尚 坤, 閻瑾逸, 高君梅, 王 瑾, 李思穎, 閆祥祥, 黃小玉, 劉 晨, 岳昌武

(延安大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 延安市微生物藥物創(chuàng)新及轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 延安 716000)

微生物來(lái)源的抗生素類藥物在臨床治療病原菌感染和腫瘤等重大疾病方面發(fā)揮著重要作用,是抗生素的主要來(lái)源,具有非常好的臨床應(yīng)用前景(表1)[1]。由于近年來(lái)抗生素的濫用等原因?qū)е屡R床上出現(xiàn)的多藥耐藥甚至全耐藥菌株的數(shù)量和種類急劇增加,從2010年“超級(jí)菌NDM-1”全球火速擴(kuò)散到2015年2月美國(guó)UCLA醫(yī)療中心爆發(fā)“超級(jí)菌”肆虐,這些耐藥超級(jí)菌嚴(yán)重威脅著人類的生命健康,已成為全球醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的一道亟待攻克的難題。抗生素權(quán)威Walsh曾指出,超級(jí)菌可讓致病菌變得無(wú)比強(qiáng)大,抵御幾乎所有抗生素,而且由于新抗生素的研發(fā)、上市速度嚴(yán)重滯后,可能會(huì)導(dǎo)致“超級(jí)菌”感染,10年內(nèi)將無(wú)藥可用[2]。由于細(xì)菌耐藥給全球臨床抗生素用藥帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn),近年來(lái),新抗生素的研發(fā)重新受到醫(yī)藥行業(yè)和各國(guó)政府高度重視。自21世紀(jì)以來(lái),基因組學(xué)、代謝組學(xué)以及基因組編輯等技術(shù)的巨大進(jìn)步,促使科學(xué)家們開(kāi)始反思和改進(jìn)抗生素研發(fā)策略,提出了許多諸如基于分子系統(tǒng)學(xué)、代謝組學(xué)以及基因組挖掘技術(shù)的新抗生素發(fā)現(xiàn)新策略,并取得了諸多進(jìn)展。本文總結(jié)了20世紀(jì)起從放線菌中發(fā)現(xiàn)的重要活性天然產(chǎn)物及其策略和方法,對(duì)新時(shí)期放線菌來(lái)源抗生素的開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀、放線菌新菌株的篩選、放線菌來(lái)源天然產(chǎn)物快速鑒定、沉默基因簇等基因組挖掘的技術(shù)方法等進(jìn)行綜述,以期為放線菌來(lái)源的活性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)提供借鑒。

表1 已知天然產(chǎn)物及其合成類似物數(shù)量及應(yīng)用前景Table 1 Quantity and application prospect of natural products and their synthetic analogues

1 放線菌來(lái)源活性天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀

放線菌來(lái)源的活性天然產(chǎn)物是抗生素的重要來(lái)源,目前發(fā)現(xiàn)放線菌來(lái)源的微生物生物活性物質(zhì)超過(guò)20 000個(gè),其中抗生素活性天然產(chǎn)物超過(guò)13 800個(gè),除了目前還在臨床上廣泛應(yīng)用的鏈霉素、卡那霉素、氯霉素等抗生素外,還包括免疫調(diào)節(jié)劑、受體拮抗劑以及酶、維生素、有機(jī)酸等生物活性物質(zhì)[1]。按照微生物天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)歷程,可將放線菌天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)分為三個(gè)階段[3]:前30年(1940年代至1970年代)、第二個(gè) 30 年(1970 年代至 2000 年代)和2000 年代及以后。從表2可以看出,盡管進(jìn)入新時(shí)期從普通生境中分離出新的放線菌種以及挖掘新的活性天然產(chǎn)物已變得越來(lái)越困難,放線菌來(lái)源的活性產(chǎn)物在微生物來(lái)源活性產(chǎn)物中的比重也在不斷降低(從早期的62%降到了目前的28.5%)?？茖W(xué)家們基于“新環(huán)境,新菌株,新產(chǎn)物”策略,從特殊生境或稀有放線菌中通過(guò)各種基因組挖掘等方法開(kāi)發(fā)新型抗生素,并取得了積極成效。據(jù)Kemung等[4]統(tǒng)計(jì),從1994年到2017年,通過(guò)鏈霉菌抗生素發(fā)現(xiàn)新策略,已從各種生境鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)至少150種以上具有抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)活性的藥物前導(dǎo)化合物,提示這不失為開(kāi)發(fā)放線菌來(lái)源抗生素的重要途徑。

