唐鵬程，王雪亭，尚文文，胡靜雯

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇淮安 223003；2.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院本科生院，江蘇淮安 223003）

原花青素（Proantho cyanidins，PC） 作為公認(rèn)的天然抗氧化劑是植物中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱[1-2]，具有消除自由基的能力，能夠高效地消除超氧陰離子自由基和羥基自由基，其清除自由基的能力是維E 的50 倍。雖然不是最強(qiáng)抗氧化劑，但是基于其水溶性的性質(zhì)，總體吸收率遠(yuǎn)遠(yuǎn)領(lǐng)先于其他物質(zhì)。

目前，從植物中提取原花青素的研究中已發(fā)現(xiàn)蓮子殼[3]、藍(lán)莓[4]、白刺果[5]、珊瑚樹(shù)葉[6]、鎖陽(yáng)[7]、油茶殼[8]中都存在原花青素。近期的研究表明，百香果也含有原花青素[9-10]。利用雙酶輔助法提取百香果中原花青素，通過(guò)優(yōu)化提取工藝，提高原花青素得率，并檢測(cè)其抗氧化活性。

1 材料與試劑

百香果，市售；

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品、十二水合硫酸鐵胺（Ⅲ）、濃鹽酸、正丁醇、無(wú)水乙醇、DPPH 試劑。

2 試驗(yàn)方法

2.1 原花青素提取

取新鮮百香果5 顆，去籽，用粉碎機(jī)粉碎1 min，得提取原料。準(zhǔn)確稱取百香果原料1 g，纖維素酶和果膠酶10 mg。置于50 mL 燒杯中加入純水10 mL 并滴入酶，于恒溫40 ℃下與酶反應(yīng)30 min。再添加乙醇溶液10 mL，升高溫度到70 ℃后，提取1 h，制得百香果皮中的原花青素的提取母液。

百香果原花青素提取率的計(jì)算公式：

2.2 原花青素檢測(cè)

試驗(yàn)方法采用Lawrence J Porter 等人[11]的鐵鹽催化比色法。

2.2.1 配制鐵鹽催化比色法顯色劑溶液

將1.029 8 g 十二水合硫酸鐵銨（Ⅲ） 精確稱量并溶于濃度為2 mol/L 的鹽酸溶液4 mL 中，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的硫酸鐵銨溶液；另外，將正丁醇與濃度為2 mol/L 的鹽酸溶液按體積比V(正丁醇)∶V(鹽酸)=95∶5 混合均勻，即得正丁醇- 鹽酸溶液[12]。

2.2.2 原花青素測(cè)定

取10 mL 的試管，在其中分別加入樣液1.0 mL、正丁醇- 鹽酸溶液6.0 mL 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的硫酸鐵銨溶液0.2 mL 后，振蕩試管使其中液體充分混合均勻，在水浴100 ℃下反應(yīng)40 min，反應(yīng)結(jié)束后放在冰水中冷卻至常溫，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)547 nm 下檢測(cè)該混合液的吸光度，以此來(lái)有效實(shí)現(xiàn)對(duì)原花青素含量的測(cè)定[12]。

2.2.3 建立原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取50.0 mg 的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品放在25 mL 的容量瓶當(dāng)中，使用無(wú)水乙醇將其定容至容量瓶的刻度線，充分搖勻后得到質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以4 mL 為基準(zhǔn)，配制稀釋溶液使其各組的質(zhì)量濃度分別為0，0.04，0.08，0.12，0.16，0.2 mg/mL，于波長(zhǎng)547 nm 處測(cè)定各質(zhì)量濃度的吸光度，建立吸光度對(duì)原花青素質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]，得線性方程為：A=5.304 3C+0.004 86，R2=0.985 9。

標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 果膠酶和纖維素酶配比的篩選

分別取10 mg 的果膠酶和纖維素酶溶于10 mL純水。取百香果1 g 加入20 mL 純水，按10 ∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，0∶10 的配比和1 組不加酶的對(duì)照組共分成12 組，在40 ℃下與酶反應(yīng)30 min，加入乙醇溶液10 mL，升高溫度到70 ℃，提取1 h。比較各組提取率，得出酶的最佳配比。

2.4 混合酶最佳反應(yīng)條件的確定

2.4.1 酶解溫度的確定

取百香果1 g，在果膠酶與纖維素酶配比為7∶3，溶液pH 值為4，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶15（g∶mL），酶解時(shí)間1 h，測(cè)量溫度分別為30，35，40，45，50，55，60 ℃時(shí)對(duì)酶活性的影響。

2.4.2 酶解pH 值的確定

取百香果1 g，果膠酶與纖維素酶的配比為7∶3，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶15（g∶mL），酶解溫度為40 ℃，酶解時(shí)間為1 h，酶解pH 值為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，分別觀察酶溶解時(shí)的pH 值對(duì)酶活性的影響。

