張思雨,程建軍,孫玉雪,解慶剛,,張永久,蔣士龍*,郭明若,3*

1(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱,150030)2(黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司,北京,100015) 3(佛蒙特大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品科學(xué)系,美國(guó) 伯靈頓,05405)

嬰兒配方奶粉的主要成分為蛋白質(zhì)、乳糖、脂肪、維生素以及礦物質(zhì),當(dāng)無(wú)法母乳喂養(yǎng)時(shí),嬰兒配方奶粉在嬰兒身體生長(zhǎng)、智力發(fā)育、激素調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[1]。然而,在沖調(diào)過(guò)程中產(chǎn)生的大量泡沫會(huì)降低嬰兒配方奶粉的穩(wěn)定性,嬰幼兒調(diào)節(jié)橫膈膜的神經(jīng)尚未發(fā)育完善,這會(huì)導(dǎo)致嬰兒吸入空氣后引起脹氣、吐奶等癥狀[2]。嬰兒配方奶粉起泡性問(wèn)題受到了越來(lái)越多的關(guān)注。

嬰兒配方奶粉成分復(fù)雜,蛋白質(zhì)、脂肪、游離脂肪酸均可能影響起泡性[3-4]。其中,蛋白質(zhì)是嬰幼兒配方粉中產(chǎn)生氣泡的主要成分。作為兩親性分子,蛋白質(zhì)中的疏水基團(tuán)使其能自發(fā)地吸附于氣-水界面,蛋白吸附層的形成導(dǎo)致界面張力降低,有利于泡沫的形成和穩(wěn)定[5]。嬰兒配方奶粉中含量最多的蛋白是乳清蛋白,在加工過(guò)程中主要的乳清蛋白來(lái)源為脫鹽乳清粉(demineralized whey powder, DW)、濃縮乳清蛋白(whey protein concentrate, WPC)[6]。其中脫鹽乳清粉可根據(jù)鹽分的脫除程度進(jìn)一步分類,D70和D90分別指灰分脫除程度為70%和90%,在嬰兒配方奶粉加工過(guò)程中較為常用。目前,已有許多研究討論不同蛋白的起泡特性,如大豆蛋白、蛋清蛋白等[7-8]。然而,對(duì)不同的乳清蛋白起泡性研究較為缺乏。此外,作為嬰幼兒配方粉加工過(guò)程中常見(jiàn)的操作單元,加熱處理會(huì)改變蛋白的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及起泡特性[9]。乳清蛋白中主要組成為α-乳球蛋白以及β-乳白蛋白,作為球狀蛋白,隨著溫度的升高非共價(jià)鍵被破壞,結(jié)構(gòu)開始展開,最初的展開是可逆的;當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間在高于變性溫度(70 ℃)的條件下時(shí),其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的破壞,促進(jìn)分子間疏水相互作用以及聚集的形成[10]。研究表明,當(dāng)熱處理溫度高于60 ℃時(shí),乳清蛋白的起泡能力發(fā)生變化,且不同的加熱溫度以及時(shí)間對(duì)其起泡特性有顯著影響[11-12]。目前結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)條件探究不同加熱處理對(duì)乳清蛋白起泡性影響的研究比較有限。

因此,本文首先比較D70、D90、WPC起泡特性差異,并采用光譜技術(shù)、激光衍射等技術(shù)表征并比較了嬰兒配方粉加工過(guò)程中常見(jiàn)的熱處理,包括均質(zhì)(50～60 ℃ 30 min)、濃縮(50 ℃ 10 min)、殺菌(80 ℃ 20 s)對(duì)乳清蛋白結(jié)構(gòu)、理化特性和起泡特性的影響,通過(guò)皮爾遜相關(guān)性分析考察起泡特性和結(jié)構(gòu)性質(zhì)之間的關(guān)系,以期為提高嬰兒配方粉品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫鹽乳清粉D70(12.6%蛋白,82.1%乳糖,0.7%脂肪,1.1%水分,2.6%灰分),法國(guó)紅鳥;脫鹽乳清粉D90(13.5%蛋白,83.0%乳糖,0.3%脂肪,2.1%水分,0.8%灰分),荷蘭DOMO;濃縮乳清蛋白WPC(78.5%蛋白,7.02%乳糖,4.53%脂肪,4.31%水分,4.93%灰分),美國(guó)Hilmar公司;8-苯胺-1-萘磺酸(8-aniline-1-naphthalene sulfonic acid,ANS)、5,5-二硫-雙2-硝基苯甲酸,Sigma公司。本試驗(yàn)使用的分析試劑均為分析級(jí)試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