表2 1940年至2022年間報(bào)道的微生物活性產(chǎn)物的大致數(shù)量及比例[1]Table 2 Quantity and proportion of microbial active products reported from 1940 to 2010[1]

2 新時(shí)期典型生境放線菌來(lái)源活性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái),以高分辨質(zhì)譜等為代表的現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)、代謝組學(xué)為代表的現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)的巨大進(jìn)步以及上述天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)策略的調(diào)整,發(fā)現(xiàn)了一大批新型放線菌來(lái)源的抗生素。

2.1 大環(huán)內(nèi)酯類化合物

周啟輝[5]從高緯度北海海洋中分離出鏈霉菌(Streptomycessp.) R-527,并從中分離出9個(gè)(P1～P9)活性化合物,其中化合物P1～P4是大環(huán)內(nèi)酯類化合物,P5、P7、P8為開(kāi)環(huán)類化合物。Li等[6]從東南極洲潮間帶沉積物中分離的稀有放線菌海沉淀菌(Marisediminicola) ZS314T中分離出具有很高抗菌活性的萜類、烷基間苯二酚、低聚糖或氨基酸衍生的大環(huán)內(nèi)酯類系列化合物[7]。

2.2 新型大環(huán)多烯內(nèi)酯類化合物

劉洋等[8]從威海近海海域分離出鏈霉菌(Streptomycessp.) B59菌株,運(yùn)用OSMAC(one strain-many compounds,一株菌株,多個(gè)產(chǎn)物)方法挖掘出1種具有獨(dú)特環(huán)戊烯酮結(jié)構(gòu)存在的新型大環(huán)多烯內(nèi)酯類化合物B59-1,經(jīng)初步測(cè)試,化合物B59-1在50 μg/mL時(shí)抑制稻瘟病菌孢子萌發(fā),抑制率可達(dá)到100%。

2.3 生物堿類化合物

矯文策[9]從大連周邊海域分離的星海鏈霉菌(Streptomycesxinghaiensissp. nov.)中挖掘出具有良好抑制腫瘤細(xì)胞活性的含亞砜官能團(tuán)的生物堿類次級(jí)代謝產(chǎn)物Xinghaiamine A。 周彪[10]分別從鏈霉菌(Streptomycessp.) DT-A56和鏈霉菌(Streptomycessp.)NB-A13的大米固體培養(yǎng)基和高氏液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中分離出具有雙吲哚化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物堿星孢菌素類化合物,其中從菌株DT-A56培養(yǎng)物中分離出15個(gè)化合物(化合物1～15),其中3個(gè)為新化合物(化合物1～3);從菌株NB-A13培養(yǎng)物中分離出19個(gè)化合物(化合物16～34),其中6個(gè)為新化合物(化合物16～21)。這些新化合物對(duì)前列腺癌和乳腺癌的治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.4 酰胺類化合物

孫金柱[11]從鏈霉菌(Streptomycessp.)strain nenu_DS_21分離出10個(gè)化合物(Ⅰ～Ⅹ),其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅸ化合物為苯甲酰胺類化合物,Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ為首次從自然界中分離出的酰胺類天然產(chǎn)物,Ⅹ號(hào)化合物為新的鏈型酰胺類化合物。該放線菌主要的次級(jí)代謝產(chǎn)物是化合物Ⅷ?？咕鷮?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,化合物Ⅷ對(duì)番茄灰霉病菌(Botrvtiscinerea)、水稻紋枯病菌(Rhizoconiasolani)、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌(Pseudomonassp.)有一定的抑菌活性。