2.4.3 酶解時(shí)間的確定

取百香果1 g 時(shí)，果膠酶與纖維素酶的配比為7∶3，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶15（g∶mL），酶解溫度為40 ℃，溶液pH 值為4，酶解時(shí)間為0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00 h 時(shí)對(duì)酶活性的影響。

2.4.4 正交試驗(yàn)

在酶解溫度、酶解pH 值和酶解時(shí)間3 個(gè)單因素的條件下，以提取率為考查指標(biāo)進(jìn)行設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)

2.5 不同提取條件對(duì)百香果原花青素提取率的影響

2.5.1 反應(yīng)溫度對(duì)百香果原花青素提取率的影響

取百香果1 g，以酶的最適條件處理，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶15（g∶mL），反應(yīng)時(shí)間1 h，酶解溫度分別為30，40，50，60，70，80，90，100 ℃時(shí)，研究酶解溫度對(duì)原花青素提取率的影響。

2.5.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)百香果原花青素提取率的影響

取百香果1 g，以酶的最適條件處理，在酶解溫度70 ℃，料液比1∶15（g∶mL），酶解時(shí)間1 h 的條件下考查乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%，40%，50%，60%，70%，80%對(duì)原花青素提取率的影響。

2.5.3 料液比對(duì)百香果原花青素提取率的影響

取百香果1 g，以酶的最適條件處理，在酶解溫度70 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，酶解時(shí)間1 h，料液比分別為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（g∶mL） 時(shí)，研究料液比對(duì)原花青素提取率的影響。

2.5.4 酶解時(shí)間對(duì)百香果原花青素提取率的影響

取百香果1 g，以酶的最適條件處理，在酶解溫度70 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶15（g∶mL），酶解時(shí)間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h時(shí)，研究酶解時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化百香果原花青素提取工藝

在單因素的條件下，選定溫度為70 ℃時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，把乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和酶解時(shí)間作為變量，用百香果皮中提取的原花青素提取率作為響應(yīng)值，運(yùn)用Minitab 19 軟件，進(jìn)行L9（34）試驗(yàn)。

L9（34）因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 L9（34）因素與水平設(shè)計(jì)

2.7 抗氧化性檢測(cè)

取1.8 mg DPPH 用乙醇溶液50 mL 定容，得DPPH- 乙醇溶液。取4 mL DPPH- 乙醇溶液，分別加入不同濃度的百香果原花青素樣品液，振蕩后，避光靜置30 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度，進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)，計(jì)算百香果原花青素對(duì)DPPH 自由基的清除活性[13]。清除率計(jì)算公式為：

式中：A0——避光前的吸光度；

A1——靜置30 min 后的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 果膠酶和纖維素酶的最佳配比的確定

2 種酶的不同配比對(duì)百香果中花青素提取率的影響見(jiàn)表3，2 種酶的不同配比對(duì)百香果中花青素提取率的影響見(jiàn)圖2。

表3 2 種酶的不同配比對(duì)百香果中花青素提取率的影響

圖2 2 種酶的不同配比對(duì)百香果中花青素提取率的影響

由圖2 可知，果膠酶的加入對(duì)百香果中原花青素的提取率有促進(jìn)作用，當(dāng)果膠酶∶纖維素酶達(dá)到7∶3 時(shí)，提取率會(huì)達(dá)到最大值。

3.2 混合酶最佳酶解條件的確定

3.2.1 酶解溫度的確定

研究酶解溫度分別為30，35，40，45，50，55，60 ℃時(shí)，原花青素的提取率。

酶解溫度對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)提取率的影響

由圖3 可知，適當(dāng)提高溫度可以提高酶活性。當(dāng)酶解溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，酶活性降低。因此，最佳酶解溫度為40 ℃。

3.2.2 酶解pH 值的確定

研究酶解pH 值分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0 時(shí)，原花青素的提取率。

pH 值對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 pH 值對(duì)提取率的影響

由圖4 可知，該混合酶在pH 值為4 時(shí)，提取率達(dá)到0.025%，酶活性最高，隨著pH 值增大，提取率顯著下降，酶活性迅速下降。

3.2.3 酶解時(shí)間的確定

研究酶解時(shí)間分別為0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00 h 時(shí)，原花青素的提取率。

酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖5。

由圖5 可知，用雙酶輔助提取時(shí)，酶解時(shí)間0.75 h 的提取率最大，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)原花青素得率逐漸降低。

3.2.4 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4 可知，當(dāng)酶解溫度為40 ℃，酶溶解pH值為4，酶解時(shí)間為0.75 h 時(shí)是酶解的最適條件，與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.3 不同提取條件對(duì)百香果中原花青素提取率的影響

