孫翠煥, 陳麗媛, 陳 杰, 郭玲玲, 敖 靜, 王志學(xué)

(遼寧省微生物科學(xué)研究院,遼寧 朝陽(yáng) 122000)

秸稈是一種天然的農(nóng)業(yè)可再生資源和理想的肥料資源[1]。有數(shù)據(jù)顯示,100 g秸稈中含碳44.2 g、氮0.62 g、磷(五氧化二磷)0.25 g、鉀(氧化鉀)1.44 g,以及鈣、鎂、硫、硅、鐵、鋅、錳、鉬等中、微量元素[2]。我國(guó)農(nóng)作物秸稈每年產(chǎn)量約7億t,其中玉米秸稈占30%左右[3-4],東北地區(qū)是我國(guó)重要的糧食主產(chǎn)區(qū),每年產(chǎn)生的玉米秸稈總量達(dá)1.7億t,秸稈資源十分豐富[5]。秸稈還田是將秸稈直接或間接還田的一種處理方法[6],是一種強(qiáng)化土壤有機(jī)質(zhì)積累、調(diào)節(jié)土壤溫度和水分的方式[7]。秸稈還田技術(shù)的合理利用可緩解土壤質(zhì)量下降及秸稈資源浪費(fèi)的情況[8],可以增加土壤有機(jī)碳含量,提升土壤肥力[9],同時(shí)也是在目前全球變暖條件下,如何利用土壤碳截流減緩溫室效應(yīng)所追求的目標(biāo)[10]。秸稈還田對(duì)提高氮素有效性有促進(jìn)作用[11],有研究顯示土壤微生物量碳氮均呈現(xiàn)明顯增加趨勢(shì),表明土壤中的微生態(tài)環(huán)境得到了很大改善[12]。張旸等[13]研究發(fā)現(xiàn),秸稈還田增加了土壤中碳氮磷鉀的積累量。李辛等[7]研究發(fā)現(xiàn)秸稈還田能顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀的含量,同時(shí)還增加了5～15 cm土層的土壤容重,降低了15～25 cm土層的土壤容重。秸稈還田可影響土壤結(jié)構(gòu),改善土壤微生態(tài)[14],增加土壤微生物代謝和多樣性[15]。同時(shí),深層土壤在連續(xù)秸稈淺耕還田后,明顯改善了土壤透氣性,并有效降低了土壤容重[16]。秸稈降解所用的腐解菌劑是一類能夠產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶等的微生物菌劑[17]。由于農(nóng)作物秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成,自然狀態(tài)下難以被微生物分解。添加微生物菌劑可以加快秸稈的腐解,秸稈還田既可充分利用秸稈資源為農(nóng)田提供大量?jī)?yōu)質(zhì)有機(jī)肥料,同時(shí)可減輕秸稈焚燒造成的生態(tài)環(huán)境污染,是發(fā)展有機(jī)可持續(xù)農(nóng)業(yè)的有效途徑[18-19]。秸稈原位直接還田是目前我國(guó)采用的主要還田方式,該方式存在秸稈腐解較慢、對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)成分提升不明顯等問題[20]。秸稈還田配合使用腐解菌劑可以促進(jìn)秸稈腐解,使土壤養(yǎng)分增加[21-22]。李祥等[23]采用秸稈+尿素+自制微生物菌劑+土壤調(diào)理劑的模式還田,還田10個(gè)月,小麥秸稈腐解率達(dá)100%,有效改善了土壤結(jié)構(gòu),并使土壤有機(jī)質(zhì)含量增加。范作偉等[17]在秸稈淺旋和旋耕還田方式下,施用腐解菌劑處理的秸稈腐解率顯著高于未施用菌劑的處理。馮敏等[24]研究表明,秸稈還田能有效增加土壤中氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌和固氮菌的數(shù)量并使其活性增強(qiáng),進(jìn)而提高土壤氨化活性和硝化活性,而相關(guān)菌群數(shù)量的變化與土壤氨化活性和硝化活性呈正相關(guān)。楊冬靜等[25]研究發(fā)現(xiàn),水稻秸稈還田可提高土壤中細(xì)菌多樣性,小麥秸稈還田可提高土壤真菌多樣性,其他還田方式也對(duì)土壤微生物的多樣性有一定程度的影響,說(shuō)明稻麥秸稈還田改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)以及微生物菌群的相對(duì)豐度。此外,Yu等研究發(fā)現(xiàn),秸稈還田可提高土壤微生物的數(shù)量和活性[26],土壤微生物數(shù)量和活性的提高對(duì)秸稈的腐解又起到促進(jìn)作用[27],表明秸稈還田與土壤微生物之間是相互促進(jìn)相互影響的。為明確不同微生物菌劑在秸稈降解中的作用及對(duì)秸稈中微生物菌群數(shù)量的影響,本研究在溫室大棚內(nèi)進(jìn)行不同菌劑對(duì)秸稈降解率影響試驗(yàn),并研究秸稈中可培養(yǎng)真菌、細(xì)菌、放線菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化,以期為微生物菌劑在秸稈還田中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)由遼寧省微生物菌種保藏中心提供。玉米秸稈(喀左天盛農(nóng)業(yè)科技有限公司提供)風(fēng)干,去除葉片,切段(長(zhǎng)10～15 cm),105 ℃烘箱烘干至恒重備用。60目尼龍濾布(購(gòu)自化試商店)剪成50 cm×50 cm方塊備用。

