平文卉，史玉坤，楊清華，楊娟，施逸嵐，葉清華，張茹玥，程曉宏

（南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇南通 226000）

我國素來有“藥食同源，藥食同理”的文化，藥食同源類中藥材相對于只作為藥用的藥材在日常生活中更常見，使用頻率更高，與人類健康關(guān)系也更密切。中藥材農(nóng)藥殘留量超標，可能在人體中產(chǎn)生蓄積毒性作用，不僅會影響中藥材的安全用藥，而且已成為影響中藥材國際化的首要問題[1-2]。我國衛(wèi)生部2002 年3 月1 日公布的《既是食品又是藥品的物品名單》包含87 種中藥材[3]。由于農(nóng)藥殘留具有積累性、食物鏈傳遞性，對藥食同源中藥材進行監(jiān)管和檢測具有現(xiàn)實意義[4-5]。目前市面上藥食同源中藥材樣品種類繁多、基質(zhì)復(fù)雜，檢測時存在大量干擾因素，且需檢測的殘留農(nóng)藥種類多、性質(zhì)差異大、含量低，如何高效、準確地進行相關(guān)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留檢測是國家食品安全風(fēng)險監(jiān)測工作的重要部分[6-7]。

目前中國植源性食物中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[8-9]、高效液相色譜法[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12-13]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[14-15]等。中藥材種植中常見不同種類農(nóng)藥的聯(lián)合使用，農(nóng)藥殘留分析已不能滿足單一農(nóng)藥檢測，需要進行多種類農(nóng)藥同時檢測[16-17]。而關(guān)于藥食同源中藥材中多組分農(nóng)藥殘留一起檢出的快速、高效的檢測方法較少。固相萃取法具有快速、簡便、成本低的優(yōu)點，已成為歐洲標準委員會認可的快速檢測方法，被廣泛運用于植物性食品中農(nóng)藥殘留的檢測分析[18-19]。筆者對藥食同源中藥材樣品中氨基甲酸酯類、煙堿類、殺菌劑類等農(nóng)藥進行同時測定，共選擇29種農(nóng)藥為研究對象，使用固相萃取前處理技術(shù)和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀聯(lián)合分析測定，以期更好地滿足食品風(fēng)險監(jiān)測工作需要，實現(xiàn)快速、方便、有效、可靠的藥食同源中藥材中多種農(nóng)藥殘留同時檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

三重四級桿串聯(lián)液相色譜質(zhì)譜儀：AB Sciex APⅠ3200型，配有電噴霧離子化源，美國AB公司。

超快速液相色譜儀：UFLCXR 型，日本島津株式會社。

3-羥基克百威、克百威、惡霜靈、腈菌唑、吡唑嘧菌酯、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、殘殺威、環(huán)氧蟲啶、哌蟲啶、氯噻啉、烯啶蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲啉、呋蟲胺、噻蟲胺、三唑酮、苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、甲霜靈、嘧霉胺、烯酰嗎啉、丙環(huán)唑、戊唑醇、阿維菌素、滅蠅胺、吡蟲啉、啶蟲脒標準物質(zhì)：質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L，上海安譜實驗科技股份有限公司。

乙腈：色譜純，德國默克股份聯(lián)合公司。

甲酸：色譜純，迪馬科技有限公司。

甲酸銨：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

凈化管：SBEQ-CA8773-25 型，上海安譜實驗科技股份有限公司。

萃取包：SBEQ-CA8115-B型，上海安譜實驗科技股份有限公司。

中藥材樣品：靈芝及赤芝子原料切片10 份，市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

液 相 色 譜 柱：Agilent poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×3.0 mm，2.7 μm)；進樣體積：5 μL；記錄時長：16 min；流動相：(A)0.1%(體積比，下同)甲酸溶液(含5 mmol/L 甲酸銨)；(B)乙腈，流量為0.3 mL/min，梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜儀

掃描模式：正離子模式；電噴霧電壓：4.0 kⅤ；輔助氣溫度：180 ℃；輔助氣流量：15 L/min。29 種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 29種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)

1.3 樣品處理

取待測樣品粉末(過3#篩)3.00 g，加入1% (體積分數(shù))冰乙酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，渦旋混勻，以500次/min振蕩5 min，加入無水硫酸鎂和無水乙酸鈉材料包，搖散后以500 次/min 振蕩3 min，冰浴10 min，離心5 min 后取上清液9 mL，置于裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管中，渦旋混勻，以500次/min振蕩5 min，使凈化完全，離心5 min，精密吸取上清液5 mL，于40 ℃氮吹至0.4 mL，用乙腈稀釋至1.0 mL，過0.22 um濾膜，作為樣品溶液。

