時間無明顯影響，流出液中花色苷質(zhì)量濃度均在接近的時間范圍內(nèi)達到最高，且不同超聲強度下花色苷的解吸附量差異較小。但是，25%乙醇溶液洗脫時，超聲處理提高了解吸附流出液中花色苷的質(zhì)量濃度和解吸附量，解吸附15 min時，18.76 W/cm2超聲處理組流出液中花色苷質(zhì)量濃度達到180.6 mg/L，未超聲組流出液中花色苷質(zhì)量濃度為165.0 mg/L；解吸附48 min時，0、8.44、18.76 W/cm2超聲處理下花色苷解吸附量分別為10.3、10.7、11.6 mg。18.76 W/cm2超聲作用下花色苷解吸附量提高了12.6%。

圖6 不同超聲處理下黑果花楸花色苷動態(tài)解吸附曲線及對應解吸附量Fig. 6 Desorption kinetic curves of total anthocyanins from A. melanocarpa under different ultrasonic treatments

解吸附過程中的傳質(zhì)行為包括花色苷從樹脂顆粒內(nèi)向外擴散和隨洗脫液在樹脂顆粒間的低速層流運動[25]。洗脫液極性較小時花色苷可輕易從樹脂顆粒內(nèi)溶出[24]，因此，60%和95%乙醇溶液洗脫時，超聲對花色苷解吸附傳質(zhì)過程無明顯影響。25%乙醇溶液洗脫時，花色苷與樹脂之間的非共價結(jié)合較難被洗脫液破壞，而超聲可促進非共價鍵的解離[21]，因此，此條件下超聲可促使花色苷由樹脂內(nèi)向外轉(zhuǎn)移到洗脫液中，并促進花色苷在樹脂顆粒間隙向下流動，進而提高花色苷解吸附量。

2.2.3 洗脫液極性、超聲強度對解吸附效果的影響

進一步分析解吸附結(jié)束時解吸附時間及對應流出液中總花色苷和總酚的解吸附率和純度（表2），解吸附終點設置為流出液中花色苷質(zhì)量濃度不超過2 mg/L。由表2可知，25%乙醇溶液洗脫時，解吸附時間為114～134 min，此時總花色苷和總酚的解吸率分別為87%和54%左右，純度分別為49%和65%左右；95%乙醇溶液洗脫時，解吸附時間為43.7～47.0 min，此時總花色苷和總酚的解吸率分別為97%和93%左右，純度分別為26%和74%左右。以上結(jié)果表明，減小洗脫液極性可有效縮短解吸附時間并顯著提高解吸附率，且其對非花色苷單體酚類物質(zhì)的解吸附促進作用更顯著。這可能是由于花色苷基本結(jié)構(gòu)中包含大量的極性羥基[38]，其在較高極性洗脫液中的解吸附效果優(yōu)于其他酚類物質(zhì)。此外，25%乙醇溶液洗脫時，增加超聲強度可縮短解吸附所需時間，同時可小幅提升花色苷和總酚的解吸附率和純度。例如，18.76 W/cm2超聲可使25%乙醇溶液洗脫時解吸附多酚的時間縮短14.9%，而總花色苷和總酚解吸附率分別提高2.6%和4%。綜上，結(jié)合本研究中花色苷和多酚純度測定結(jié)果，如果純化目的為回收花色苷，建議采用高極性的洗脫液，并考慮使用超聲強化固定床解吸附；如果純化目的為回收非花色苷單體酚類物質(zhì)，則建議采用低極性的洗脫液。

表2 不同處理條件下的解吸附時間及對應的總花色苷和總酚解吸附率及純度Table 2 Desorption times, desorption rates and purities of total anthocyanins and total phenols under different desorption conditions

本研究中，除18.76 W/cm2超聲輔助60%和95%乙醇溶液解吸附花色苷的兩組外，其余處理組花色苷純度均大于25%，達到了花色苷作為食品添加劑使用的標準[21]。其中，純化后所得花色苷純度最高為（48.8±1.2）%。經(jīng)測定，本研究所使用黑果花楸粗提液中總酚純度為（8.9±0.2）%，而純化后所得總酚純度最高為（78.7±0.3）%，總酚純度提高了7.8 倍，且高于同類研究結(jié)果，如李斌等[37]使用XAD-7大孔樹脂固定床純化所得黑果花楸多酚純度為64.4%。

2.2.4 超聲輔助解吸附過程中流出液花色苷類和非花色苷單體酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度的變化

如圖7所示，各處理組流出液中均為原花青素B2的質(zhì)量濃度最高，矢車菊素-3-O-半乳糖苷次之，蘆丁質(zhì)量濃度最低。與圖6結(jié)果相似，無論超聲與否，95%和60%乙醇溶液洗脫時各單體酚類物質(zhì)的洗脫峰均顯著高于25%乙醇溶液。此外，不同極性溶液洗脫時，超聲對單體花色苷和非花色苷單體酚類物質(zhì)解吸附的影響不同：95%乙醇溶液洗脫時，超聲弱化了各單體酚類物質(zhì)的解吸附，洗脫10 min時，0、8.44、18.76 W/cm2超聲處理組流出液中原花青素B2的質(zhì)量濃度分別為895.6、831.8、785.5 mg/L；而25%乙醇溶液洗脫時，超聲強化了各單體酚類物質(zhì)的解吸附，洗脫15 min時，0、8.44、18.76 W/cm2超聲處理組流出液中原花青素B2的質(zhì)量濃度分別為278.8、282.5、289.6 mg/L，與2.2.2節(jié)中超聲作用對固定床解吸附總酚的影響相印證。