1.1.2 試驗(yàn)區(qū) 試驗(yàn)時(shí)間為2020年10月至2021年4月,試驗(yàn)地點(diǎn)為遼寧省喀左天盛農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)基地溫室大棚。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①NA培養(yǎng)基:用于培養(yǎng)細(xì)菌;②PDA培養(yǎng)基:用于培養(yǎng)真菌;③改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基:用于培養(yǎng)放線菌。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。

1.1.4 主要試劑與儀器設(shè)備 生理鹽水(稱取氯化鈉4.5 g,加入蒸餾水500 mL,充分?jǐn)嚢枞芙?121 ℃滅菌20 min,備用)。氯化鈉、牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖等試劑均為分析純。高壓滅菌鍋(LDZX-50KBS,上海申安醫(yī)療器械廠);恒溫培養(yǎng)箱(SPX-450,中儀國(guó)科(北京)科技有限公司);烘箱(XMTD-8222,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);電子天平(JA2003,上海天平儀器廠);全溫振蕩器(HZQ-Q,東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司) 。

1.2 方法

1.2.1 微生物菌劑制備 ①菌種活化:在保藏試管中挑取地衣芽胞桿菌菌體于NA試管培養(yǎng)基上劃線,35 ℃避光培養(yǎng)3 d。挑取哈茨木霉菌絲于PDA試管培養(yǎng)基上劃線,28 ℃避光培養(yǎng)至表面全部變綠。②菌劑制備:挑取活化好的地衣芽胞桿菌至NA液體培養(yǎng)基,35 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h,活菌數(shù)約為0.5×108cfu/mL,備用;哈茨木霉試管中加無(wú)菌生理鹽水,制成菌懸液,涂布于PDA平板,28 ℃避光培養(yǎng)至表面全部變綠,用無(wú)菌生理鹽水將孢子刮下,制成孢子懸液,活菌數(shù)調(diào)至0.5×108cfu/mL。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理。對(duì)照組:玉米秸稈;處理1:玉米秸稈+哈茨木霉;處理2:玉米秸稈+哈茨木霉+地衣芽胞桿菌。用修枝剪刀將玉米秸稈剪成長(zhǎng)10～15 cm秸稈段,用剪好的尼龍濾布包裹秸稈段,每袋100 g,共計(jì)27袋。挖9個(gè)長(zhǎng)50 cm、寬50 cm、深30 cm的土坑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行土坑,每個(gè)土坑放置3袋秸稈為3個(gè)平行樣。秸稈中分別按0.2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量加入無(wú)菌水、哈茨木霉、哈茨木霉+地衣芽胞桿菌,覆土厚20 cm并壓實(shí),澆水并保持土壤水潤(rùn),每隔30 d,3個(gè)處理各取1個(gè)土坑的秸稈(3袋同時(shí)取出),進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3 秸稈降解率測(cè)定 取出各處理秸稈,稱量鮮重,然后用自來(lái)水沖洗,去掉泥土及被分解成粉狀的腐殖質(zhì),105 ℃烘干至恒重,稱量干重,計(jì)算降解率。計(jì)算公式:降解率(%)=((100-干重)/100)×100%。

