陳智 魏靜麗 田蕓
支氣管哮喘是多發(fā)于小兒時(shí)期的慢性呼吸系統(tǒng)疾病[1]。該病是由多類細(xì)胞及促炎因子共同參與形成的氣道炎癥性疾病[2]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示,中國(guó)兒童支氣管哮喘患病率正以每10 年增加50%以上的幅度上升,且該病的控制情況十分不理想[3]。目前,支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制仍未完全清晰。研究表明,T 淋巴細(xì)胞在支氣管哮喘進(jìn)展中起著重要作用,其中Th1 與Th2 比例失衡是支氣管哮喘發(fā)生的重要因素[4]。研究證實(shí),miR-155 參與咳嗽變異性支氣管哮喘、急性胰腺炎和肺炎等慢性炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展[5],但關(guān)于其在兒童支氣管哮喘中的作用尚不明確?;诖?,本研究就miR-155 對(duì)支氣管哮喘患兒Th1/Th2 細(xì)胞失衡的影響及致病機(jī)制作一探討,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。
1.1 對(duì)象 選取2018 年7 月至2022 年6 月在深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院就診的40 例支氣管哮喘發(fā)作期患兒為哮喘組,其中男19 例,女21 例;年齡7~12(9.18±1.97)歲;BMI 為(19.24±1.41)kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)支氣管哮喘的診斷符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016 年版)》[6]相關(guān)診標(biāo)準(zhǔn);(2)年齡6~14歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并先天性氣道畸形;(2)伴有精神障礙;(3)合并嚴(yán)重軀體疾??;(4)病例資料完整;(5)支氣管異物、致敏物等外物誘發(fā)的反復(fù)喘息。另選同期本院健康體檢的30 名兒童為對(duì)照組,其中男15人,女15 人;年齡7~12(9.13±1.80)歲;BMI 為(19.25±1.22)kg/m2。兩組對(duì)象在性別、年齡和BMI 等方面比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò),所有患兒家長(zhǎng)知情同意。
1.2 體內(nèi)試驗(yàn)
1.2.1 兩組對(duì)象外周血Th1 和Th2 細(xì)胞亞群水平檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)。取支氣管哮喘發(fā)作期患兒入院第2 天清晨及體檢兒童健康體檢時(shí)的空腹肘靜脈血5 mL,使用FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞檢測(cè)儀測(cè)定外周血Th1 比例和Th2 比例,計(jì)算Th1/Th2。
1.2.2 兩組對(duì)象外周血細(xì)胞因子水平檢測(cè) 采用ELISA 法。 取支氣管哮喘發(fā)作期患兒入院第2 天清晨及體檢兒童健康體檢時(shí)的空腹肘靜脈血5 mL,采用ELISA 法檢測(cè)外周血IL-4、IL-5、IL-1、IL-17、IFN-γ水平,試劑盒均購(gòu)自北京市索萊寶科技有限公司。
1.3 體外試驗(yàn)
1.3.1 外周血CD4+T 細(xì)胞分離 參考文獻(xiàn)[7]分離步驟,使用α-CD3 磁珠(批號(hào):130-050-101,德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司)、α-CD28 磁珠(批號(hào):130-093-247,德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司)分別分離哮喘組、對(duì)照組外周血CD4+T 細(xì)胞,設(shè)為哮喘(細(xì)胞)組、對(duì)照(細(xì)胞)組;另用miR-155 模擬物處理對(duì)照組分離獲得的CD4+T 細(xì)胞,設(shè)為miR-155 高表達(dá)組。3 組CD4+T 細(xì)胞均體外培養(yǎng)24 h 后取上清液進(jìn)行RT-qPCR 和ELISA 檢測(cè)。
