王艷鑫，史建中，李茜，谷永發(fā)

（河北省張家口市疾病預(yù)防控制中心，河北張家口 075100）

目前全球有1 100 多種農(nóng)藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動中，包括有機(jī)磷類、有機(jī)氯類、擬除蟲菊酯類、殺菌劑類等眾多種類。大量農(nóng)藥的使用不僅會對身體健康造成影響，甚至?xí)＜吧踩玔1-4]，因此我國加大了對農(nóng)藥殘留的監(jiān)測力度，制定了嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)并不斷修訂完善。

農(nóng)藥殘留的檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[5-6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[11-13]等，其中氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有良好的選擇性和抗干擾性，廣泛應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)背景下的多組分農(nóng)藥殘留檢測。由于農(nóng)藥種類和樣品基質(zhì)的多樣性，傳統(tǒng)樣品處理方法一般需經(jīng)過提取、離心、活化固相萃取柱、上樣、淋洗、洗脫、濃縮等過程，步驟繁瑣，操作復(fù)雜步驟繁瑣，操作復(fù)雜，不利于檢測工作的開展。而分散固相萃取技術(shù)與傳統(tǒng)樣品處理方法相比，具有操作簡單，環(huán)境友好，快速、廉價等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。筆者以分散固相萃取技術(shù)結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，篩選了包含有機(jī)磷類、有機(jī)氯類、擬除蟲菊酯類及廣譜殺菌劑類的4 類農(nóng)藥，建立簡單、高效、快速、靈敏的多種類農(nóng)藥殘留的檢測方法，以期實(shí)現(xiàn)以一種方法同時檢測多種類農(nóng)藥，滿足大通量樣品的篩查和檢測的需求，為相關(guān)農(nóng)藥的檢測提供數(shù)據(jù)參考和依據(jù)。

1 實(shí)驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-TQ8050 型，配備電子轟擊離子(EⅠ)源，日本島津公司。

全自動平行濃縮儀：AUTO EⅤA-60 型，?？苾x器(廈門)有限公司。

電子天平：GL224Ⅰ-1SCN 型，感量為0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

正己烷、乙腈：色譜純，德國默克公司。

N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)：粒徑均為40 μm，日本島津公司。

NaCl、MgSO4：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

甲胺磷、乙酰甲胺磷、滅線磷、甲拌磷、五氯硝基苯、氧樂果、樂果、百菌清、毒死蜱、水胺硫磷、α-硫丹、腐霉利、β-硫丹、三唑磷、硫丹硫酸鹽、氯氟氰菊酯16種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

蔬菜樣品：市售。

1.2 實(shí)驗步驟

1.2.1 樣品預(yù)處理

取樣品可食用部分，粉碎、混勻，稱5.00 g (精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中，加入2 g NaCl，渦旋混勻，加入10 mL乙腈，振蕩提取30 min，加入6 g MgSO4，渦旋1 min，以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，加入200 mg PSA、200 mg C18和600 mg MgSO4，渦旋1 min，以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，于40 ℃氮吹至近干，用1.0 mL正己烷準(zhǔn)確定容，過0.22 μm濾膜，得樣品溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別吸取1.0 mL 質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的16種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL 容量瓶中，用正己烷準(zhǔn)確定容，配制成各農(nóng)藥質(zhì)量濃度均為4.0 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取空白樣品按照1.2.1處理，制得空白基質(zhì)提取液。用空白基質(zhì)提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 mg/L的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 定量方法

首先測定系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定樣品溶液，以目標(biāo)物色譜峰面積外標(biāo)法定量。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜儀

色譜柱：ⅤF-1701MS毛細(xì)管柱[30 m×0.25 mm，0.25 μm，安捷倫科技(上海)有限公司]；柱溫：初溫為80 ℃，保持1 min，然后以20 ℃/min 升至180 ℃，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：1 μL；柱流量：1.0 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜儀

離子源：EⅠ源；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：280 ℃；溶劑延遲：7 min；定量、定性離子信息及碰撞電壓見表1。

表1 監(jiān)測離子及質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取試劑的選擇

農(nóng)藥的提取試劑一般有乙酸乙酯、丙酮、乙腈等溶劑。乙酸乙酯提取易混入脂肪和色素，為后續(xù)的凈化過程帶來不利因素。丙酮提取，提取液顏色較深，且鹽析效果不佳，后續(xù)處理過程中水分不易去除，大量文獻(xiàn)[16-18]報道，乙腈是較為合適的提取試劑，提取效率和通用性都比較突出，因此采用乙腈作為提取試劑。

2.2 凈化材料的優(yōu)化

分散固相萃取常用的凈化材料有PSA、C18和石墨化炭黑(GCB)等。PSA 材料表面鍵合的氨基，對于樣品中的脂肪酸、碳水化合物、酚類及親脂性色素等極性雜質(zhì)具有良好的凈化作用；C18疏水性較強(qiáng)，對樣品中的色素和脂類等非極性雜質(zhì)有較好的凈化作用；GCB具有片層結(jié)構(gòu)，其表面具有六元環(huán)結(jié)構(gòu)，因此可有效吸附色素、維生素、甾醇等組分，但對一些具有平面及對稱結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥如百菌清等具有強(qiáng)烈的吸附作用，所以不能使用GCB，只可選擇PSA 以及C18作為凈化劑。