1.2.4 活菌數(shù)測(cè)定 活菌數(shù)采用稀釋平板法測(cè)定。①可培養(yǎng)細(xì)菌活菌數(shù)測(cè)定:取出各處理秸稈,稱取濕重5.0 g,用無(wú)菌剪刀剪碎(0.5 mm×0.5 mm),置于裝有95.0 mL無(wú)菌生理鹽水的帶有玻璃珠的250 mL無(wú)菌錐形瓶中,置振蕩器中160 r/min振搖30 min,充分混勻后,取上清液1 mL,加無(wú)菌生理鹽水9 mL,制成10倍稀釋液,之后按10倍梯度關(guān)系稀釋,分別取10-3、10-4、10-5、10-6稀釋倍液0.1 mL涂平板,平行制備3個(gè)平板,30 ℃倒置培養(yǎng)48 h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。②可培養(yǎng)真菌活菌數(shù)測(cè)定:樣品處理同①,分別取10-2、 10-3、10-4、10-5稀釋倍液0.1 mL涂平板,平行制備3個(gè)平板,28 ℃倒置培養(yǎng)3 d,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。③可培養(yǎng)放線菌活菌數(shù)測(cè)定:樣品處理同①,分別取10-2、 10-3、10-4、10-5稀釋倍液0.1 mL涂平板,平行制備3個(gè)平板,28 ℃倒置培養(yǎng)3 d,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微生物菌劑處理對(duì)秸稈降解率的影響

從圖1可以看出,不同處理對(duì)秸稈降解率有很大差異,在降解試驗(yàn)設(shè)置時(shí)間內(nèi),處理1的秸稈降解率明顯高于對(duì)照組和處理2,對(duì)照組的秸稈降解率始終高于處理2,表明單獨(dú)添加哈茨木霉菌劑處理秸稈,其降解率高于不添加菌劑和添加哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑。添加哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑,其降解率低于不添加任何菌劑的對(duì)照組。

圖1 不同微生物菌劑處理對(duì)秸稈降解率的影響Fig.1 The effect of different microbial agents on the degradation rate of straw

2.2 不同微生物菌劑處理、不同降解時(shí)段對(duì)秸稈降解率的影響

從圖2可以看出,處理1與對(duì)照組相比,在0～30 d和30～60 d時(shí)段,處理1的秸稈降解率明顯高于對(duì)照組,從第60天開始,處理1的降解率始終低于對(duì)照組,但是總降解率始終是處理1高于對(duì)照組;處理2與對(duì)照組相比,在0～30 d,處理2的降解率明顯低于對(duì)照組,但30～60 d出現(xiàn)一個(gè)降解高峰,之后處理2的降解率始終低于對(duì)照組,但總降解率對(duì)照組高于處理2;處理1與處理2相比,在0～30 d和30～60 d時(shí)段,處理1的秸稈降解率明顯高于處理2,之后的降解率沒有明顯規(guī)律,相互有高有低,但總降解率始終是處理1高于處理2。

圖2 不同微生物菌劑處理、不同降解時(shí)段對(duì)秸稈降解率的影響Fig.2 The effect of different microbial agent treatments and different degradation periods on the degradation rate of straw

2.3 不同微生物菌劑處理對(duì)秸稈中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的影響

從圖3可以看出,處理1在0～30 d時(shí)可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)增加迅速,第120天時(shí)達(dá)到峰值為2.00×109cfu/g,之后緩慢下降;從處理1的整個(gè)試驗(yàn)時(shí)段來(lái)看,可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)增加和下降速度較緩慢,在第180天時(shí),可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)仍為1.02×109cfu/g。

圖3 不同微生物菌劑處理對(duì)秸稈中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的影響Fig.3 The effect of different microbial agent treatments on the quantity of cultivatable bacteria in straw

對(duì)照組和處理2可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)在0～120 d時(shí)一直呈上升趨勢(shì),第120天時(shí)達(dá)到峰值,分別為3.92×109cfu/g和3.10×109cfu/g,可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)明顯高于處理1,之后迅速下降,在第180天時(shí),可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)已分別下降至0.58×109cfu/g和0.48×109cfu/g,可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)均低于處理1。

相關(guān)性分析表明,在前30 d,秸稈降解率與可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.935 4。第30天后,秸稈的降解率受其他因素影響較大,與秸稈中細(xì)菌數(shù)量不相關(guān)。

2.4 不同微生物菌劑處理對(duì)秸稈中可培養(yǎng)真菌數(shù)量的影響

從圖4可以看出,處理1秸稈中可培養(yǎng)真菌數(shù)在0～30 d快速增加,在第90天達(dá)到峰值為1.9×107cfu/g,之后快速下降;對(duì)照組和處理2在0～60 d時(shí),可培養(yǎng)真菌數(shù)增加緩慢,之后快速增加,分別在第90天和120天時(shí)達(dá)到峰值,為1.14×107cfu/g和1.54×107cfu/g,然后緩慢下降。對(duì)照組和處理1比處理2的真菌數(shù)最高點(diǎn)出現(xiàn)早30 d;處理1和處理2的可培養(yǎng)真菌數(shù)在0～120 d均高于對(duì)照組。