C-MAG HS 7 digital型磁力攪拌器、Ultra Turrax T25型高速剪切機(jī),德國(guó)艾卡IKA公司;Zetasizer nano ZS納米粒度及Zeta電位儀,英國(guó)馬爾文公司;紫外分光光度計(jì),中國(guó)普析通用儀器有限公司;Chirascan型圓形二色光譜儀,英國(guó)應(yīng)用光物理公司;F-7000型熒光分光光度計(jì),日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同加熱處理乳清蛋白的制備

在室溫條件下用去離子水溶解D70、D90及WPC,蛋白質(zhì)量濃度統(tǒng)一為10 mg/mL,在轉(zhuǎn)速為700 r/min 條件下混合2 h,將溶液置于4 ℃過(guò)夜水合。溶液恢復(fù)至室溫后,在50 ℃ 10 min、50 ℃ 30 min、80 ℃ 20 s水浴加熱,迅速利用冰水浴冷卻至室溫,得到D70、D70 50 ℃10 min、D70 50 ℃ 30 min、D70 80 ℃ 20 s;D90、D90 50 ℃ 10 min、D90 50 ℃ 30 min、D90 80 ℃ 20 s;WPC、WPC 50 ℃ 10 min、WPC 50 ℃ 30 min、WPC 80 ℃ 20 s。

1.3.2 起泡能力和泡沫穩(wěn)定性測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法測(cè)定起泡能力和泡沫穩(wěn)定性。將D70、D90、WPC用去離子水溶解,蛋白質(zhì)量濃度統(tǒng)一為10 mg/mL,溶液體積為50 mL。利用高速剪切機(jī)10 000 r/min攪打2 min,分別記錄攪打后0 min和30 min后的體積為V1、V30。按照公式(1)、公式(2)計(jì)算起泡能力以及泡沫穩(wěn)定性:

(1)

(2)

1.3.3 粒徑和電位的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[14]方法對(duì)樣品的粒徑和電位進(jìn)行測(cè)定。溶液首先用去離子水稀釋至1 mg/mL,然后進(jìn)行粒徑和電位的測(cè)定。設(shè)定溶劑的折光系數(shù)為1.33,平衡時(shí)間為120 s。粒徑用體積平均直徑(D43)表示。

1.3.4 蛋白質(zhì)溶解度及濁度測(cè)定

濁度為紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液(2 mg/mL)在633 nm處的吸光度。對(duì)于溶解度的測(cè)定,將蛋白溶液質(zhì)量濃度稀釋至0.5 mg/mL,在10 000 r/min離心15 min,取上清液及蛋白溶液,以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,用Bradford法測(cè)定溶解度。蛋白質(zhì)溶解度的計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

1.3.5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

利用圓二色光譜儀測(cè)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。將蛋白溶液(0.1 mg/mL)置于0.1 cm石英比色皿中,在190～260 nm內(nèi)掃描得到CD光譜,帶寬為1 nm。二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲)含量通過(guò)系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行計(jì)算。

1.3.6 巰基含量的測(cè)定

游離巰基含量的測(cè)定采用SHENG等[15]的方法。將5 mg/mL的蛋白溶液與2.5 mL Tris-甘氨酸緩沖液和Ellman試劑混合,在室溫下反應(yīng)15 min后測(cè)定412 nm處吸光度。游離巰基按照公式(4)進(jìn)行計(jì)算:

(4)

式中:OD412為樣品在412 nm處的吸光度;D為稀釋倍數(shù);C為蛋白濃度。

1.3.7 表面疏水性的測(cè)定

以1-苯胺-8-萘磺酸(1-aniline-8-naphthalene sulfonic acid,ANS)為熒光探針測(cè)定樣品的表面疏水性[16]。將20 μL ANS(8.0 mmol/L, pH 7.0)加入到質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL,體積為4 mL的樣品中。用熒光分光光度計(jì)掃描得到熒光光譜,條件設(shè)置為:激發(fā)波長(zhǎng)370 nm,發(fā)射波長(zhǎng)400～700 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫5 nm,PMT電位為600 V,以最大熒光強(qiáng)度作為疏水性指數(shù),標(biāo)記為H0。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