由圖7可知，不同解吸附條件下，流出液中各單體酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度隨時間變化趨勢類似，且出峰時間接近，表明超聲耦合大孔樹脂固定床解吸附過程中各單體酚類物質(zhì)的溶出規(guī)律基本一致，超聲作用不會造成所純化有效成分的缺失，但未能選擇性分離不同多酚家族類物質(zhì)。為了進一步精準分離不同酚類物質(zhì)，后續(xù)可選擇與不同多酚具有特異性結(jié)合/解離能力的填料開展分離研究。

2.3 超聲輔助吸附過程對大孔樹脂特性的影響

2.3.1 表面形態(tài)

收集吸附結(jié)束后的大孔樹脂，分析樹脂表面形態(tài)。由圖8A、B可知，超聲和未超聲處理的樹脂顆粒均呈球形，表明18.76 W/cm2超聲強度沒有明顯改變樹脂的幾何結(jié)構(gòu)，但是超聲處理后的樹脂表面粗糙度增加（圖8C～F）。Wu Yue等[21]的研究表明，在三角瓶中采用超聲強化樹脂吸附花色苷，樹脂表面遭到超聲破壞，增加了樹脂的吸附表面積，并導致樹脂表面有更多的氫鍵暴露，增強了樹脂與花色苷間的非共價結(jié)合，因此增加了開放體系下大孔樹脂對花色苷的吸附量。本研究中超聲雖然破壞了樹脂表面形態(tài)，但是未提高花色苷吸附量，可能是因為固定床與三角瓶內(nèi)大孔樹脂吸附傳質(zhì)行為存在差異，后續(xù)需進一步研究固定床系統(tǒng)內(nèi)超聲強化吸附和解吸附的傳質(zhì)機理，從而為該技術(shù)的應用提供理論依據(jù)。

圖8 4.5 cm固定床內(nèi)樹脂在不超聲和18.76 W/cm2超聲處理下的掃描電子顯微鏡圖像Fig. 8 Scanning electron microscopic (SEM) images of resins in the 4.5 cm-high fixed bed with and without 18.76 W/cm2 ultrasonic treatment

2.3.2 樹脂粒徑和內(nèi)部結(jié)構(gòu)

如圖9所示，值得注意的是，超聲處理下有少量樹脂碎片隨洗脫液一起流出，這證實了超聲對樹脂的破壞作用，與圖8的結(jié)果相印證。吸附過程中超聲未明顯改變柱床內(nèi)的樹脂粒徑，各組樹脂平均粒徑均在654～685 μm之間，間接證明所用超聲強度下樹脂維持了原有的幾何結(jié)構(gòu)。同時，隨著超聲強度的增加，流出的樹脂碎片粒徑分布范圍增大，超聲破壞作用明顯增強。此外，由于流出的樹脂碎片也吸附有花色苷，可能導致固定床吸附能力下降，但總體上流出的樹脂碎片較少。如表3所示，超聲處理下柱床內(nèi)的大孔樹脂比表面積、總孔容、平均孔徑均無顯著變化，表明樹脂內(nèi)部結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，與Tao Yang等[39]報道的結(jié)果一致。相較于柱床內(nèi)的樹脂，流出的樹脂碎片比表面積和總孔容顯著減小，平均孔徑顯著增大。如何避免樹脂碎片的流出也是后續(xù)研究中需要解決的問題。

表3 不同處理條件下大孔樹脂比表面積、總孔容、平均孔徑Table 3 Specific surface area, total pore volume and average pore sizeof macroporous resin under different treatments

圖9 大孔樹脂固定床吸附結(jié)束后柱床內(nèi)（A）和流出液（B）中樹脂粒徑分布Fig. 9 Resin particle size distribution in fixed bed (A) and eluate (B)after adsorption on macroporous resin fixed bed

3 結(jié) 論

通過研究超聲輔助大孔樹脂固定床吸附、解吸附黑果花楸花色苷和非花色苷單體酚類物質(zhì)的傳質(zhì)特性，發(fā)現(xiàn)XAD-7HP大孔樹脂固定床可有效去除黑果花楸粗提液中的有機酸和可溶性糖，純化后花色苷純度最高為48.8%，多酚純度最高為78.7%，但超聲和未超聲處理組各單體酚類物質(zhì)吸附/解吸附傳質(zhì)性質(zhì)接近，超聲耦合固定床系統(tǒng)未實現(xiàn)酚類物質(zhì)間的特異性分離；本研究條件下，超聲處理加速了花色苷在柱床樹脂間的層流運動，但是對花色苷與樹脂的吸附/解吸附影響有限；超聲處理可以明顯縮短吸附過程所需時間，柱床高度為2.5 cm時，18.76 W/cm2超聲作用下花色苷吸附突破時間縮短了65.8%，而突破吸附率未發(fā)生明顯改變；使用25%乙醇溶液解吸附花色苷時，超聲處理提高了花色苷的解吸附效率，18.76 W/cm2超聲作用下花色苷解吸附量較未超聲組提高12.6%；超聲破壞了樹脂表面結(jié)構(gòu)，增加了其粗糙度，但未明顯改變樹脂內(nèi)部結(jié)構(gòu)和粒徑。綜上，超聲可改變固定床吸附/解吸附的傳質(zhì)特性，可在提高分離效率和分離度、減少溶劑消耗方面發(fā)揮作用，后續(xù)需進一步結(jié)合傳質(zhì)仿真研究傳質(zhì)機理，并針對不同食品組分的分離開展研究。