1.3.2 3 組CD4+T 細(xì)胞miR-155、GATA結(jié)合蛋白3(GATA binding protein-3,GATA-3)表達(dá)水平檢測(cè)采用RT-qPCR 法。使用Trizol 提取各組細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用RT-qPCR 儀檢測(cè)miR-155、GATA-3 表達(dá)水平,采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-155、GATA-3 相對(duì)表達(dá)量。引物序列由深圳市牛啟生物技術(shù)有限公司合成,GATA-3 上游引物序列為5'-GAGGTGGACGTACTTTTTAACATCG-3',下游引物序列為5'-GGCATACCTGGCTCCCGT-3';β-肌動(dòng)蛋白上游引物序列為5'-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3',下游引物序列為5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3';miR-155 上游引物序列為5'- GCGCGTTAATGCTAATT GTGAT-3',下游引物序列為5'- GTGCAGGGTCCGAGGT-3';U6 上游引物序列為5'-CGGGTTTGTTTTGCATTTGT-3',下游引物序列為5'-AGTCCCAGCAT GAACAGCTT-3'。
1.3.3 3 組CD4+T 細(xì)胞IL-4、IL-5 表達(dá)水平檢測(cè) 采用ELISA 法。使用IL-4 試劑盒(批號(hào):SEKH-0011-96T,北京市索萊寶科技有限公司)、IL-5(批號(hào):SEKH-0012-96T,北京市索萊寶科技有限公司)測(cè)定CD4+T 細(xì)胞上清液IL-4、IL-5 表達(dá)水平。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示,若滿足方差齊性,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);若方差不齊,兩組間比較采用t'檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 兩組對(duì)象外周血Th1 和Th2 細(xì)胞亞群水平比較哮喘組外周血Th1 比例、Th1/Th2 均明顯低于對(duì)照組,Th2 比例明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表1。
表1 兩組對(duì)象外周血Th1和Th2細(xì)胞亞群水平比較
2.2 兩組對(duì)象外周血細(xì)胞因子水平比較 哮喘組外周血IFN-γ 水平明顯低于對(duì)照組,IL-4、IL-5、IL-1、IL-17 水平均明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表2。
表2 兩組對(duì)象外周血細(xì)胞因子水平比較(ng/L)
2.3 3 組CD4+T 細(xì)胞miR-155、GATA-3、IL-4、IL-5 表達(dá)水平比較 3 組CD4+T 細(xì)胞miR-155、GATA-3、IL-4、IL-5 表達(dá)水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);哮喘(細(xì)胞)組、miR-155 高表達(dá)組CD4+T 細(xì)胞miR-155、GATA-3、IL-4、IL-5 表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照(細(xì)胞)組(均P<0.05),見(jiàn)表3。
表3 3 組CD4+T 細(xì)胞miR-155、GATA-3、IL-4、IL-5 表達(dá)水平比較
支氣管哮喘是一種由多類炎癥細(xì)胞、細(xì)胞分子介入的慢性炎癥疾病,多發(fā)于童年期和青春期[8],其患病率呈逐年上升趨勢(shì)[9]。若嚴(yán)重的支氣管哮喘急性發(fā)作時(shí)得不到及時(shí)治療,可能導(dǎo)致患兒死亡,對(duì)家庭和社會(huì)增加沉重的負(fù)擔(dān)[10]。因此,積極探索支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制對(duì)該病的防治具有重要意義。
既往研究顯示,Th1/Th2 細(xì)胞失衡是支氣管哮喘發(fā)病的主要機(jī)制[11]。在支氣管哮喘致病進(jìn)程中,Th1/Th2處于持續(xù)變化狀態(tài),表現(xiàn)為Th1 比例及相關(guān)細(xì)胞因子水平降低和Th2 比例及相關(guān)細(xì)胞因子水平升高的過(guò)程,其中抑制促炎因子水平降低在氣道炎癥持續(xù)存在過(guò)程中起著重要作用[12]。本研究也得到類似結(jié)論,哮喘組外周血Th2 比例、IL-4、IL-5、IL-1 和IL-17 水平均明顯高于對(duì)照組,Th1 比例、Th1/Th2 和IFN-γ 水平均明顯低于對(duì)照組,表明支氣管哮喘患兒存在Th1/Th2細(xì)胞失衡的狀況。