樣品的各指標(biāo)均測(cè)定3次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation,SD)表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)分析軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA),P<0.05表示存在顯著性差異。采用二元線性相關(guān)中的Pearson相關(guān)分析來(lái)確定發(fā)泡性能與其他理化性能之間的相關(guān)性。本試驗(yàn)結(jié)果圖使用Origin 2021 b軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清蛋白起泡特性比較

由圖1可以看出,3種乳清蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性存在顯著差異(P<0.05),起泡能力大小依次為D70(95.62±6.90)%、D90(73.98±10.99)%、WPC(60.39±9.07)%,泡沫穩(wěn)定性大小依次為D70(65.02±0.71)%、D90(24.47±3.89)%、WPC(13.91±4.77)%。與WPC相比,D70和D90的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性較高,這可能是由于D70和D90樣品中乳糖含量較多。糖類的添加會(huì)增加表觀黏度,從而抑制泡沫析出,提高泡沫穩(wěn)定性[17]。此外,與D70和D90相比,WPC中脂肪含量較高可能是WPC泡沫穩(wěn)定性較低的原因之一。在KAMATH等[4]的研究中,全脂牛奶與脫脂牛奶相比泡沫由于聚結(jié)而出現(xiàn)更高的破裂程度,這可能是脂肪不能形成黏彈性界面層穩(wěn)定泡沫。

圖1 乳清蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性Fig.1 The foaming capacity and foam stability of whey protein注:不同小寫字母(a～b)表示起泡能力存在顯著差異(P<0.05), 不同大寫字母(A～C)表示泡沫穩(wěn)定性存在顯著差異(P<0.05)(下同)。

2.2 加熱處理對(duì)乳清蛋白起泡特性和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響

2.2.1 加熱處理對(duì)乳清蛋白起泡特性的影響

圖2為加熱處理對(duì)乳清蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的影響。在不同加熱處理下,D70起泡能力略微。上升,泡沫穩(wěn)定性略微降低,與對(duì)照組相比不存在顯著差異,表明不同程度的加熱對(duì)D70的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性影響較小。在D90中,不同加熱處理后樣品的起泡能力與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。在泡沫穩(wěn)定性方面,與其他3組相比,80 ℃ 20 s處理樣品泡沫穩(wěn)定性顯著提高(P<0.05),與對(duì)照組相比提高50%,說(shuō)明80 ℃ 20 s對(duì)D90的泡沫穩(wěn)定性產(chǎn)生較大影響。在WPC對(duì)照組中,起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分別為(60.39±9.07)%、(11.25±1.77)%,隨著熱處理溫度的增加、時(shí)間的延長(zhǎng),WPC的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性提高。經(jīng)80 ℃ 20 s處理,起泡能力和泡沫穩(wěn)定性為(78.82±11.10)%、(29.37±3.46)%,與對(duì)照組相比分別提高了30%、62%,說(shuō)明不同加熱處理對(duì)WPC起泡能力和泡沫穩(wěn)定性存在影響,其中80 ℃ 20 s影響最大。D70和D90與WPC相比,在加熱條件下起泡特性變化較小可能是乳糖的存在能夠抑制蛋白變性,保持蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,因此對(duì)起泡特性影響較小[18]。

a-D70;b-D90;c-WPC圖2 加熱處理后乳清蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性Fig.2 The foaming capacity and foam stability of whey protein under heat treatment

2.2.2 加熱處理對(duì)乳清蛋白粒徑大小的影響

加熱處理對(duì)乳清蛋白粒徑影響如圖3所示。加熱處理導(dǎo)致樣品的粒徑減小,這可能是由于加熱使蛋白分子展開,疏水基團(tuán)的暴露導(dǎo)致水層降低,從而水動(dòng)力半徑減小。與對(duì)照組相比,經(jīng)80 ℃ 20 s處理后D70(262 nm)、D90(209 nm)、WPC(249 nm)的粒徑降低至241、193、226 nm。經(jīng)80 ℃ 20 s粒徑最小可能與達(dá)到蛋白變性溫度,蛋白分子結(jié)構(gòu)展開程度高有關(guān)。ZHANG等[9]在對(duì)乳清蛋白進(jìn)行加熱時(shí)得到類似結(jié)果,發(fā)現(xiàn)乳清蛋白未加熱樣品的平均粒徑顯著大于熱處理樣品。粒徑大小與蛋白質(zhì)在氣-水界面的吸附行為有關(guān)。本研究中,與對(duì)照組的大顆粒相比,加熱后乳清蛋白顆粒變小有利于向氣-水界面快速移動(dòng)。

a-D70;b-D90;c-WPC圖3 加熱處理對(duì)乳清蛋白粒徑大小的影響Fig.3 Effects of heating treatments on the particle size of whey protein