2.5 聚酮類化合物

Lü等[12-13]從梵凈山原始森林土樣中分離的鏈霉菌(Streptomycessp.) FJS31-2中得到發(fā)酵天然產(chǎn)物zunyimycins化合物(圖6),該系列抗生素對(duì)MRSA和腸球菌有較強(qiáng)的殺菌作用,還可抑制肝母細(xì)胞瘤、肺癌以及人胃癌細(xì)胞、黑色素瘤等多種癌細(xì)胞株的增殖,對(duì)抗腫瘤新藥的開(kāi)發(fā)具有重要的意義[14]。Wyche等[15]從來(lái)自海洋的馬杜拉放線菌(Actinomadurasp.)WMMB-499中分離出了新型低毒抗真菌聚酮Forazoline A。

2.6 噻嗪類化合物

Fu等[16]從海洋來(lái)源放線菌綠藻(Actinomycetosporachlora) SNC-032中分離出了一種新的噻嗪和兩種新的噻唑衍生物,并將其命名為Thiasporines A～C。其中Thiasporines A具有獨(dú)特的5-羥基-2-苯基-4h-1,3-噻嗪-4-1核。Thiasporines A對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H2122表現(xiàn)出中度的細(xì)胞毒作用。

2.7 環(huán)肽類化合物

郭俊夫[17]從海南島沿海淺海區(qū)生長(zhǎng)的菌株綠色鏈霉菌(Streptomycesviridobrunneus) P10-16中純化出系列具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤等生物活性的環(huán)脂肽類的伊枯草菌素(Iturin A)類化合物GJF6-2、GJF6-3q、GJF6-3h、GJF6-4q以及GJF6-4h,這類化合物的疏水部分是由14～17個(gè)碳原子組成的β-氨基脂肪酸,親水部分是肽鏈,是由7個(gè)α-氨基酸通過(guò)由脂肪酸的氨基與C-末端氨基酸的羧基形成的酰胺鍵成環(huán)典型結(jié)構(gòu)[18]。

2.8 放線菌素類化合物

天然的放線菌素類化合物的發(fā)色團(tuán)母核均為吩噁嗪酮,即2-氨基-4,6-二甲基吩噁嗪-3-酮-1,9-二羧酸。2011年,王強(qiáng)[19]從鏈霉菌(Streptomycessp.)IMB094和糖單孢菌(Saccharomonosporasp.) 7-98-1菌株的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離出4個(gè)放線菌素類化合物(化合物1～4),其中化合物1和2的生色團(tuán)母核為罕見(jiàn)的噁唑并[4,5-b]吩噁嗪四環(huán)稠合結(jié)構(gòu),這種母核結(jié)構(gòu)在天然放線菌素中首次被發(fā)現(xiàn)?；衔?為新結(jié)構(gòu)化合物,命名為新放線菌素A?；衔?為首次發(fā)現(xiàn)天然放線菌素衍生物,命名為新放線菌素B。通過(guò)其抗菌活性測(cè)試結(jié)果顯示,新放線菌素A可以對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-susceptibleStaphylococcusaureus)、甲氧西林耐藥的表皮葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusepidermidis)等多種耐藥菌株具有中等的抗菌活性。并且對(duì)肺腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞活性。

2.9 糖苷類化合物

保羅霉素(Paulomycin) 是對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)等革蘭陽(yáng)性細(xì)菌具有很強(qiáng)活性的抗生素,用于治療淋球菌和衣原體感染[20]。Sarmiento-Vizcaino等[21]在海底Avilés峽谷進(jìn)行海洋考察時(shí),從2 000 m的深海沉積物中分離出來(lái)的松木小單孢菌M-412中,分離出了一種沒(méi)有報(bào)道過(guò)的新的 Paulomycin G,該抗生素是一種新型的天然產(chǎn)物,結(jié)構(gòu)獨(dú)特,它是Paulomycin家族中第1個(gè)缺乏Paulomycase部分的抗生素,是報(bào)道的最小的生物活性的Paulomycin。該天然產(chǎn)物是第一個(gè)對(duì)不同的人類腫瘤細(xì)胞系,如對(duì)胰腺癌、乳腺腺癌和肝細(xì)胞癌的家族成員表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒活性,Paulonycin G值得考慮作為進(jìn)一步研究其抗癌潛力的候選藥物。