選擇葉用萵苣陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，以平均加標(biāo)回收率為指標(biāo)，添加水平為0.5 mg/kg，平行處理三份樣品。固定PSA 用量(50 mg)，改變C18用量(50、100、200、400 mg)，發(fā)現(xiàn)C18用量為200 mg時，各農(nóng)藥平均回收率在80%～110%之間的占比最高，為37.5%；然后固定C18用量為200 mg，改變PSA用量(50、100、200、400 mg)，16種目標(biāo)農(nóng)藥平均加標(biāo)回收率見圖1。結(jié)果表明，PSA 用量為100 mg 和200 mg時凈化效果均可接受，平均回收率在80%～110%占比分別為75%和87.5%，用量為200 mg時更佳。所以選擇PSA 用量200 mg，C18用量200 mg，MgSO4用量600 mg作為后續(xù)研究的凈化劑組合。

圖1 不同凈化組合樣品加標(biāo)回收率

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

比較基質(zhì)效應(yīng)一般有兩種方法，一種是標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值來判定基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱；另一種是目標(biāo)物響應(yīng)法，采用基質(zhì)配制的目標(biāo)物響應(yīng)值與純?nèi)軇┡渲频哪繕?biāo)物響應(yīng)值的比值判定基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱。比較兩種方法的差異，結(jié)果見圖2。在16種目標(biāo)物中，兩種方法只有乙酰甲胺磷和氧化樂果的結(jié)果稍有差異，這可能是由于樣品基質(zhì)對兩種農(nóng)藥不同濃度的影響有所不同而導(dǎo)致的，其余農(nóng)藥兩種方法比較所得結(jié)果差距不大。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法和目標(biāo)物響應(yīng)值法農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)

由于標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法參考了更多濃度點(diǎn)的基質(zhì)效應(yīng)，因此選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法來判定基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱，比值在0.8～1.2之間的認(rèn)為是弱基質(zhì)效應(yīng)，比值小于0.8 或者大于1.2 的認(rèn)為是強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。16種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值在0.72～1.79 之間，其中甲胺磷和氯氟氰菊酯表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，比值分別為0.98和0.72，其余農(nóng)藥均表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。乙酰甲胺磷、甲拌磷、氧化樂果、樂果、毒死蜱、水胺硫磷、腐霉利、β-硫丹、三唑磷、氯氟氰菊酯10 種農(nóng)藥表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，占比為62.5%，甲胺磷、滅線磷、五氯硝基苯、百菌清、α-硫丹、硫丹硫酸酯6種農(nóng)藥表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，占比為37.5%。由于強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)不可忽視，因此采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行定量計算。

2.4 色譜圖

以葉用萵苣陰性樣品為基質(zhì)，采集空白樣品、16種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)樣品色譜圖見圖3。從圖3 可以看出，各目標(biāo)組分分離較好，檢測時間較短，在25 min 內(nèi)即可完成所有組分的檢測，適合于大通量樣品的檢測分析。

圖3 空白樣品、16種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品色譜圖

2.5 線性方程和檢出限

采用葉用萵苣空白基質(zhì)提取液作為稀釋液，以目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)y，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，繪制16 種農(nóng)藥的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)曲線。以低濃度水平(0.02 mg/kg)添加空白樣品，經(jīng)全流程處理后上機(jī)檢測，以3倍信噪比估算方法檢出限，10倍信噪比估算方法定量限，結(jié)果見表2。16 種農(nóng)藥在0.02～0.50 mg/L 的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.995～0.999 8，方法檢出限在0.001～0.005 mg/kg之間。

表2 16種農(nóng)藥線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.6 樣品加標(biāo)回收試驗

以陰性葉用萵苣為樣品，添加三個加標(biāo)水平(0.05、0.10、0.20 mg/kg)，按照1.2.1進(jìn)行處理，每個水平進(jìn)行6 次平行實(shí)驗，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。16 種目標(biāo)化合物平均回收率為60.24%～108.75%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18%～8.57%，滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中的相關(guān)要求，表明該方法精密度好，可用于實(shí)際樣品中農(nóng)藥殘留的快速篩查和檢測。

表3 樣品加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)語

結(jié)合分散固相萃取技術(shù)，建立了同時檢測蔬菜中包含有機(jī)磷類、有機(jī)氯類、擬除蟲菊酯類及廣譜殺菌劑類等16種農(nóng)藥殘留的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法樣品處理過程簡便快捷，準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性良好，適用于多種類農(nóng)藥殘留的快速篩查和檢測，能滿足農(nóng)藥殘留日常風(fēng)險監(jiān)測的需求，為相關(guān)農(nóng)藥殘留的分析檢測提供了數(shù)據(jù)參考。