2.2.3 加熱處理對(duì)乳清蛋白電位的影響

如圖4所示,與對(duì)照組相比,D70和D90樣品經(jīng)熱處理電位值不存在顯著差異,在WPC中,熱處理使WPC電位值顯著降低(P<0.05)。加熱處理后的乳清蛋白樣品具有更高的電位絕對(duì)值,可能的原因是加熱使蛋白中的電荷發(fā)生重排,更多的電荷暴露出來(lái),從而具有更高的電位絕對(duì)值[19]。此外,與D90和WPC樣品相比,D70樣品的電位絕對(duì)值低于30 mV。蛋白較低荷絕對(duì)值能降低界面靜電勢(shì)壘,促進(jìn)分子快速吸附于氣-水界面,從而促進(jìn)發(fā)泡性能[20],這可能解釋了D70的高起泡特性。

a-D70;b-D90;c-WPC圖4 加熱處理對(duì)乳清蛋白電位的影響Fig.4 Effects of heating treatments on the zeta potential of whey protein

2.2.4 加熱處理對(duì)乳清蛋白溶解度及濁度的影響

加熱處理對(duì)乳清蛋白的溶解度無(wú)顯著影響(圖5)。經(jīng)過(guò)熱處理,溶解度出現(xiàn)輕微降低,這可能是由于乳清蛋白中的主要成分是β-乳球蛋白,作為球狀蛋白,在熱處理時(shí)結(jié)構(gòu)易展開,疏水基團(tuán)暴露,導(dǎo)致溶解度降低[21]。

在本研究中,濁度的變化與溶解度呈相反趨勢(shì)(圖6),樣品濁度隨著溶解度的降低而升高。在D70、D90和WPC中,80 ℃經(jīng)20 s處理樣品濁度最大,與對(duì)照組相比分別提高了17%、12%、17%。濁度的提高可能是由于乳清蛋白熱穩(wěn)定性較差,加熱時(shí)巰基暴露并在二硫鍵作用下聚合。當(dāng)加熱溫度超過(guò)60 ℃后,乳清蛋白分子變性,進(jìn)一步展開形成聚合物,溫度的增加使得乳清蛋白的聚合程度逐步增強(qiáng),因此濁度增加。

a-D70;b-D90;c-WPC圖6 加熱處理對(duì)乳清蛋白濁度的影響Fig.6 Effects of heating treatments on the turbidity of whey protein

2.2.5 加熱處理對(duì)乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

由圖7和表1可以看出,經(jīng)過(guò)不同的加熱處理,D70、D90、WPC樣品的峰形相似,樣品主要二級(jí)結(jié)構(gòu)相似,但是不同的加熱處理后蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變,80 ℃ 20 s處理二級(jí)結(jié)構(gòu)變化最大。與對(duì)照組相比,加熱處理后無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量提高,在D70中,無(wú)規(guī)則卷曲含量從36.5%增至36.9%;在D90中,無(wú)規(guī)則卷曲含量從35.9%增至38.7%;在WPC中,無(wú)規(guī)則卷曲含量從34.1%增至34.9%。二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化會(huì)影響起泡能力,無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量提高表明蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)從有序變?yōu)闊o(wú)序,構(gòu)象柔韌性提高,柔韌的分子結(jié)構(gòu)有助于改善發(fā)泡性能[22]。

表1 加熱處理后乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 1 The content of secondary structure of whey protein under heat treatment

a-D70;b-D90;c-WPC圖7 加熱處理對(duì)乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effects of heating treatments on the secondary structure content of whey protein