3 激活次級(jí)代謝基因表達(dá)促進(jìn)抗生素合成

放線菌是抗生素的重要來(lái)源,其次級(jí)代謝途徑編碼基因表達(dá)與否直接決定了該次級(jí)代謝產(chǎn)物能否合成。Borodina等[22]分析了天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyxescoelicolor)A3(2)的近700個(gè)代謝相關(guān)基因在不同生理狀態(tài)下的表達(dá)狀態(tài),發(fā)現(xiàn)約有58%的代謝相關(guān)基因只有在特定環(huán)境狀態(tài)下才被誘導(dǎo)表達(dá)。如何有效激活“沉默”的次級(jí)代謝基因,最大程度發(fā)掘菌株的次級(jí)代謝潛力已成為當(dāng)前新抗生素開(kāi)發(fā)研究人員面臨的重要課題。

目前針對(duì)放線菌的沉默基因激活主要有兩種策略,一種是在生理層面改變放線菌的生活環(huán)境,主要有混合培養(yǎng)、OSMAC、化學(xué)表觀遺傳調(diào)控、核糖體工程等策略。另一種是在基因?qū)用鎸?duì)基因的直接操作,主要包括調(diào)控基因的遺傳操作、基因簇倍增以及異源表達(dá)等策略。

3.1 基于生理層面改變放線菌活性天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)

混合培養(yǎng)是基于自然生態(tài)環(huán)境中的微生物往往處于多菌種共存的狀態(tài),模擬微生物野生生境,將分離菌株和MRSA共培養(yǎng),可能有利于增加次生代謝產(chǎn)物的多樣性及新生物活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)機(jī)會(huì)。OSMAC策略是通過(guò)改變培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分、pH值、含氧量、溫度、培養(yǎng)方式等隨機(jī)地激活體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá),繼而改變菌株的代謝途徑來(lái)產(chǎn)生新的次級(jí)代謝產(chǎn)物或提高其產(chǎn)量,該策略簡(jiǎn)單有效,是目前微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)的重要手段。化學(xué)表觀遺傳學(xué)(Chemical epigenetics)是向培養(yǎng)基中添加外源性可影響菌株次級(jí)代謝途徑調(diào)控的胞外小分子化合物信號(hào)分子或DNA甲基化酶、去甲基化酶抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑等,以改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)或調(diào)控其次級(jí)代謝基因簇轉(zhuǎn)錄活性的化學(xué)物質(zhì)[23],啟動(dòng)或抑制菌體內(nèi)的相關(guān)代謝通路,從而實(shí)現(xiàn)與體內(nèi)基因表達(dá)水平調(diào)控相同或相似的生物學(xué)效果。核糖體工程(Ribosome engineering)選用作用于核糖體的抗生素,通過(guò)菌株對(duì)相應(yīng)抗生素亞致死量的抗性等來(lái)篩選得到代謝途徑或代謝產(chǎn)物合成效率得到改造的突變株。核糖體工程可用于定向篩選獲得耐藥突變株,進(jìn)而檢測(cè)這些耐藥株次級(jí)代謝能力的改變。以鏈霉素為例,鏈霉素作用靶點(diǎn)為細(xì)菌的核糖體組分,當(dāng)受到外界高濃度鏈霉素的選擇,部分菌株核糖體蛋白發(fā)生突變,成為耐藥菌株,而這些核糖體蛋白組分的突變往往能刺激或提高菌株內(nèi)部抗生素的生物合成[24]?；虻倪z傳操作步驟較繁瑣,需要“因菌而異”地優(yōu)化遺傳操作條件,以適合于對(duì)遺傳背景較清楚的潛力菌株進(jìn)行代謝潛力挖掘。而混合培養(yǎng)、OSMAC、表觀遺傳調(diào)控等天然產(chǎn)物挖掘策略,由于其操作便捷,則適合于對(duì)遺傳背景并不太清楚的菌株資源庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模、高通量挖掘。因此,如果能夠通過(guò)提供一個(gè)較為理想的發(fā)酵條件或通過(guò)在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的成分等手段,激活放線菌基因組中常規(guī)條件下處于沉默狀態(tài)的抗生素合成隱性基因,就可能有效地啟動(dòng)其編碼的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成,這將是獲得新型放線菌來(lái)源抗生素的重要途徑,這一觀點(diǎn)已得到大量研究結(jié)果的證實(shí)[25],延安市微生物藥物創(chuàng)新及轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曾利用基因組挖掘技術(shù)結(jié)合OSMAC獲得Zunyimycins等系列具有很好抗MRSA活性新鹵化抗生素,表明這些方法的組合不失為一種有效的抗生素開(kāi)發(fā)手段[12-14]。我國(guó)科學(xué)家在Ⅱ型聚酮的發(fā)現(xiàn)、生物合成機(jī)制及調(diào)控機(jī)制解析等方面取得了巨大成就,特別是張立新、向文勝和王為善等科學(xué)家提出了“精準(zhǔn)動(dòng)態(tài)調(diào)控內(nèi)源三酰甘油(TAGs)提高聚酮產(chǎn)量工程策略”[25]被認(rèn)為“這是70年來(lái)首次在代謝水平上清晰闡明鏈霉菌初級(jí)代謝到次級(jí)代謝的代謝轉(zhuǎn)換機(jī)制并進(jìn)行工程應(yīng)用”,利用該策略已成功實(shí)現(xiàn)了土霉素、杰多霉素等Ⅱ型聚酮的高產(chǎn)菌株的構(gòu)建,給低產(chǎn)抗生素的開(kāi)發(fā)提供一條新的策略。