3.3.1 酶解溫度對(duì)百香果中原花青素提取率的影響

酶解溫度對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 酶解溫度對(duì)提取率的影響

由圖6 可知，百香果中原花青素的提取率隨著酶解溫度的上升逐漸增長(zhǎng)。酶解溫度對(duì)酶解體系的萃取效果具有雙重效應(yīng)。一方面，溫度升高有利于改善體系傳質(zhì)效能，加大擴(kuò)散系數(shù)，利于原花青素向溶劑中擴(kuò)散，提高萃取率；另一方面，隨著提取溫度的升高，短時(shí)間內(nèi)高溫分解原花青素的量低于提取的原花青素的量。為避免乙醇大量揮發(fā)，影響料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)，酶解溫度定為70 ℃。

3.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)百香果原花青素提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

由圖7 可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)低或過(guò)高都不利于百香果皮中原花青素的提取，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，原花青素的提取率達(dá)到了最佳值0.39%。原花青素作為多酚化合物，容易溶解在水和大多數(shù)的有機(jī)溶劑當(dāng)中，當(dāng)從百香果皮中提取出的原花青素的極性與當(dāng)前系統(tǒng)的極性相像時(shí)，更容易被提取。

3.3.3 料液比對(duì)百香果原花青素提取率的影響

料液比對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖8。

圖8 料液比對(duì)提取率的影響

由圖8 可知，從百香果中提取原花青素的速率隨料液比先增加后降低。當(dāng)料液比為1∶10（g∶mL），提取率達(dá)到最佳值0.52%。

3.3.4 酶解時(shí)間對(duì)百香果原花青素提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖9。

圖9 酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖9 可知，當(dāng)酶解時(shí)間不充足時(shí)，存在于百香果皮中的原花青素不能完全擴(kuò)散到乙醇和水的混合溶劑當(dāng)中，使得體系萃取的效果不完全；當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)2.0 h 時(shí)，原花青素會(huì)因?yàn)榉纸饬考ぴ?，?duì)產(chǎn)率的提高造成不利影響。當(dāng)酶解時(shí)間為1.5 h 時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)百香果中原花青素的有效提取。

3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化百香果原花青素的提取工藝

3.4.1 建立模型

響應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 響應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

利用Minitab 19 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合。

3.4.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

兩因素交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖10。

圖10 兩因素交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

利用Minitab19 軟件通過(guò)響應(yīng)面法分析了乙醇體值基本吻合，說(shuō)明該試驗(yàn)基于響應(yīng)面法優(yōu)化得出的提取工藝準(zhǔn)確可信。

3.5 抗氧化性檢測(cè)

百香果原花青素對(duì)DPPH 自由基清除率的影響見(jiàn)圖11。

由圖11 可知，百香果原花青素對(duì)DPPH 自由基具有更高的清除能力，并且隨著原花青素濃度的增加。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，百香果原花青素與DPPH 自由積分?jǐn)?shù)、料液比和酶解時(shí)間之間的相互作用，繪制了以百香果中的原花青素為響應(yīng)值的響應(yīng)面3D 曲面圖。依據(jù)圖中各因素的趨勢(shì)，可以直觀地反映出該因子對(duì)百香果中的原花青素提取率的影響程度。由圖10（a） （b） （e） （f） 可知，當(dāng)原花青素的提取率隨料液比先增大后減小。由圖10（c） 和10（d） 可知，當(dāng)料液比大于一定的乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間有利于提高提取率。

由響應(yīng)面的三維曲面圖可知，響應(yīng)值存在最大值。通過(guò)Minitab19 軟件模擬優(yōu)化，得到百香果原花青素提取最優(yōu)的理論工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)54%，料液比1∶6.8，反應(yīng)時(shí)間1.44 h，該條件下提取率為0.94%。

3.4.3 響應(yīng)面法的可靠性

為驗(yàn)證理論模型的可靠性，在經(jīng)過(guò)酶解的最優(yōu)方法處理后，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)54%，料液比1∶6.8，酶解溫度70 ℃，酶解時(shí)間1.44 h，做3 次平行試驗(yàn)，提取率分別為0.959%，1.125%，1.096%，計(jì)算出3 次試驗(yàn)的平均提取率為1.06%，與模擬出理論基的反應(yīng)十分迅速，滴入原花青素提取液立即褪為透明色。

4 結(jié)論

經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，以百香果皮為原材料提取原花青素的最佳工藝為料液比1∶6.8，乙醇體積分?jǐn)?shù)54%，先在果膠酶∶纖維素酶7∶3，pH 值4，40 ℃的條件下酶解0.75 h，再70 ℃提取1.44 h，在這種條件下原花青素的提取率可達(dá)到1.06%。同時(shí)，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)百香果中的原花青素具有較強(qiáng)的抗氧化性。

圖11 百香果原花青素對(duì)DPPH 自由基清除率的影響