1.4 標準溶液配制

取29種農(nóng)藥標準溶液，用乙腈稀釋成各組分質(zhì)量濃度均為10 mg/L 的混合標準儲備液，置于4 ℃冰箱中儲存。取不含農(nóng)藥成分的中藥材樣品，同法處理的空白基質(zhì)溶液。取空白基質(zhì)溶液，將混合標準儲備液逐級稀釋成各組分質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、5、10、20、40、80、100、200 μg/L的系列混合標準工作溶液。

1.5 實驗方法

在1.2 儀器工作條件下，對29 種農(nóng)藥系列混合標準工作溶液分別進行測定，以保留時間和質(zhì)荷比定性；以目標化合物質(zhì)量濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。在相同條件下，測定樣品溶液，根據(jù)標準曲線得到樣品溶液中各個目標化合物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品凈化

藥食同源中藥材基質(zhì)較為復(fù)雜，為去除干擾物質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)，對樣品的凈化條件進行了試驗比較。分別使用C18固相萃取小柱、氨基固相萃取小柱及凈化柱對29 種農(nóng)藥進行凈化，結(jié)果顯示，使用凈化柱時樣品中各目標物的回收率最高，凈化效果最好，基質(zhì)效應(yīng)最低。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將29種農(nóng)藥分別用乙腈稀釋配制成1.0 μg/mL的標準溶液，用流動注射泵直接注入質(zhì)譜儀，根據(jù)各目標化合物分子的化學(xué)電離性質(zhì)，對各化合物的母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化。MS Scan 模式下對100 ng/mL 的克百威標準溶液進行一級全掃描，通過全掃描得到母離子為222.1，依據(jù)克百威的相對分子質(zhì)量，屬于[M+H]+峰。從二級質(zhì)譜圖中選擇特征碎片作為子離子，一般選擇調(diào)諧得到的兩個離子中響應(yīng)高的作為定量離子，另一個作為輔助定性離子，通過子離子掃描發(fā)現(xiàn)子離子m/z165.1 和子離子m/z123.1 具有較高的相對豐度。在MRM 模式下，對錐孔電壓和碰撞能量進行優(yōu)化微調(diào)，選擇離子對豐度達到最大值的點作為最佳錐孔電壓及碰撞能量。同理，調(diào)諧出其它28種農(nóng)藥的定量離子、定性離子及最佳碰撞能量，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表2。

2.3 色譜分離條件的優(yōu)化

流動相的組成和配比影響目標化合物的色譜行為及其離子化效率和檢測靈敏度[20]。比較了甲酸(0%、0.1%、0.2%)、甲酸銨(0、5、10 mmol/L)加入的情況及乙腈流動相的組成。結(jié)果表明，加入甲酸及甲酸銨后29 種農(nóng)藥的離子化效果更好，靈敏度更高，加大甲酸及甲酸銨濃度后靈敏度基本不變，但酸度越大越影響色譜柱使用壽命，因此確定乙腈-0.1%甲酸(含5 mmol/L甲酸銨)作為流動相。通過優(yōu)化梯度洗脫，更快更好地達到各目標物的分離。圖1 為29種農(nóng)藥的總離子流色譜圖。

2.4 線性范圍及檢出限

依次測定29種農(nóng)藥系列混合標準工作溶液，以各目標物質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算線性方程、相關(guān)系數(shù)。由最低檢測濃度的峰高為3倍噪聲峰高響應(yīng)量確定檢出限，3 倍檢出限確定定量限。29 種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度在0.5～200 μg/L范圍內(nèi)，線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限見表3。

表3 29種農(nóng)藥的線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 樣品加標回收試驗

選擇不含農(nóng)藥的靈芝樣品作為基質(zhì)空白樣品，將29 種農(nóng)藥分別以60、100、150 ng 3 個水平添加到樣品中，每個添加水平平行測定6次，考察目標物的回收率及方法的精密度，結(jié)果列于表4。由表4 可見，29種農(nóng)藥的加標回收率為79.5%～108.7%，相對標準偏差為3.05%～6.71%，表明該方法的精密度、準確度較高。

表4 樣品加標回收預(yù)精密度試驗結(jié)果(n=6)

空白樣品及加標樣品(加標量為100 ng)的總離子流色譜圖如圖2所示。

圖2 空白樣品及加標靈芝樣品的總離子流色譜圖

3 結(jié)語

采用固相萃取預(yù)處理技術(shù)，建立高效液相色譜-質(zhì)譜法對藥食同源樣品中的29 種農(nóng)藥殘留量進行快速定性、精準定量的檢測技術(shù)。通過對樣品提取、凈化等條件進行優(yōu)化，選擇合適的液相和質(zhì)譜條件對多組分農(nóng)藥殘留進行測定，實現(xiàn)了一次進樣可測定29種農(nóng)藥的檢測，為藥食同源中藥材中農(nóng)藥殘留狀況調(diào)查提供了數(shù)據(jù)支持。