2.2.6 加熱處理對(duì)乳清蛋白巰基含量的影響

游離巰基是影響蛋白質(zhì)性質(zhì)的重要因素,能夠反應(yīng)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象變化程度(圖8)。與對(duì)照組相比,在加熱的條件下樣品的游離巰基顯著提高(P<0.05)。在3個(gè)乳清蛋白樣品中,80 ℃ 20 s組與對(duì)照組相比游離巰基含量增加最多,這可能與加熱處理使乳清蛋白原先位于內(nèi)部的巰基暴露以及二硫鍵的斷裂有關(guān)。本研究結(jié)果與房天琪[23]研究結(jié)果相似,即加熱處理使乳清蛋白游離巰基含量顯著增加,構(gòu)象也發(fā)生改變。

a-D70;b-D90;c-WPC圖8 加熱處理對(duì)乳清蛋白游離巰基含量的影響Fig.8 Effects of heating treatments on the free sulfhydryl content of whey protein

2.2.7 加熱處理對(duì)乳清蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性在蛋白質(zhì)泡沫的形成和穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用,表面疏水性的增加有利于蛋白質(zhì)分子快速擴(kuò)散到氣-水界面,促進(jìn)蛋白質(zhì)在界面上的吸附、擴(kuò)散和重排。如圖9所示,經(jīng)過(guò)熱處理后乳清蛋白的表面疏水性出現(xiàn)不同程度的升高,經(jīng)過(guò)80 ℃ 20 s處理,D70和WPC的表面疏水性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。表面疏水性的提高是由于加熱處理使乳清蛋白分子展開,β-乳球蛋白等球狀蛋白的展開使原本位于內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露[24]。乳清蛋白經(jīng)過(guò)加熱處理后的表面疏水性大小趨勢(shì)與起泡能力一致,說(shuō)明表面疏水性的提高可能是導(dǎo)致起泡性提高的重要原因。

a-D70;b-D90;c-WPC圖9 不同加熱處理對(duì)乳清蛋白表面疏水性的影響Fig.9 Effects of different heating treatments on the surface hydrophobicity of whey protein

2.3 相關(guān)性分析

通過(guò)皮爾遜相關(guān)性分析進(jìn)一步探究乳清蛋白起泡特性與理化、結(jié)構(gòu)特性之間的關(guān)系(圖10)。Zeta電位與起泡能力及泡沫穩(wěn)定性呈正相關(guān)(0.78/0.69),電位絕對(duì)值的降低能夠降低界面處?kù)o電屏障,促進(jìn)蛋白在氣水界面處的吸附,從而改善起泡能力[20]。α-螺旋與起泡能力和泡沫穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)(-0.81/-0.84),而β-轉(zhuǎn)角(0.82/0.67)和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量(0.74/0.60)與起泡特性呈正相關(guān),說(shuō)明二級(jí)結(jié)構(gòu)含量在起泡特性中起到重要作用。表面疏水性與起泡能力呈正相關(guān)(0.67/0.46),起泡特性的提高可能與樣品較高的表面疏水性有關(guān),較高的表面疏水性降低了蛋白質(zhì)在氣-水界面的界面能壘,從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)形成泡沫的能力[25]。綜上,電位值、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋結(jié)構(gòu)含量以及表面疏水性與蛋白的起泡特性呈顯著相關(guān)。這說(shuō)明蛋白的起泡特性主要受其表面性質(zhì)(表面電荷量及表面疏水性)、空間結(jié)構(gòu)(蛋白分子的柔性)影響。

圖10 起泡特性與理化特性相關(guān)性分析Fig.10 Correlation between foaming properties and physicochemical properties

3 結(jié)論

本試驗(yàn)確定了3種乳清蛋白起泡特性的差異,探討了不同加熱處理對(duì)乳清蛋白起泡能力和理化性質(zhì)的影響。D70、D90、WPC的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性存在顯著差異(P<0.05),D70的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性最高,其次為D90、WPC。在模擬不同加熱條件下,3種乳清蛋白起泡能力均出現(xiàn)不同程度的提高,粒徑、電位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象也發(fā)生一定的改變,其中80 ℃,20 s處理對(duì)乳清蛋白起泡能力和理化特性影響最大。皮爾遜相關(guān)性分析表明起泡能力的提高可能是由于加熱過(guò)程分子展開,無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)含量提高,表面疏水基團(tuán)的暴露。研究結(jié)果表明,需要進(jìn)一步進(jìn)行控制變量試驗(yàn)來(lái)說(shuō)明乳清蛋白中組成成分對(duì)樣品發(fā)泡性能的影響。