3.2 基于基因操作的放線菌活性天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)

延安市微生物藥物創(chuàng)新及轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室利用次級(jí)代謝基因簇在線分析軟件antiSMASH[26]對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)基因組完成圖序列 (GenBank No.NC_003888.3)進(jìn)行了次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇預(yù)測(cè)。結(jié)果表明,該基因組中至少蘊(yùn)藏著25個(gè)獨(dú)立的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇,這些基因簇在不同的條件下可能產(chǎn)生一系列的結(jié)構(gòu)類似物,極大地豐富了天藍(lán)色鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生潛力。截至2014年,已報(bào)道在天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中發(fā)現(xiàn)了17種天然產(chǎn)物[27],分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,目前已有14類次級(jí)代謝合成途徑編碼基因簇在天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)中找到了與之相對(duì)應(yīng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物,也就是說(shuō),經(jīng)過(guò)眾多科學(xué)家多年的努力,在鏈霉菌的模式生物中尚有11種基因簇未能找到與之相對(duì)應(yīng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物。這更進(jìn)一步說(shuō)明,鏈霉菌的次級(jí)代謝潛力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人們以前的預(yù)期 (即除了部分基因簇對(duì)應(yīng)于已知的活性天然產(chǎn)物外,尚有部分代謝途徑還沒(méi)有相應(yīng)的天然產(chǎn)物與之對(duì)應(yīng))。Hsiao等利用天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)的次級(jí)代謝相關(guān)的基因芯片分析了阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、卡特蘭鏈霉菌(Streptomycescattleya)、海洋鏈霉菌(Streptomycesmaritimus)和金黃色北孢菌(Kitasatosporaaureofaciens)等4株菌的基因組后,發(fā)現(xiàn)至少有23個(gè)次級(jí)代謝基因簇相關(guān)基因在這4株菌中均能找到[28],但從后3株菌中找到的相應(yīng)基因簇編碼合成的產(chǎn)物數(shù)量遠(yuǎn)少于天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)?？茖W(xué)家們開(kāi)始著手對(duì)這些基因簇進(jìn)行深入的開(kāi)發(fā),期待對(duì)這些基因簇的激活挖掘能發(fā)現(xiàn)新的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境的生理狀態(tài)下,往往是以沉默狀態(tài)存在,而且對(duì)于很多即使以活性狀態(tài)存在的次級(jí)代謝基因簇而言,其表達(dá)水平往往很低,這就給其相應(yīng)的產(chǎn)物純化和鑒定帶來(lái)很大困難。由于隱性基因簇可能編碼合成具有成藥潛力的新型化合物,因此激活或提高次級(jí)代謝隱性基因簇的表達(dá)水平對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有極大意義。人們將利用各種手段激活沉默基因簇的表達(dá)或者提高其表達(dá)水平的操作概稱為基因組挖掘(genome mining)。目前,常見(jiàn)的微生物基因組挖掘手段主要有抗終止、途徑特異性調(diào)控激活、基因簇倍增、組合生物合成、代謝工程等[29]。近年來(lái)發(fā)展的CRISPR-BEST[30]或aMSGE[31]等對(duì)相應(yīng)的蛋白編碼基因或調(diào)控序列進(jìn)行遺傳操作也極大地提高了發(fā)現(xiàn)放線菌來(lái)源新抗生素的機(jī)會(huì)。