Th1 釋放的主要抑炎因子有IL-2、IFN-γ 等,它們參與細(xì)胞免疫調(diào)控;Th2 釋放的主要促炎因子有IL-4、IL-5 等,它們參與體液免疫調(diào)控。當(dāng)Th1/Th2 動(dòng)態(tài)平衡被破壞時(shí),釋放的細(xì)胞因子種類占比會(huì)發(fā)生較大的改變,進(jìn)而誘發(fā)支氣管哮喘的發(fā)病[13]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,恢復(fù)Th1/Th2 細(xì)胞失衡,同時(shí)降低Th17 水平、提高Treg 的免疫抑制功能等,均有助于緩解兒童支氣管哮喘[14]。Th17 能特征性地分泌IL-17,而IL-17 具有很強(qiáng)的促炎作用,與氣道高反應(yīng)性有關(guān)。哮喘小鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),減少Th1 分化和增強(qiáng)Th2 細(xì)胞分化后,會(huì)顯著提高組織中胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶3 水平,進(jìn)一步證實(shí)Th1/Th2 細(xì)胞失衡誘發(fā)哮喘的發(fā)病[15]。因此,活化Th1 并抑制Th2 免疫應(yīng)答,恢復(fù)Th1/Th2 細(xì)胞平衡是治療支氣管哮喘的有效方法之一。
miRNA 是一類長(zhǎng)約22 個(gè)核苷酸序列的非編碼單鏈RNA,其表達(dá)失調(diào)與人類疾病密切相關(guān)。研究表明,支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展與miR-155 的高表達(dá)密切相關(guān)[16],但確切機(jī)制尚未清楚。本研究結(jié)果顯示,哮喘(細(xì)胞)組、miR-155 高表達(dá)組CD4+T 細(xì)胞miR-155、GATA-3、IL-4 和IL-5 水平均明顯高于對(duì)照(細(xì)胞)組,提示miR-155 可能通過(guò)上調(diào)GATA-3 表達(dá)來(lái)促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞向Th2 分化,進(jìn)而造成支氣管哮喘患兒Th1/Th2 細(xì)胞失衡的生物學(xué)機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子GATA-3是一類具有高度選擇性促進(jìn)Th2 分化功能的因子,可高度選擇性地促進(jìn)Th2 發(fā)育、誘導(dǎo)產(chǎn)生Th2 型細(xì)胞分子和阻遏Th1 型細(xì)胞特異分子。近年來(lái)研究表明,miR-155 在異氰酸鹽誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中發(fā)揮重要作用,其高表達(dá)可促進(jìn)炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性[16]。2型固有淋巴細(xì)胞(type 2 innate lymphoid cells,ILC2)也屬于淋巴細(xì)胞中的一員,能被細(xì)胞因子IL-33、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素和IL-25 所激活,進(jìn)而增強(qiáng)Th2 型細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄分子GATA-3、視黃酸受體相關(guān)孤兒受體α 水平,促進(jìn)IL-4、IL-5 等細(xì)胞因子釋放。在過(guò)敏性氣道炎癥小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),miR-155 缺陷小鼠肺器官中沒(méi)有炎癥細(xì)胞富集,IL-33 含量明顯減少,ILC2數(shù)量明顯減少;IL-33 能通過(guò)促進(jìn)野生型小鼠ILC2 的相關(guān)受體以及miR-155 表達(dá),使小鼠肺組織GATA-3含量增加并釋放更多的IL-13,這說(shuō)明miR-155 在IL-33 刺激ILC2 增加以及嗜酸性粒細(xì)胞氣道炎癥過(guò)程中是必不可少的[17]。近期研究顯示,血清miR-155 異常高表達(dá)與支氣管哮喘的發(fā)生存在必要關(guān)聯(lián)[18]。上述研究結(jié)論與本研究基本一致。
綜上所述,miR-155 異常高表達(dá)在兒童支氣管哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用,其機(jī)制可能與上調(diào)GATA-3表達(dá)進(jìn)而造成Th1/Th2 細(xì)胞失衡有關(guān)。