圖4 不同微生物菌劑處理對(duì)秸稈中可培養(yǎng)真菌數(shù)量的影響Fig.4 The effect of different microbial agent treatments on the quantity of cultivatable fungi in straw

相關(guān)性分析表明,前30 d秸稈降解率與秸稈中可培養(yǎng)真菌數(shù)高度相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.870 5;30～90 d則有很小相關(guān)性;第30天后,秸稈降解與秸稈中可培養(yǎng)真菌數(shù)不相關(guān)。

2.5 不同微生物菌劑處理對(duì)秸稈中可培養(yǎng)放線菌數(shù)量的影響

從圖5可以看出,在試驗(yàn)時(shí)段的前30 d,放線菌數(shù)量快速增加,處理1增加數(shù)量明顯高于對(duì)照組和處理2;在90～120 d時(shí),三個(gè)處理都未能檢測(cè)到放線菌,在150～180 d時(shí),三個(gè)處理的放線菌數(shù)量均同時(shí)大量出現(xiàn),之后對(duì)照組和處理1均快速下降,只有處理2呈上升趨勢(shì)。分析三個(gè)處理的秸稈中90～120 d均未能檢測(cè)到放線菌,可能是真菌、細(xì)菌大量增加抑制了放線菌的生長(zhǎng)所致。

圖5 不同微生物菌劑處理對(duì)秸稈中可培養(yǎng)放線菌數(shù)量的影響Fig.5 The effect of different microbial agent treatments on the quantity of cultivatable actinomyces in straw

相關(guān)性分析表明,前30 d秸稈降解率與秸稈中可培養(yǎng)放線菌數(shù)高度相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.924 5;30 d后,秸稈降解與秸稈中可培養(yǎng)放線菌數(shù)不相關(guān)。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn),不同微生物菌劑對(duì)秸稈降解作用不同,單獨(dú)添加哈茨木霉菌劑處理秸稈能顯著提高秸稈降解率,前期作用尤其明顯;添加哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑降低了秸稈降解率,前期尤其顯著。由于土壤和秸稈中攜帶具有降解秸稈功能的菌群,可能添加的地衣芽胞桿菌與其他秸稈降解微生物競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分,抑制了哈茨木霉和其他具有降解秸稈功能的微生物生長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)外研究表明芽胞桿菌有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[28-31],但可能對(duì)秸稈降解作用不明顯。

不同處理對(duì)秸稈中可培養(yǎng)真菌、細(xì)菌、放線菌數(shù)量的影響顯著不同。秸稈上生長(zhǎng)的各種微生物分泌的酶類對(duì)秸稈降解起重要作用,相關(guān)性分析表明,在秸稈降解的前30 d,秸稈降解率與秸稈中生長(zhǎng)的可培養(yǎng)真菌、細(xì)菌、放線菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)。在秸稈分解的其他時(shí)間段,秸稈降解率與秸稈中可培養(yǎng)微生物相關(guān)性小,可能在秸稈降解的中后期,秸稈降解率與秸稈中不可培養(yǎng)微生物、土壤動(dòng)物等大量出現(xiàn)有關(guān)。

不同微生物菌劑對(duì)秸稈中微生物數(shù)量變化影響顯著,接種哈茨木霉處理的秸稈中真菌、細(xì)菌、放線菌數(shù)在前30 d明顯高于對(duì)照和哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑處理,差異顯著;可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)均在120 d左右達(dá)到峰值,但是對(duì)照組和哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑處理的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)明顯高于哈茨木霉處理;哈茨木霉處理和對(duì)照組的可培養(yǎng)真菌總數(shù)峰值出現(xiàn)在第90天,哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑處理在第120 天達(dá)到峰值,并且哈茨木霉處理和對(duì)照組的真菌總數(shù)峰值明顯比哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑處理的峰值高;在秸稈降解30 d后,三個(gè)處理的秸稈中都未能檢測(cè)到放線菌,說(shuō)明菌數(shù)未處于檢測(cè)范圍,可能與真菌、細(xì)菌數(shù)量大量增加后,抑制了放線菌的生長(zhǎng)所致。劉佳斌等[32]研究表明,在秸稈還田條件下,玉米抽雄期土壤放線菌數(shù)量明顯低于其他生長(zhǎng)期,放線菌數(shù)量與植物生長(zhǎng)期也有關(guān)。秸稈降解后期,對(duì)照組和哈茨木霉處理的秸稈中放線菌數(shù)量均大幅度下降,哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑處理的秸稈中放線菌數(shù)量仍呈上升趨勢(shì),而木霉有防治植物病害作用[33],后期的抑制病害作用可能與放線菌數(shù)量的增加有一定關(guān)系。