基于多拷貝基因簇可以大幅度提高編碼天然產(chǎn)物合成量,研究者可以利基因編輯技術(shù),將完整的生物合成基因簇克隆且定向定點(diǎn)地整合到放線菌基因組特定位點(diǎn),為該產(chǎn)物高效生物合成創(chuàng)造條件。Liao等[32]將完整的Nikkomycin生物合成基因簇整合到產(chǎn)生菌異色鏈霉菌(Streptomycesansochromogenes) 7100基因組上,成功地獲得Nikkomycin高產(chǎn)菌株 (產(chǎn)量由340 mg/L提高到1 100 mg/L)。

組合生物合成 (Combinatorial biosynthesis)是在人們克隆得到大量的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇及對(duì)相關(guān)合成基因功能進(jìn)行分析,以及了解其生物合成、調(diào)節(jié)等基因的基礎(chǔ)上,通過(guò)基因編輯等DNA操作技術(shù)在體外對(duì)這些不同來(lái)源的基因進(jìn)行刪除、倍增、添加、取代以及重組,然后導(dǎo)入到一個(gè)適當(dāng)?shù)奈⑸锼拗髦胁⒍ㄏ蚝铣尚驴股鼗蚱渌恍┬碌纳砘钚晕镔|(zhì)的一種復(fù)雜、綜合性生物技術(shù)[33]。Basnet等[34]將clorobiocin的鹵化酶基因與novobiocin生物合成基因簇在天藍(lán)色鏈霉菌M152中共表達(dá),并將甲基化酶NovO阻斷,成功獲得鹵化取代甲基的新鹵化物noclobiocin114。 Basnet等[34]將委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuelae)來(lái)源的P450編碼基因pikC導(dǎo)入到erythromycin生物合成基因簇的eryBV編碼基因刪除的紅糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)菌株中,進(jìn)行異源表達(dá)獲得了與Erythromycin B具有相似的生物活性的新結(jié)構(gòu)類似物5-O-desosaminyl erythronolide B 和5-O-desosaminyl erythronolide A。Kunakom等[35]也關(guān)注到了Alessandra等將clorobiocin的鹵化酶基因與novobiocin生物合成基因簇的在天藍(lán)色鏈霉菌M152中共表達(dá),并將該基因簇的甲基化酶NovO阻斷,成功獲得了糖基C3氨基被吡咯取代的新型化合物noclobiocin102。Han等[36]分別將參與糖基合成desIII、desIV、desI、desII、desV、desVI等基因與desVII/desVIII進(jìn)行不同基因間組合整合入ermE啟動(dòng)子調(diào)控下的pSET34質(zhì)粒載體,構(gòu)建了一系列的重組穿梭質(zhì)粒載體,并分別轉(zhuǎn)化敲除了糖基合成基因簇的委內(nèi)瑞拉鏈霉菌YJ003菌株,成功得到了正常的天然產(chǎn)物narbomycin及系列的衍生物。Minami等[37]利用參與次級(jí)代謝糖基化酶基因不保守性和識(shí)別糖基配體的寬容性合成新型糖基化修飾原理, 將Vicenistatin糖基化酶異源表達(dá)純化酶蛋白催化一系列的配醣體,得到了dTDP-vicenisamine修飾的系列衍生物。Myronovskyi等[38]將不同來(lái)源的糖基配體合成基因簇與糖基化酶基因的組合生物合成,通過(guò)異源組合表達(dá)成功實(shí)現(xiàn)angucyclines、aranciamycins等新化合物的系列突變衍生物合成。

4 展 望

盡管特殊生境來(lái)源放線菌資源收集結(jié)合生理水平和基因水平的天然產(chǎn)物挖掘已經(jīng)極大地增加了研究者通過(guò)基因組挖掘的方法獲得新次級(jí)代謝產(chǎn)物的機(jī)會(huì),促進(jìn)了放線菌活性天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā),但是,由于開(kāi)發(fā)抗耐藥菌感染抗生素的過(guò)程異乎尋常地困難,很多研究者和制藥公司放棄了這方面的研究,2011 年輝瑞制藥關(guān)閉了其抗生素研發(fā)中心,也意味著抗生素開(kāi)發(fā)泥土?xí)r代的落幕。目前,全球前18家最大的制藥公司中,已有15家徹底退出了抗生素市場(chǎng),抗生素的開(kāi)發(fā)前景這些問(wèn)題被提上日程。后新冠肺炎疫情時(shí)代,由于SARS-Cov2可能在很長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)將和人類社會(huì)共存,越來(lái)越多的證據(jù)表明,大量新冠肺炎患者在住院期間被診斷出患有繼發(fā)感染[39]。目前尚不清楚這些感染的具體原因,但有跡象表明,患有病毒性呼吸道感染的患者更易出現(xiàn)細(xì)菌感染,引起這些繼發(fā)感染的細(xì)菌是對(duì)多種藥物具有耐藥性的細(xì)菌[40]。后疫情新冠肺炎時(shí)代, 開(kāi)發(fā)抗耐藥菌感染的新抗生素更應(yīng)該引起人們的重視。

抗耐藥菌抗生素的開(kāi)發(fā)面臨諸多的技術(shù)瓶頸,針對(duì)耐藥靶點(diǎn)的高通量藥物篩選等技術(shù)的進(jìn)步給包括放線菌來(lái)源的抗耐藥菌抗生素的開(kāi)發(fā)帶來(lái)巨大的機(jī)遇[41-42],新抗生素的開(kāi)發(fā)不再是對(duì)一個(gè)商業(yè)化的產(chǎn)物庫(kù)的簡(jiǎn)單的篩選和抗菌效果驗(yàn)證問(wèn)題,而是需要充分考慮多方面技術(shù)綜合集成的多學(xué)科的充滿挑戰(zhàn)的工作[42-43]。將微生物表觀遺傳等技術(shù)引入放線菌天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā),抗生素痕量分析技術(shù)引入活性天然產(chǎn)物生物合成的檢測(cè),天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析平臺(tái)及軟件的改進(jìn)、代謝中間產(chǎn)物示蹤技術(shù)的發(fā)展、基因編輯及代謝工程的組合應(yīng)用[44-49]等可能會(huì)給放線菌來(lái)源抗耐藥菌感染抗生素帶來(lái)新的明天[50-51]。

致謝感謝陜西省自然科學(xué)礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目(2020JM-545,2020JM-550,2021JM-416)、大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(D2019224,D2020146,D2020167,D2020161,202110719023)對(duì)本工作的支持。尚坤、閻瑾逸與高君梅對(duì)本工作有同等貢獻(xiàn)。